董 琨，宮曉平，李曉東，郭彥麗

[1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北 張家口 075000；2.島津企業(yè)管理（中國有限公司）創(chuàng)新中心，北京 100020]

0 引言

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，在全球發(fā)病率有逐年增高的趨勢，現(xiàn)已被列為繼心血管及腫瘤疾病之后的第三大疾病[1]。高血糖是由胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或者兩者兼有引起的。長期存在高血糖會導(dǎo)致各種組織特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害及功能障礙。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，而“綠色食品”理念的提倡和發(fā)展，讓人們開始越來越重視身體健康和飲食安全，一些調(diào)節(jié)血糖平衡的中成藥和保健品變得日益暢銷。一些不法商販為了提高服用效果和銷售口碑，在中成藥和保健品中非法添加了具有降糖或輔助降糖效果的化學(xué)藥，其成分往往是格列本脲、格列美脲、格列齊特等需要在醫(yī)生的嚴(yán)格指導(dǎo)下才能服用的處方藥[2-4]。這種做法不光對消費者的身體造成損害，也嚴(yán)重危害了用藥的安全性[5]。消費者如果服用這類的中成藥和保健品，不僅會浪費大量資金，還會造成病情延誤，引發(fā)糖尿病的并發(fā)癥，甚至有可能會因為過量服用有非法添加物的降糖藥而導(dǎo)致患者血糖過低，從而引發(fā)昏迷，甚至危及患者的生命安全[6-7]。近年來，檢測降糖藥物中非法添加物的方法主要為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]，但該方法在實際工作中存在諸多問題，如流動相配制過程復(fù)雜，樣品處理過程需要使用大量的有機溶劑，試驗周期偏長，實驗人員接觸了大量有機溶劑的同時也造成了環(huán)境污染。

針對以上問題，本研究采用在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。超臨界流體是指溫度和壓力（壓強）均處于臨界點以上時的物質(zhì)狀態(tài)，它具有與液體相比，黏度小、擴散系數(shù)大，與氣體相比，溶解度較大的特點。超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）是使用超臨界二氧化碳（溫度和壓力均處于臨界點以上時的二氧化碳）作為萃取溶劑的一種新型萃取分離技術(shù)。因為二氧化碳是非極性分子，所以與正己烷等有機溶劑相同，可溶解疏水性化合物，并且可以通過調(diào)整壓力，使密度發(fā)生變化，從而改變?nèi)軇┑娜芙舛龋谳腿r使用甲醇等有機溶劑作為改性劑，將可以改變極性，因此二氧化碳廣泛適用于各種化合物的萃取。超臨界流體色譜法（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）是使用超臨界二氧化碳作為流動相的一種色譜分離方法。SFC流動相的黏度小，與高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）相比，即使在流速較大時加長色譜柱，壓力上升幅度仍然較小，可以實現(xiàn)超快速和高分離分析；在添加甲醇等具有極性的有機溶劑后，可改變流動相的極性；因為正向分析及反向分析僅取決于色譜柱的修飾基團，所以不必更換流動相，可使用一個系統(tǒng)對應(yīng)兩種分析，簡單快捷。

本研究依據(jù)超臨界流體萃取與超臨界流體色譜的特點，開發(fā)出中成藥及保健品中非法添加5種降糖類化學(xué)藥的在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的快速篩查方法。與傳統(tǒng)檢驗方法相比，本方法可在一次作業(yè)中同時進(jìn)行萃取和分離，減少預(yù)處理的作業(yè)量，樣品僅需簡單粉碎就可以直接上機，利用超臨界色譜分離和質(zhì)譜檢測，即可達(dá)到快速篩查的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

本研究使用島津Nexera UC型在線超臨界流體萃取/超臨界流體色譜系統(tǒng)串聯(lián)島津8060型串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Shim-pack UC-X RP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm；P/N：227-30501-01；S/N：16L04359）；CPA225D型十萬分之一精密電子天平（德國賽多利斯集團）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

本研究使用格列吡嗪（批號：100281-201905；含量：99.9%），格列本脲（批號：100135-201806；含量：99.5%），格列美脲（批號：100674-201904；含量：99.7%），格列喹酮（批號：100280-201403；含量：99.5%），鹽酸羅格列酮（批號：100673-201902；含量：93.3%）（均購自中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific試劑公司）；超臨界流體萃取專用濾紙片（Miyazaki Hydro-Protect，批號51105577）（SHIMADZU日本島津公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

分別精密稱取“1.2”項下格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、鹽酸羅格列酮對照品10 mg至100 mL容量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度制成每1 mL含約 0.1 mg 的對照品儲備液。

2.2 萃取條件

萃取劑：A為超臨界二氧化碳，B為含0.1%甲酸的甲醇；萃取劑比例：（92∶8，V/V）；萃取流速：3 mL·min-1，萃取時背壓A為14.8 MPa，背壓B為15 MPa；萃取溫度：40 ℃，采取先靜態(tài)萃取4 min，再動態(tài)萃取3 min的方式進(jìn)行萃取。

2.3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack UC-X RP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm；P/N：227-30501-01；S/N：16L04359）。流動相：A為超臨界二氧化碳，B為含0.1%甲酸的甲醇， 采 用8%B（7～7.5 min）-30%B（11～14 min）-8%B（14.1～17 min）梯度洗脫程序；流速：2 mL·min-1；柱溫：40 ℃，洗脫時背壓A為15 MPa，背壓B為40 MPa。

質(zhì)譜補償液：含0.1%甲酸的甲醇；補償液流速：0.1 mL·min-1。

2.4 質(zhì)譜條件

正離子檢測模式；離子源：ESI源；離子源溫度：350 ℃；脫溶劑管溫度：200 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣流量：3 L·min-1；加熱氣流量：10 L·min-1；干燥氣流量：10 L·min-1；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.5 對照品及供試品的制備

（1）對照品混合儲備液的制備。分別精密量取“2.1.1”項下格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、鹽酸羅格列酮對照品儲備液各0.1 mL至同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度均為0.1 μg·mL-1的對照品混合儲備液。

（2）供試品超臨界提取流程。選取不含上述5種降糖類化學(xué)藥的中成藥，精密稱取0.3 g，放入5 mL規(guī)格超臨界萃取裝置的萃取罐中，以超臨界狀態(tài)的二氧化碳為提取溶劑，加入體積分?jǐn)?shù)為8%甲醇（含0.1%甲酸）為夾帶劑，按照“2.1”項下的超臨界萃取條件進(jìn)行提取，即得。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲 線的制備

精密吸取“2.4.1”對照品混合儲備液0 μL、15 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、800 μL、1 000 μL，用甲醇稀釋至1.0 mL，搖勻，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（0 ng·mL-1、1.5 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1） 。以空白濾紙片為基質(zhì)，分別精密吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液100 μL于基質(zhì)表面，按照本試驗選取的在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件進(jìn)行測定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（見表2）。測定結(jié)果可見，該方法在試驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各組分線性關(guān)系測定結(jié)果

2.7 重復(fù)性實驗

本研究以超臨界專用空白濾紙片為基質(zhì)，放入5 mL規(guī)格超臨界萃取裝置的萃取罐中，分別精密吸取“2.5”項下的20 ng·mL-1對照品混合溶液100 μL于基質(zhì)表面，平行測定6次，按照本試驗選取的在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件進(jìn)行含量測定，計算。結(jié)果格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、鹽酸羅格列酮的質(zhì)量分別為1.989 ng、1.950 ng、1.956 ng、1.953 ng、1.969 ng，RSD分別為0.13%、0.13%、0.13%、0.14%、0.14%。

2.8 加樣回收率實驗

本研究分別以不含上述5種降糖類化學(xué)藥的中成藥為空白基質(zhì)，每份稱取0.3 g，放入5 mL規(guī)格超臨界萃取罐中，共18份，分別精密吸取“2.5”項下的濃度為1.5 ng/mL 、5 ng/mL 、20 ng/mL的對照品溶液100 μL于空白基質(zhì)表面，混勻，按照本試驗選取的在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件測定含量，計算平均加樣回收率。結(jié)果中成藥中格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、鹽酸羅格列酮的平均加樣回收率范圍分別為94.8%～97.5%、94.2%～96.3%、95.0%～96.3%、94.6%～96.4%、94.5%～98.0%，RSD范圍分別為 6.4%～7.3%、6.4%～7.1%、6.2%～7.0%、6.7%～7.6%、6.2%～8.4%?；厥章蕼y定結(jié)果見表3，SFE-SFC-MS/MS Online測定圖如圖1所示。

圖1 5種降糖類化學(xué)藥的回收率SFE-SFC-MS/MS質(zhì)譜圖

表3 回收率測定結(jié)果 n=6

2.9 最低檢測濃度

按“2.7”項下方法，用甲醇不斷稀釋對照品混合溶液，取稀釋后的對照品溶液100 μL于不含上述5種降糖類化學(xué)藥的中成藥空白基質(zhì)表面，混勻，按照本試驗選取的在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件測定，記錄峰面積，在信噪比S/N約為10時測得最低檢測濃度為0.5 ng·g-1。

2.10 實際樣品分析

本研究應(yīng)用該方法對22份正規(guī)藥店銷售的降糖類中成藥和保健品樣品（包括16份中成藥和6份保健品），進(jìn)行了格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、鹽酸羅格列酮5種降糖類化學(xué)藥的在線分析，均未檢出上述降糖物質(zhì)。結(jié)果證明，經(jīng)過市場監(jiān)管局加大對市場抽檢及風(fēng)險評估等監(jiān)管活動的力度，正規(guī)藥店市售的降糖類中成藥和保健品安全性顯著提高，廣大糖尿病患者的飲食用藥安全得到較好的保障。

3 優(yōu)化及結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用超臨界二氧化碳-含0.1%甲酸的甲醇為流動相，優(yōu)化比較改性劑為甲醇和乙腈，兩者的分離效果無明顯差異，因而采用甲醇為改性劑。本研究進(jìn)一步比較甲醇和含0.1%甲酸的甲醇，加入0.1%甲酸后的甲醇能夠顯著增強化合物的相應(yīng)，故選擇含0.1%甲酸的甲醇作為最終改性劑。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在超臨界二氧化碳-含0.1%甲酸的甲醇的梯度洗脫條件中，5種非法添加化學(xué)藥采用正離子模式可以獲得較好的靈敏度和穩(wěn)定性，可在相應(yīng)模式下對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化加熱氣流量、干燥氣流量、加熱模塊溫度、離子源溫度、脫溶劑管溫度等參數(shù)，選擇靈敏度高、重現(xiàn)性好的離子作為定量離子，其余的選作定性離子。

3.3 結(jié)論

在降壓類中成藥及保健品等制劑中非法添加化學(xué)藥物的行為，已經(jīng)成為不法分子通過制售假藥謀取暴利的重要手段，這一現(xiàn)象也已得到相關(guān)部門的高度重視，然而功能性的中成藥和保健品種類繁多，化學(xué)成分復(fù)雜，加上不法商販的制假行為層出不窮，有些違法生產(chǎn)廠家為躲避監(jiān)管，常降低單一藥物投入量，采取同一種類多種藥物或多種類藥物混合添加的形式達(dá)到宣稱的目的[10]。針對這一問題，現(xiàn)在雖然已有一些檢測手段，但是普遍存在前處理復(fù)雜、檢驗周期長的問題，不適于批量快篩，補充開發(fā)新的快速檢測方法和手段已刻不容緩。本研究開發(fā)的在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，與現(xiàn)行檢驗方法相比，樣品只需經(jīng)過簡單處理即可上機檢測，簡化了提取過程，實驗過程快速、環(huán)保、靈敏度較高，可快速篩查降糖類中藥及保健品中非法添加5種化學(xué)藥。