亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        藏豬和大約克夏豬CXCL10 基因多態(tài)性及表達(dá)差異分析

        2022-11-17 03:52:46劉思源何辰慶陳軍軍葉幼榮強(qiáng)巴央宗
        中國(guó)畜牧雜志 2022年11期
        關(guān)鍵詞:約克夏豬種密碼子

        劉思源,何辰慶,陳軍軍,葉幼榮,張 健,商 鵬*,強(qiáng)巴央宗

        (1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,西藏林芝 860000;2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏林芝 860000)

        生豬養(yǎng)殖在我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)中長(zhǎng)久以來(lái)都占據(jù)著重要位置。而生長(zhǎng)性狀是生豬養(yǎng)殖行業(yè)中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀,由多種因素共同調(diào)控。隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖的發(fā)展和我國(guó)科研水平的提升,將遺傳性狀的分子調(diào)控機(jī)制研究與現(xiàn)代育種相結(jié)合,已成為種業(yè)提升大背景下的重要技術(shù)手段[1-2]。藏豬長(zhǎng)期生活于我國(guó)青藏高原地區(qū),是典型的高原小型豬種,常被作為試驗(yàn)材料應(yīng)用于豬生長(zhǎng)性狀的研究中[3]。由于藏豬抗逆性強(qiáng)、沉脂力高、生長(zhǎng)緩慢、出欄周期較長(zhǎng),無(wú)法滿足商業(yè)需求。所以,通過(guò)分子技術(shù)手段,對(duì)影響基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)程的起始密碼子上游3 kb 區(qū)域(含基因啟動(dòng)子區(qū)和5'UTR 區(qū))進(jìn)行挖掘,探究基因表達(dá)模式,有利于提高藏豬生長(zhǎng)性能,能夠從一定程度上推進(jìn)藏豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-5]。

        CXC 基序趨化因子配體10(CXCL10)屬于趨化因子CXC 家族,定位于豬第8 號(hào)染色體上,包含3 個(gè)內(nèi)含子、4 個(gè)外顯子,主要由成纖維細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[6-7],被視作多功能的分泌因子。最新研究發(fā)現(xiàn),CXCL10基因是一種新的肌肉生長(zhǎng)因子,能夠參與多種生物學(xué)進(jìn)程,如控制胰島素分泌,抑制肌細(xì)胞增長(zhǎng)和肌內(nèi)血管生成,是肌肉代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)和樞紐基因,與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[8-10]。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)藏豬、大約克夏豬背最長(zhǎng)肌組織RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),CXCL10基因富集于肌肉生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制相關(guān)通路上,是參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵功能候選基因[11]。

        本研究將地方重要品種資源藏豬和引進(jìn)豬種大約克夏豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,利用一代測(cè)序Sanger 法對(duì)CXCL10起始密碼子上游3 kb 區(qū)域進(jìn)行SNP 篩選,通過(guò)RT-qPCR 技術(shù)對(duì)2 個(gè)豬種的不同組織(背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟)進(jìn)行mRNA 水平檢測(cè),從而探究CXCL10基因在豬生長(zhǎng)發(fā)育性狀中發(fā)揮的作用,為藏豬這一地方品種的種質(zhì)資源保護(hù)及品種改良提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究選取藏豬(TP)和大約克夏豬(YY)為研究對(duì)象,藏豬來(lái)自西藏農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)牧場(chǎng),大約克夏豬來(lái)自林芝市宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。采集藏豬(TP,n=46)和大約克夏豬(YY,n=57)的耳組織用于提取DNA。隨機(jī)選取飼養(yǎng)模式相同的健康去勢(shì)公豬藏豬和大約克夏豬各10 頭,飼養(yǎng)至180 日齡進(jìn)行屠宰,采集背最長(zhǎng)肌、腿肌和肝臟組織,置于液氮中冷凍保存,用于RNA 提取。

        1.2 DNA、RNA 的提取及cDNA 制備 使用苯酚-氯仿法從豬耳組織中提取基因組DNA,-20℃凍存[12]。根據(jù)北京天根生化科技有限公司總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)(DP171221),北京天根快速反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)(KR180123),提取總RNA 并合成cDNA,置-20℃保存。

        1.3 SNPs 篩選及基因分型引物設(shè)計(jì) 登錄GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank),下載豬CXCL10基因DNA 序列(登錄號(hào):NC_010446.5),采用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),擴(kuò)增起始密碼子上游3 kb 區(qū)域,特異性檢驗(yàn)后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,RNase-Free ddH2O 溶解,4℃保存。引物信息見(jiàn)表1。

        表1 CXCL10 基因5'UTR 引物信息

        1.4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè) 從Gene Bank 下載CXCL10基因組序列,使用在線網(wǎng)站CONSITE(http://jaspar.binf.ku.dk/)預(yù)測(cè)SNP 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化。

        1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì) NCBI 官網(wǎng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載基因的mRNA 序列,選取CXCL10(登錄號(hào):NM_001008691)為目的基因,選取GAPDH(登陸號(hào):NM_001206359.1)作為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成,合成后用RNase-Free ddH2O 溶解,于4℃保存。引物信息見(jiàn)表2。

        表2 CXCL10 基因和GAPDH 基因定量引物信息

        1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA 為模板,選用GAPDH為內(nèi)參基因,藏豬和大約克夏豬待測(cè)樣品每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增體系(總體積為20 μL):上下游引物各0.5 μL,SYBR Green Mix 10 μL,cDNA模板0.8 μL,RNase-free ddH2O 8.2 μL。利 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(羅氏,Light Cycler96)進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增程序?yàn)槿椒ǎ?5℃預(yù)變性900 s;95℃變性30 s,57℃退火20 s,72℃延伸30 s,65℃再延伸60 s。

        1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用DNAMAN 6.0 和Chromas Pro 2.1.3 軟件分析個(gè)體測(cè)序結(jié)果,對(duì)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行篩選。利用SPSS 18.0 軟件χ2檢驗(yàn)分析各突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率差異,對(duì)CXCL10基因表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。對(duì)RT-qPCR 結(jié)果,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算CXCL10基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。使用Excel 進(jìn)行整理,并使用Sigma Plot 10.0 制圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。

        樣品目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算:

        ΔCt(樣品)=Ct(樣品目的基因)-Ct(樣品內(nèi)參基因)

        ΔCt(標(biāo)準(zhǔn)樣)=Ct(標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因)-Ct(標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因)

        ΔΔCt=ΔCt(樣品)-ΔCt(標(biāo)準(zhǔn)樣)

        目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCt

        2 結(jié)果與分析

        2.1 電泳檢測(cè)CXCL10基因以DNA 為模板的普通PCR 產(chǎn)物可見(jiàn)清晰的1 095 bp 條帶(圖1),擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好,滿足下一步實(shí)驗(yàn)需求。

        圖1 CXCL10 基因普通PCR 產(chǎn)物

        2.2 SNPs 篩選與功能預(yù)測(cè) 測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 存在3 個(gè)SNP 位點(diǎn),分別記為:T-832G、A-808G、T-694C。測(cè)序峰圖如圖2 所示。運(yùn)用Excel 10.0 計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率,經(jīng)卡方檢驗(yàn)顯示這3 個(gè)突變位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡定律,藏豬與大約克夏豬基因頻率存在極顯著差異?;蛐皖l率和基因頻率見(jiàn)表3。

        表3 CXCL10 基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率

        圖2 CXCL10 基因突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖

        通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn)堿基突變前后CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 2 個(gè)SNP 位點(diǎn)(T-832G、A-808G)突變后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失,T-832G 處突變導(dǎo)致ARGFX、ARID3B 結(jié)合位點(diǎn)消失,A-808G 突變導(dǎo)致ARID3A 結(jié)合位點(diǎn)消失。

        2.3 總RNA 提取 藏豬和大約克夏豬各組織RNA 提取結(jié)果見(jiàn)圖3。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示18S 和28S 條帶清晰,無(wú)DNA 污染和降解現(xiàn)象。使用Nano Drop 2000檢測(cè)RNA 質(zhì)量,260/280 和260/230 值均在2.0 左右,可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

        圖3 RNA 提取結(jié)果

        2.4CXCL10基因mRNA 表達(dá) 利用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)CXCL10基因在藏豬和大約克夏豬背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖4 所示,背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟這3 個(gè)組織中CXCL10基因表達(dá)量均為藏豬極顯著高于大約克夏豬。

        圖4 CXCL10 基因在TP、YY 2 個(gè)品種豬背最長(zhǎng)肌、腿肌和肝臟中mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

        3 討 論

        據(jù)Pan 等[13]研究,CXCL10基因是肌肉發(fā)育調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的樞紐,而存在基因點(diǎn)突變可能會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的改變影響基因功能和轉(zhuǎn)錄效率。本研究在CXCL10基因起始密碼子上游3 kb 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)SNP 位點(diǎn)(T-832G、A-808G 和T-694C),且經(jīng)卡方檢驗(yàn)顯示藏豬和大約克夏豬基因頻率間存在極顯著差異(P<0.01)。其中T-832G、A-808G 位點(diǎn)與地方豬種民豬中的發(fā)現(xiàn)一致,暗示該位點(diǎn)可能導(dǎo)致豬瘦肉率低、生長(zhǎng)速度慢等[14]。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè),T-832G 和A-808G 位點(diǎn)堿基突變前后ARID3A、ARID3B、ARGFX 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失,其中結(jié)合位點(diǎn)ARGFX 是同源框超家族的中心成員,控制細(xì)胞分化和胚胎致密化,主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控[15-16];ARID3A/B 屬于ARID(富含AT 的相互作用域)轉(zhuǎn)錄因子的亞家族成員,同樣參與細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育,且通過(guò)REKLES 域結(jié)合,共同促進(jìn)細(xì)胞增殖并顯著提高細(xì)胞存活水平[17-19]。由此推測(cè),隨著ARID3A、ARID3B、ARGFX 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的消失,可能導(dǎo)致CXCL10基因功能轉(zhuǎn)變,從而影響肌肉細(xì)胞的增殖分化。

        根 據(jù)Guiraud[21]、Hathout[21]、Alayi 等[22]研究,CXCL10基因通過(guò)與G 蛋白偶聯(lián)受體和整合素相互作用來(lái)發(fā)揮其生物活性,并在高濃度血糖、脂肪酸水平下增強(qiáng)表達(dá),抗細(xì)胞增殖,被認(rèn)為是肌萎縮蛋白表達(dá)的相關(guān)生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL10基因在藏豬背最長(zhǎng)肌、腿肌和肝臟組織中的表達(dá)均極顯著高于大約克夏豬,結(jié)合脂肪型豬種藏豬相對(duì)于國(guó)外豬種體型較小、肌肉生長(zhǎng)速度較慢的特點(diǎn),推測(cè)當(dāng)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)血糖濃度過(guò)高時(shí),刺激CXCL10基因高表達(dá),繼而促進(jìn)血糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹竞偷鞍踪|(zhì),反之,當(dāng)CXCL10基因低表達(dá)時(shí),抑制血糖向脂肪和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變,使之作用于機(jī)體的能量消耗。這與Michal 等[23]發(fā)現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)不良群體存在肌纖維萎縮、脂肪填充增多現(xiàn)象呈一致性。諸多證據(jù)表明,CXCL10基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中呈負(fù)調(diào)控作用,聯(lián)合一代測(cè)序結(jié)果及RT-qPCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn),在藏豬和大約克夏豬中,CXCL10基因的SNP 差異情況與熒光定量結(jié)果的差異性趨于一致[24-25]。綜上所述,推測(cè)CXCL10基因中所存在的T-832G、A-808G 和T-694C 這3 個(gè)突變位點(diǎn)可能是影響豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。

        4 結(jié) 論

        綜上所述,通過(guò)對(duì)藏豬和大約克夏豬CXCL10基因起始密碼子上游3 kb DNA 序列多態(tài)性分析和背最長(zhǎng)肌、腿肌、肝臟組織中CXCL10基因的mRNA 表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在2 個(gè)豬種中,該基因存在3 個(gè)SNP 位點(diǎn)(T-832G、A-808G 和T-694C),mRNA 水平表達(dá)量表現(xiàn)為背最長(zhǎng)肌、腿肌中藏豬表達(dá)量極顯著高于大約克夏豬,其差異性與SNP 差異性趨于一致,認(rèn)為可能是這3 個(gè)SNP 位點(diǎn)的突變影響豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育,推測(cè)CXCL10基因在肌肉組織生成中起到負(fù)向調(diào)控作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理提供材料基礎(chǔ)。

        猜你喜歡
        約克夏豬種密碼子
        貴州地方特色豬種培育
        可視化中國(guó)地方豬種地理分布圖
        河南精旺豬種改良有限公司
        國(guó)外豬種大量引進(jìn)導(dǎo)致本土豬種瀕臨滅絕的原因分析及應(yīng)對(duì)建議(以玉山黑豬為例)
        密碼子與反密碼子的本質(zhì)與拓展
        約克夏和絲毛的區(qū)別
        約克夏犬的夏天
        明星小閨蜜 約克夏
        會(huì)移動(dòng)的金色寶石 約克夏(犭更)犬
        10種藏藥材ccmFN基因片段密碼子偏好性分析
        中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:10
        国产亚洲精品免费专线视频| 东北无码熟妇人妻AV在线| 日韩成人无码v清免费| 中文字幕一区二区三区在线看一区| 国产老熟女精品一区二区| 波多野42部无码喷潮在线| 亚洲欧美国产双大乳头| 亚洲精品乱码久久久久久蜜桃不卡| 99精品久久这里只有精品| 中文字幕一区二区三区.| 精品国产自在现线看久久| 麻豆╳╳╳乱女另类| 国产成人精品电影在线观看18| 久久久亚洲精品一区二区| 中文字幕中文字幕在线中二区 | 真实的国产乱xxxx在线| 日韩精品无码一区二区中文字幕 | 亚洲欧洲日产国码久在线| 毛片成人18毛片免费看| 久久精品国产亚洲av香蕉| 一个人看的www免费视频中文| 亚洲天堂中文字幕君一二三四 | 天堂在线资源中文在线8 | 亚洲综合av永久无码精品一区二区| 免费精品无码av片在线观看| www久久久888| 国产精品一区二区三区播放| 国产精品免费_区二区三区观看 | 91麻豆精品激情在线观看最新| 日本高清一区二区在线观看| 国产精品女主播福利在线| 蜜臀av 国内精品久久久| 色综合久久精品中文字幕| 国产亚洲3p一区二区| 国产做国产爱免费视频| 久久精品片| 一级午夜理论片日本中文在线| 国产精品毛片无遮挡高清| 亚洲国产av导航第一福利网| 国产9 9在线 | 免费| 久久丝袜熟女av一区二区|