鄭麗萍,鄭彩燕

(1.福建省兒童醫(yī)院藥劑科,福建 福州 350014;2.福建省立醫(yī)院藥劑科,福建 福州 350013)

在過去的幾十年里，癌癥的治療方法取得了很大的進步。然而，據(jù)報道單就美國2022年將有191萬余例各類癌癥新發(fā)病例和60.9萬余例死亡病例[1]。其中，皮膚黑色素瘤將導致99 780例新發(fā)病例和7 650例死亡病例。盡管在癌癥治療方面取得了很大進展，但是由于轉移灶通常對手術治療、放化療以及其他治療方式具有抗性，導致腫瘤轉移成為實體惡性腫瘤患者死亡的首要原因[2]。就黑色素瘤而言，它可以從局部皮膚疾病迅速發(fā)展為區(qū)域淋巴結轉移以及更嚴重的內臟轉移。據(jù)報道，如果黑色素瘤患者在腫瘤發(fā)生轉移之前就被診斷出來，這些病例的5年生存率可達99%。然而，與之形成鮮明對比的是，一旦發(fā)生了轉移，這些患者的5年生存率急劇下降到只有12%～15%[3]。血源性轉移是腫瘤轉移的主要方式，主要包括腫瘤在原發(fā)部位生長、血管化、侵入血管、循環(huán)、附著于毛細血管床、外滲和遠端生長等復雜的連續(xù)步驟組成的轉移級聯(lián)[4]。

雖然腫瘤的轉移是可怕的，但從另一方面來看，腫瘤轉移的效率也是很低的。具體來說，在腫瘤轉移過程中，數(shù)以百萬計的腫瘤細胞逃離原發(fā)腫瘤進入循環(huán)系統(tǒng)，但由此形成的轉移灶數(shù)量遠少于彌散的腫瘤細胞[5]。不僅如此，研究顯示腫瘤患者外周血中能夠檢測的循環(huán)腫瘤細胞極其罕見[6]。也有證據(jù)表明，腫瘤的生長、繁殖和轉移僅依賴于腫瘤實體中的一小部分細胞。這一概念最初是基于這一現(xiàn)象得出的，即在體內外實驗中測定多種類型的腫瘤細胞的增殖潛力時，只有少數(shù)細胞顯示出突出的增殖能力[7]。也有研究把上述的細胞子集認定為腫瘤干細胞[8]。

同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)是一種可靠的蛋白質組學定量技術，近年來引起了人們的極大關注。在癌癥研究中，iTRAQ是一種廣泛應用的技術，常用于篩選疾病進展和化療反應的生物標志物。通過運用iTRAQ蛋白質組學技術，Liu等人發(fā)現(xiàn)了一組新的胰腺癌生物標志物，包括載脂蛋白E (APOE)、α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H3(ITIH3)、載脂蛋白A1(APOA1)、載脂蛋白L1(APOL1)。這與單獨使用CA19-9作為標志物相比，顯著提高了胰腺癌診斷的敏感性和特異性[9]。Zhao等人通過蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇敏感的PC3細胞和多西紫杉醇耐藥的PC3-Rx細胞之間的蛋白質組學間也存在差異，并在臨床患者中驗證了這種顯著變化[10]。

本研究利用腫瘤轉移動物模型，在親本鼠源黑色素瘤細胞株(B16F10)的基礎上，建立了肺轉移性黑色素瘤細胞株(B16F10M)，并利用iTRAQ蛋白質組學技術，發(fā)現(xiàn)與親本黑色素瘤細胞相比，轉移性黑色素瘤細胞發(fā)生了代謝重組。具體來說，轉移性黑色素瘤細胞的糖酵解水平發(fā)生了下調。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1 材料與方法

1.1試劑和耗材：Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(萬類生物)、RT-qPCR引物(生工生物科技)、三氟乙酸、碘乙酰胺和二硫蘇糖醇(Sigma Aldrich)、iTRAQ試劑盒(AB Sciex)、測序級改良胰蛋白酶(Promega)。

1.2細胞：鼠源B16F10黑色素瘤細胞株和人黑色素瘤細胞株A375購自中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。將eGFP-N1質粒轉染B16F10細胞，獲得帶綠色熒光標記的B16F10-GFP細胞。分別從C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠肺轉移瘤中分離出其子代B16F10M-GFP和A375M細胞株。主要過程包括：將親代細胞靜脈注射到小鼠體內，1個月后剝離肺轉移灶。使用胰蛋白酶(0.1%)和膠原酶Ⅰ(0.1%)混合酶解組織片段。最后，細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B16F10、B16F10M、A375和A375M黑色素瘤細胞均培養(yǎng)于含10% (v/v)胎牛血清(Gembio)、1%青霉素/鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)中，培養(yǎng)箱濕度控制為37℃，CO2濃度控制為5%。

1.3ATP含量檢測:本研究采用ATP檢測試劑盒測定ATP含量。簡單來說，在細胞懸液中加入100 μl ATP檢測試劑，充分混勻3 min，隨后轉移到96孔板上，黑暗中靜置10 min。最后，使用酶標儀檢測熒光強度。根據(jù)相對熒光強度(熒光/細胞數(shù))來定量ATP含量。

1.4iTRAQ:本研究采用蛋白質組學iTRAQ技術研究B16F10細胞和B16F10M細胞的蛋白表達差異，蛋白提取、質譜、蛋白解析、數(shù)據(jù)分析外送杭州景杰科技生物有限公司開展。

1.5生物信息學分析:本研究分別檢測3個B16F10和B16F10M細胞樣本，對3個重復樣本質譜數(shù)據(jù)的平均值進行進一步分析。如果B16F10M與B16F10的絕對平均比率>1.5或<0.67，且P<0.05，則將該蛋白視為差異表達蛋白。 利用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對蛋白質注釋、功能分類、功能富集和聚類分析進行生物信息學分析。利用在線STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件生成蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡，富集PPI子網(wǎng)絡。

1.6RT-qPCR:使用TRIzol試劑盒提取RNA，將收集到的RNA用15～20 μl DEPC水溶解后，使用Q5000超微量紫外可見分光光度儀測定其濃度和純度。使用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，反轉錄結束后使用紫外可見分光光度儀測定cDNA濃度。使用SYBR?Premix Ex TaqTM PCR Kit試劑盒進行實時定量PCR反應，反應結束后，使用SDS-PAGE電泳驗證擴增的產(chǎn)物是否與理論的擴增產(chǎn)物一致。最后，通過2-ΔΔCt法計算各基因相對于內參基因(ACTB)的表達量。

1.7凋亡檢測:本研究采用流式細胞術分析細胞凋亡情況。簡要如下：將腫瘤細胞以3×105個/孔培養(yǎng)于6孔板中，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天，后置于氧氣濃度為1%的低氧工作站36 h，收集上清和細胞，離心、洗滌、重懸。使用5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI混合染色，4℃避光孵育15 min后，使用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.8動物實驗:動物實驗按照國家自然科學基金委關于實驗動物關愛使用的相關規(guī)定進行操作。對所有動物進行異常行為監(jiān)測，以減少動物的疼痛和痛苦。如果發(fā)現(xiàn)動物健康狀況嚴重惡化，則對動物實施安樂死。

2 結果

2.1B16F10M的構建:基于B16F10，成功構建了B16F10M。見圖1。圖1中箭頭所示的黑色結節(jié)就是親代B16F10在小鼠肺部形成的轉移灶。通過體外細胞培養(yǎng)和熒光顯微拍照證實了圖示的黑色結節(jié)起源于親本B16F10細胞，而不是來自宿主小鼠。

圖1 B16F10M細胞株的構建

2.2B16F10M糖酵解相關蛋白表達水平的下調:通過運用iTRAQ蛋白質組學技術，對親本B16F10細胞和肺轉移B16F10M細胞純化的蛋白提取物進行分析，揭示兩個細胞株蛋白表達譜的差異。通過對蛋白質組學結果的分析，共鑒定出了3 348個蛋白，并對其中的2 467個蛋白進行了定量分析。 通過將兩株細胞中蛋白質表達水平差異高于1.5倍或者低于0.67倍的蛋白視為差異表達蛋白(B16F10M/B16F10，P<0.05)，發(fā)現(xiàn)相比于B16F10細胞，有 147個蛋白在B16F10M細胞中呈現(xiàn)出表達上調，175個蛋白呈現(xiàn)出表達下調。

將蛋白質組學鑒定出的差異表達蛋白從生物過程、細胞成分、分子功能三個方面進行聚類分析。見圖2。從分子功能層面，發(fā)現(xiàn)在上調表達的蛋白中，52%的蛋白為連接蛋白，25%的蛋白具有催化活性；在下調表達的蛋白中，這兩種蛋白的比率分別為48%和37%。

圖2 差異表達蛋白的GO分類分析

對差異表達蛋白進行KEGG富集分析，結果見表1。共富集出24個通路(P<0.05)，主要包括補體系統(tǒng)和凝血級聯(lián)、碳代謝、磷酸戊糖途徑和糖酵解/糖異生代謝通路等。

表1 差異表達蛋白的細胞信號通路分析

通過利用在線數(shù)據(jù)庫STRING和Cytoscape軟件，分析這些差異表達蛋白的蛋白-蛋白相互作用(PPI)。得到了與前面相似的結果，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白中最顯著變化的5個信號通路是糖酵解/糖異生、抗生素的生物合成、碳代謝、氨基酸的生物合成和代謝通路。這兩種方法均表明糖酵解/糖異生代謝途徑在腫瘤轉移過程中發(fā)生了顯著的下調。對兩個細胞株細胞內ATP產(chǎn)量進行檢測，也發(fā)現(xiàn)B16F10M細胞胞內ATP產(chǎn)量低于B16F10細胞，驗證了兩株細胞代謝上的差異。見圖3。進一步研究發(fā)現(xiàn)涉及糖酵解/糖異生相關蛋白包括PKM、ALDOA、LDHB、TPI1、LDHA、人肝臟磷酸果糖激酶(PFKL)、PGAM1、肌肉磷酸果糖激酶(PFKM)、PGK1、GPI1和ENO1。見圖3。

圖3 B16F10M細胞糖酵解水平下調

2.3RT-qPCR驗證蛋白質組學結果:通過前面對差異表達蛋白進行分析，許多下調表達的蛋白參與了糖酵解/糖異生過程。為了驗證這一結果，本研究通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)對這一結果進行驗證，除LDHA外，其他基因的轉錄水平均有不同程度的下調。因此，RT-qPCR結果與iTRAQ數(shù)據(jù)基本一致，從而驗證了iTRAQ的結果。通過使用RT-qPCR對人源黑色素瘤細胞A375M與親本A375細胞ALDOA基因的轉錄水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)ALDOA在人源性黑色素瘤肺轉移細胞A375M中也呈下調表達。見圖4。這一結果在一定程度表明糖酵解信號通路下調在轉移性黑色素瘤中是一個普遍現(xiàn)象。

圖4 RT-qPCR驗證B16F10M細胞糖酵解相關基因轉錄水平降低

2.4與親本B16F10細胞相比，B16F10M細胞缺氧耐受能力較弱:根據(jù)上述研究，糖酵解/糖異生相關蛋白在轉移瘤細胞中呈現(xiàn)下調表達，本研究進一步檢測了B16F10細胞和B16F10M細胞的缺氧耐受性。經(jīng)過低氧環(huán)境培養(yǎng)，B16F10M細胞的凋亡細胞比例高于B16F10細胞，其中B16F10M凋亡細胞比率為41.1%，B16F10凋亡細胞比率為27.3%。據(jù)此得出B16F10M細胞對缺氧的敏感性高于親本B16F10細胞。見圖5。

圖5 B16F10細胞具有比B16F10M細胞更強的低氧耐受能力

3 討論

癌癥患者死亡的主要原因是轉移引起的并發(fā)癥。因此，針對轉移性疾病的有效治療將提高癌癥患者的死亡率。大量研究揭示了某些致癌基因參與癌變的過程，如致癌基因Ras的發(fā)現(xiàn)。但這些研究多集中在腫瘤發(fā)生方面，其研究對象通常為正常細胞和癌細胞。就目前而言，癌癥的發(fā)生是不可預測的，也就是說，不知道人體體內正常的細胞會在何時何地發(fā)生癌變。相反，腫瘤在轉移之前可能潛伏數(shù)月至數(shù)年，因此預防腫瘤的轉移相對更容易實現(xiàn)[11]。更重要的是，腫瘤切除患者逐漸增多，這些患者每時每刻都面臨著腫瘤轉移的風險。大量研究報道，大部分腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落進入循環(huán)系統(tǒng)后被快速消除，其余存活的細胞就成了腫瘤轉移的根源。考慮到腫瘤的異質性和腫瘤轉移不是由癌細胞擴散引起的偶然事件的觀點，本研究假設轉移過程中存活的細胞在某些特質上一定不同于死亡的細胞。因此，本研究以小鼠黑色素瘤B16F10細胞株為基礎，通過腫瘤轉移動物模型構建了肺轉移B16F10M細胞株。在之前的研究中，B16F10M細胞展現(xiàn)出比親本B16F10細胞更高的轉移能力[12]。因此，找出潛在的機制顯得尤為重要。

定量蛋白質組學技術已經(jīng)成為癌癥研究的有力工具，為研發(fā)靶向藥物提供了一個獨特的途徑來發(fā)掘關鍵的生物標志物。本研究運用一種廣泛使用的定量蛋白質組學技術iTRAQ，來檢測和定量B16F10細胞與存活的B16F10M細胞之間的蛋白表達差異。定量蛋白質組學分析鑒定出322個差異表達蛋白，其中上調表達蛋白147個，下調表達蛋白175個。通過GO分析和KEGG通路分析，確定了這些差異表達蛋白潛在的功能分類：共涉及24條信號通路，包括補體和凝血級聯(lián)、碳代謝、戊糖磷酸途徑、糖酵解/糖異生代謝途徑等。本文還利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscapae軟件分析了這些差異表達蛋白中的PPI。值得關注的是，這兩種方法都揭示了糖酵解/糖異生代謝途徑是在腫瘤轉移過程中發(fā)生了顯著下調。后續(xù)的RT-qPCR結果支持了這一結論。

根據(jù)“瓦伯格效應”理論，癌細胞即使在氧氣充足的情況下，也傾向于依賴糖酵解代謝進行能量供給，而不是高效的線粒體氧化磷酸化[13]。不僅如此，糖酵解似乎有利于癌癥的轉移。據(jù)報道，小鼠實驗證實抑制高轉移性細胞的糖酵解顯著降低其轉移能力[14]。也有研究顯示，敲除LDHA可下調TGF-β2和MMP-2的表達，減弱腦膠質瘤的轉移[15]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，與親本細胞相比，轉移性黑色素瘤細胞的糖酵解水平較低。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于不同腫瘤類型間的異質性造成的。在缺氧耐受實驗中，B16F10M細胞比親本B16F10細胞對缺氧更敏感。由此得出B16F10M細胞比B16F10細胞更依賴線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)，而非糖酵解。根據(jù)以往的研究，腫瘤干細胞更依賴于線粒體氧化磷酸化而非糖酵解來進行能量供給[16]。綜上所述，腫瘤干細胞轉化可以在一定程度上解釋腫瘤細胞在轉移過程中發(fā)生的代謝重編程，或者說代謝重編程可能是腫瘤干細胞轉化的動力，其內在機制有待進一步研究。