劉思源，何辰慶，陳軍軍，葉幼榮，張 健，商 鵬*，強(qiáng)巴央宗

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000）

生豬養(yǎng)殖在我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)中長(zhǎng)久以來(lái)都占據(jù)著重要位置。而生長(zhǎng)性狀是生豬養(yǎng)殖行業(yè)中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，由多種因素共同調(diào)控。隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖的發(fā)展和我國(guó)科研水平的提升，將遺傳性狀的分子調(diào)控機(jī)制研究與現(xiàn)代育種相結(jié)合，已成為種業(yè)提升大背景下的重要技術(shù)手段[1-2]。藏豬長(zhǎng)期生活于我國(guó)青藏高原地區(qū)，是典型的高原小型豬種，常被作為試驗(yàn)材料應(yīng)用于豬生長(zhǎng)性狀的研究中[3]。由于藏豬抗逆性強(qiáng)、沉脂力高、生長(zhǎng)緩慢、出欄周期較長(zhǎng)，無(wú)法滿足商業(yè)需求。所以，通過(guò)分子技術(shù)手段，對(duì)影響基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)程的起始密碼子上游3 kb 區(qū)域（含基因啟動(dòng)子區(qū)和5'UTR 區(qū)）進(jìn)行挖掘，探究基因表達(dá)模式，有利于提高藏豬生長(zhǎng)性能，能夠從一定程度上推進(jìn)藏豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-5]。

CXC 基序趨化因子配體10（CXCL10）屬于趨化因子CXC 家族，定位于豬第8 號(hào)染色體上，包含3 個(gè)內(nèi)含子、4 個(gè)外顯子，主要由成纖維細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[6-7]，被視作多功能的分泌因子。最新研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10基因是一種新的肌肉生長(zhǎng)因子，能夠參與多種生物學(xué)進(jìn)程，如控制胰島素分泌，抑制肌細(xì)胞增長(zhǎng)和肌內(nèi)血管生成，是肌肉代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)和樞紐基因，與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[8-10]。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)藏豬、大約克夏豬背最長(zhǎng)肌組織RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10基因富集于肌肉生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制相關(guān)通路上，是參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵功能候選基因[11]。

本研究將地方重要品種資源藏豬和引進(jìn)豬種大約克夏豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用一代測(cè)序Sanger 法對(duì)CXCL10起始密碼子上游3 kb 區(qū)域進(jìn)行SNP 篩選，通過(guò)RT-qPCR 技術(shù)對(duì)2 個(gè)豬種的不同組織（背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟）進(jìn)行mRNA 水平檢測(cè)，從而探究CXCL10基因在豬生長(zhǎng)發(fā)育性狀中發(fā)揮的作用，為藏豬這一地方品種的種質(zhì)資源保護(hù)及品種改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究選取藏豬（TP）和大約克夏豬（YY）為研究對(duì)象，藏豬來(lái)自西藏農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)牧場(chǎng)，大約克夏豬來(lái)自林芝市宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。采集藏豬（TP，n=46）和大約克夏豬（YY，n=57）的耳組織用于提取DNA。隨機(jī)選取飼養(yǎng)模式相同的健康去勢(shì)公豬藏豬和大約克夏豬各10 頭，飼養(yǎng)至180 日齡進(jìn)行屠宰，采集背最長(zhǎng)肌、腿肌和肝臟組織，置于液氮中冷凍保存，用于RNA 提取。

1.2 DNA、RNA 的提取及cDNA 制備 使用苯酚-氯仿法從豬耳組織中提取基因組DNA，-20℃凍存[12]。根據(jù)北京天根生化科技有限公司總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（DP171221），北京天根快速反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)（KR180123），提取總RNA 并合成cDNA，置-20℃保存。

1.3 SNPs 篩選及基因分型引物設(shè)計(jì) 登錄GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載豬CXCL10基因DNA 序列（登錄號(hào)：NC_010446.5），采用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增起始密碼子上游3 kb 區(qū)域，特異性檢驗(yàn)后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。引物信息見(jiàn)表1。

表1 CXCL10 基因5'UTR 引物信息

1.4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè) 從Gene Bank 下載CXCL10基因組序列，使用在線網(wǎng)站CONSITE（http://jaspar.binf.ku.dk/）預(yù)測(cè)SNP 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì) NCBI 官網(wǎng)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載基因的mRNA 序列，選取CXCL10（登錄號(hào)：NM_001008691）為目的基因，選取GAPDH（登陸號(hào)：NM_001206359.1）作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4℃保存。引物信息見(jiàn)表2。

表2 CXCL10 基因和GAPDH 基因定量引物信息

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA 為模板，選用GAPDH為內(nèi)參基因，藏豬和大約克夏豬待測(cè)樣品每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增體系（總體積為20 μL）：上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板0.8 μL，RNase-free ddH2O 8.2 μL。利 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏，Light Cycler96）進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增程序?yàn)槿椒ǎ?5℃預(yù)變性900 s；95℃變性30 s，57℃退火20 s，72℃延伸30 s，65℃再延伸60 s。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用DNAMAN 6.0 和Chromas Pro 2.1.3 軟件分析個(gè)體測(cè)序結(jié)果，對(duì)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行篩選。利用SPSS 18.0 軟件χ2檢驗(yàn)分析各突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率差異，對(duì)CXCL10基因表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。對(duì)RT-qPCR 結(jié)果，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算CXCL10基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。使用Excel 進(jìn)行整理，并使用Sigma Plot 10.0 制圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

樣品目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算：

ΔCt（樣品）=Ct（樣品目的基因）-Ct（樣品內(nèi)參基因）

ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)樣）=Ct（標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因）-Ct（標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因）

ΔΔCt=ΔCt（樣品）-ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)樣）

目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCt

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測(cè)CXCL10基因以DNA 為模板的普通PCR 產(chǎn)物可見(jiàn)清晰的1 095 bp 條帶（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好，滿足下一步實(shí)驗(yàn)需求。

圖1 CXCL10 基因普通PCR 產(chǎn)物

2.2 SNPs 篩選與功能預(yù)測(cè) 測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 存在3 個(gè)SNP 位點(diǎn)，分別記為：T-832G、A-808G、T-694C。測(cè)序峰圖如圖2 所示。運(yùn)用Excel 10.0 計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，經(jīng)卡方檢驗(yàn)顯示這3 個(gè)突變位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律，藏豬與大約克夏豬基因頻率存在極顯著差異?；蛐皖l率和基因頻率見(jiàn)表3。

表3 CXCL10 基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率

圖2 CXCL10 基因突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖

通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn)堿基突變前后CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 2 個(gè)SNP 位點(diǎn)（T-832G、A-808G）突變后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失，T-832G 處突變導(dǎo)致ARGFX、ARID3B 結(jié)合位點(diǎn)消失，A-808G 突變導(dǎo)致ARID3A 結(jié)合位點(diǎn)消失。

2.3 總RNA 提取 藏豬和大約克夏豬各組織RNA 提取結(jié)果見(jiàn)圖3。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示18S 和28S 條帶清晰，無(wú)DNA 污染和降解現(xiàn)象。使用Nano Drop 2000檢測(cè)RNA 質(zhì)量，260/280 和260/230 值均在2.0 左右，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 RNA 提取結(jié)果

2.4CXCL10基因mRNA 表達(dá) 利用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)CXCL10基因在藏豬和大約克夏豬背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示，背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟這3 個(gè)組織中CXCL10基因表達(dá)量均為藏豬極顯著高于大約克夏豬。

圖4 CXCL10 基因在TP、YY 2 個(gè)品種豬背最長(zhǎng)肌、腿肌和肝臟中mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

據(jù)Pan 等[13]研究，CXCL10基因是肌肉發(fā)育調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的樞紐，而存在基因點(diǎn)突變可能會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的改變影響基因功能和轉(zhuǎn)錄效率。本研究在CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)SNP 位點(diǎn)（T-832G、A-808G 和T-694C），且經(jīng)卡方檢驗(yàn)顯示藏豬和大約克夏豬基因頻率間存在極顯著差異（P＜0.01）。其中T-832G、A-808G 位點(diǎn)與地方豬種民豬中的發(fā)現(xiàn)一致，暗示該位點(diǎn)可能導(dǎo)致豬瘦肉率低、生長(zhǎng)速度慢等[14]。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，T-832G 和A-808G 位點(diǎn)堿基突變前后ARID3A、ARID3B、ARGFX 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失，其中結(jié)合位點(diǎn)ARGFX 是同源框超家族的中心成員，控制細(xì)胞分化和胚胎致密化，主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控[15-16]；ARID3A/B 屬于ARID（富含AT 的相互作用域）轉(zhuǎn)錄因子的亞家族成員，同樣參與細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育，且通過(guò)REKLES 域結(jié)合，共同促進(jìn)細(xì)胞增殖并顯著提高細(xì)胞存活水平[17-19]。由此推測(cè)，隨著ARID3A、ARID3B、ARGFX 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的消失，可能導(dǎo)致CXCL10基因功能轉(zhuǎn)變，從而影響肌肉細(xì)胞的增殖分化。

根 據(jù)Guiraud[21]、Hathout[21]、Alayi 等[22]研究，CXCL10基因通過(guò)與G 蛋白偶聯(lián)受體和整合素相互作用來(lái)發(fā)揮其生物活性，并在高濃度血糖、脂肪酸水平下增強(qiáng)表達(dá)，抗細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是肌萎縮蛋白表達(dá)的相關(guān)生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL10基因在藏豬背最長(zhǎng)肌、腿肌和肝臟組織中的表達(dá)均極顯著高于大約克夏豬，結(jié)合脂肪型豬種藏豬相對(duì)于國(guó)外豬種體型較小、肌肉生長(zhǎng)速度較慢的特點(diǎn)，推測(cè)當(dāng)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)血糖濃度過(guò)高時(shí)，刺激CXCL10基因高表達(dá)，繼而促進(jìn)血糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹竞偷鞍踪|(zhì)，反之，當(dāng)CXCL10基因低表達(dá)時(shí)，抑制血糖向脂肪和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變，使之作用于機(jī)體的能量消耗。這與Michal 等[23]發(fā)現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)不良群體存在肌纖維萎縮、脂肪填充增多現(xiàn)象呈一致性。諸多證據(jù)表明，CXCL10基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中呈負(fù)調(diào)控作用，聯(lián)合一代測(cè)序結(jié)果及RT-qPCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在藏豬和大約克夏豬中，CXCL10基因的SNP 差異情況與熒光定量結(jié)果的差異性趨于一致[24-25]。綜上所述，推測(cè)CXCL10基因中所存在的T-832G、A-808G 和T-694C 這3 個(gè)突變位點(diǎn)可能是影響豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

綜上所述，通過(guò)對(duì)藏豬和大約克夏豬CXCL10基因起始密碼子上游3 kb DNA 序列多態(tài)性分析和背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟組織中CXCL10基因的mRNA 表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在2 個(gè)豬種中，該基因存在3 個(gè)SNP 位點(diǎn)（T-832G、A-808G 和T-694C），mRNA 水平表達(dá)量表現(xiàn)為背最長(zhǎng)肌、腿肌中藏豬表達(dá)量極顯著高于大約克夏豬，其差異性與SNP 差異性趨于一致，認(rèn)為可能是這3 個(gè)SNP 位點(diǎn)的突變影響豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，推測(cè)CXCL10基因在肌肉組織生成中起到負(fù)向調(diào)控作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理提供材料基礎(chǔ)。