趙淑琴，韓亞軒，魯巨貴，楊 榛

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省蘭州市紅古區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，甘肅蘭州 730070）

在以往的生產(chǎn)生活中，特定物種的繁殖季節(jié)按照長(zhǎng)期規(guī)律來(lái)看都是恒定不變的，雄性動(dòng)物精子最大活躍期和雌性動(dòng)物的排卵期都是在每年相對(duì)固定的時(shí)間開始和結(jié)束的，這種年度節(jié)律是通過復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)控[1]。季節(jié)性繁殖除受下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）的調(diào)控，還受內(nèi)源生物鐘調(diào)控。哺乳動(dòng)物通過視網(wǎng)膜感知光周期的穩(wěn)定變化，將信號(hào)傳遞給下丘腦，此時(shí)一條途徑是位于下丘腦的視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）對(duì)光信號(hào)作出整合，引起SCN 上生物鐘基因的表達(dá)發(fā)生變化，然后SCN 將此信號(hào)傳遞給外周生物鐘，引起繁殖相關(guān)的基因節(jié)律性表達(dá)，最終使動(dòng)物生殖激素發(fā)生變化，調(diào)控動(dòng)物的季節(jié)性繁殖；另一條途徑則是光周期信號(hào)作用于松果體，導(dǎo)致松果體節(jié)律性分泌褪黑素（Melatonin，Mel），褪黑素又參與HPGA 的調(diào)控，使生殖激素的分泌發(fā)生節(jié)律性變化，最終共同調(diào)控動(dòng)物的季節(jié)性繁殖[2]。本文通過綜述褪黑素、褪黑素信號(hào)通路以及生物鐘基因在季節(jié)性繁殖動(dòng)物調(diào)控中的作用機(jī)制，以及褪黑素-褪黑素受體信號(hào)通路與生物鐘基因之間的直接交互作用和間接交互作用，一方面有助于在分子水平上將信號(hào)通路與晝夜節(jié)律生物鐘聯(lián)系起來(lái)，另一方面可以為完善哺乳動(dòng)物體內(nèi)生物鐘網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制，為研究季節(jié)性繁殖動(dòng)物的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 褪黑素對(duì)季節(jié)性繁殖動(dòng)物的作用機(jī)制

1.1 褪黑素通過HPGA 對(duì)生殖的調(diào)控 褪黑素是一種吲哚類激素，它是由哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的松果體分泌，化學(xué)名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytrypto mine）[3]。褪黑素的合成和分泌受光的抑制，在夜間激活，呈現(xiàn)夜增晝低的趨勢(shì)。褪黑素通過與膜相關(guān)的G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮作用，在人類和哺乳動(dòng)物中褪黑素受體有MT1 和MT2 受體[3-4]。

松果體是褪黑素合成的主要場(chǎng)所，是所有哺乳動(dòng)物感應(yīng)季節(jié)性變化的關(guān)鍵。褪黑素的合成途徑是：當(dāng)光信號(hào)通過刺激視網(wǎng)膜，將神經(jīng)沖動(dòng)傳遞給SCN，再通過腎上腺素能神經(jīng)作用于松果體腎上腺素能受體，激活細(xì)胞內(nèi)第二信使。其中，第二信使cAMP 和Ca2+誘導(dǎo)激活褪黑素合成的限速酶5-羥基-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT），使5-羥色胺轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰-5-羥色胺，最后生成褪黑素[5]（圖1）。如果將松果體切除，會(huì)導(dǎo)致季節(jié)性繁殖行為不能隨著季節(jié)變化而同步變化[6]。其調(diào)控機(jī)理是當(dāng)切除松果體后，對(duì)光信號(hào)不能做出應(yīng)答，導(dǎo)致褪黑素?zé)o法合成，就失去了褪黑素對(duì) HPGA 和生殖的調(diào)控，最終使季節(jié)性繁殖行為不能隨著季節(jié)變化而同步變化。

圖1 光照信號(hào)通過視網(wǎng)膜-松果體途徑對(duì)褪黑素的調(diào)控

褪黑素通過HPGA 對(duì)生殖的調(diào)控有直接和間接2種方式（圖2）。直接調(diào)節(jié)是指褪黑素直接作用于性腺，調(diào)控生殖激素的分泌，影響動(dòng)物繁殖[7]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以改變睪丸生精細(xì)胞、黃體細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞的形態(tài)，保護(hù)正在黃體化的顆粒細(xì)胞免受卵泡中活性氧的影響，在排卵期間促進(jìn)黃體生成以產(chǎn)生黃體酮[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道在馬精液冷凍稀釋液中加入1mmol/L 褪黑素可保護(hù)精子，提高凍精的受孕率[10]。在褪黑素的存在下，睪丸支持細(xì)胞可以顯著增強(qiáng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成，褪黑素可以調(diào)節(jié)間質(zhì)和支持細(xì)胞的分泌功能[11]。間接方式是指褪黑素通過作用于HPGA，影響促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素（GTH）的分泌來(lái)調(diào)控動(dòng)物生殖[12]。GTH 根據(jù)功能分為促黃體素（LH）和促卵泡激素（FSH），F(xiàn)SH 的主要功能是參與固醇類的合成及精子和卵子的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素作用于性腺軸使血漿中FSH、LH 水平降低，間接抑制了靶性腺激素的分泌[13]。LH 主要是影響排卵和排精，有文獻(xiàn)報(bào)道褪黑激素顯著降低了LH 和雌二醇（17β-estradiol，E2）的血漿水平，在排卵過程中部分抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，并誘導(dǎo)卵巢、輸卵管和子宮內(nèi)雌激素受體、孕激素受體、雄激素受體的差異調(diào)節(jié)[14]。E2和睪酮（Testosterone，T）是生殖過程中最主要的類固醇激素，F(xiàn)SH 和LH 通過血液循環(huán)作用于性腺，與相應(yīng)的受體結(jié)合后促進(jìn)配子發(fā)生和類固醇激素合成[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)褪黑素分泌量濃度較高時(shí)，會(huì)形成視網(wǎng)膜-SCN-松果體的神經(jīng)內(nèi)分泌反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，反過來(lái)抑制視交叉上核對(duì)松果體的刺激作用，直接影響生物鐘機(jī)制[13]。

圖2 褪黑素對(duì)HPG 軸的調(diào)節(jié)

除此以外，褪黑素、促甲狀腺激素（TSH）參與SCN 與下丘腦垂體軸之間的聯(lián)系。垂體結(jié)節(jié)部（PT）存在大量的褪黑素受體，是調(diào)控繁殖的首要作用點(diǎn)，褪黑素在此調(diào)節(jié)TSH 的分泌[15]。因此，當(dāng)大腦深處的光感受器感知并將光信息傳遞到PT，產(chǎn)生TSH。這種PTTSH 通過誘導(dǎo)下丘腦脫碘酶的產(chǎn)生使甲狀腺激素（T3）生物活性水平升高，而升高的T3 反過來(lái)抑制促性腺激素釋放激素分泌，以此介導(dǎo)HPGA 的季節(jié)性變化[16]。

褪黑素作為調(diào)節(jié)繁殖季節(jié)的重要激素，這一點(diǎn)己經(jīng)在對(duì)馬、倉(cāng)鼠等長(zhǎng)日照動(dòng)物和綿羊等短日照動(dòng)物的研究中獲得了證明。根據(jù)動(dòng)物種類、年齡、性別等不同，褪黑素對(duì)生殖系統(tǒng)的影響會(huì)表現(xiàn)出促進(jìn)、抑制、無(wú)作用等結(jié)果。如褪黑素對(duì)牛、鼠類、禽類等動(dòng)物起抑制生殖的作用，對(duì)綿羊和鹿等起促進(jìn)作用，對(duì)光不敏感動(dòng)物則表現(xiàn)為無(wú)作用[7,17-18]。褪黑素的分泌與接受的光照成反比，在光照強(qiáng)度比較低的黃昏和拂曉時(shí)褪黑素的釋放被完全抑制[19]。對(duì)于長(zhǎng)日照動(dòng)物而言，褪黑素分泌量增加導(dǎo)致GnRH 分泌減少，影響性腺功能；對(duì)于短日照動(dòng)物，褪黑素信號(hào)會(huì)使得性腺功能活躍。補(bǔ)充外源性褪黑素使馬的睪酮濃度降低、小鼠睪丸退化[12,20]。另一方面，外源性褪黑素可以促進(jìn)公羊體內(nèi)LH 和FSH 分泌，能夠引起血清睪酮水平的較大日波動(dòng)[21]。有文獻(xiàn)報(bào)道給切除松果體的公羊埋植褪黑素來(lái)模擬長(zhǎng)日照褪黑素信號(hào)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)70 d 后公羊體內(nèi)重建了LH 節(jié)律分泌模型。而短日照的褪黑素信號(hào)卻不能誘導(dǎo)LH 季節(jié)性節(jié)律分泌模式，可以得出羊的LH 的分泌是由長(zhǎng)日照褪黑素信號(hào)調(diào)節(jié)的[22]。因此光照的信息支配著長(zhǎng)日照和短日照動(dòng)物的分類，同樣支配著褪黑素的節(jié)律性分泌，其相互之間也許是獨(dú)立的[18]。

1.2 褪黑素作用于性腺類固醇激素對(duì)生殖的調(diào)控 早期報(bào)道褪黑素可抑制雌激素等性腺類固醇合成，這是褪黑素和雌激素信號(hào)通路之間相互干擾的第一個(gè)跡象。隨后的研究表明褪黑素通過3 個(gè)關(guān)鍵機(jī)制影響雌激素的作用：①通過抑制性腺合成激素（包括雌激素）來(lái)降低其循環(huán)水平；②通過與ERα作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（SERM）的相互作用來(lái)改變雌激素結(jié)合、DNA 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性；③通過抑制從膽固醇或其他類固醇中合成雌激素的關(guān)鍵酶如芳香化酶、硫酸鹽酶和醛酮還原酶（AKRs）的活性[17]。褪黑素對(duì)哺乳動(dòng)物生殖生理的影響還不完全清楚，但褪黑素確實(shí)對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞中的類固醇生成發(fā)揮了一些調(diào)節(jié)作用。研究證明褪黑素激活Gαi2 蛋白降低cAMP/PKA 水平，以及PKA 敏感部位ERα絲氨酸236（s236）的磷酸化，介導(dǎo)了褪黑素對(duì)ERα轉(zhuǎn)錄活性的抑制[23]。

Ahmad 等[24]在毛竹鼠睪丸內(nèi)注射褪黑素，體外培養(yǎng)毛竹鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中類固醇激素的生成下降，睪酮水平降低，雄激素受體（AR）、雄激素結(jié)合蛋白（ABP）、3β-羥基固醇脫氫酶（3β-HSD）活性都有所降低。Valenti 等[25]報(bào)道了成年大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中存在褪黑素受體。Wu 等[26]研究小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)用人絨毛膜促性腺激素/環(huán)磷酸腺苷（hCG/cAMP）類似物處理細(xì)胞，睪酮水平升高、類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）表達(dá)升高；用hCG/cAMP類似物處理細(xì)胞并加入褪黑素發(fā)現(xiàn)，褪黑素在3 h內(nèi)抑制細(xì)胞中睪酮產(chǎn)生、StAR 表達(dá)降低，StAR 蛋白的表達(dá)和類固醇的產(chǎn)生因褪黑激素濃度從1 nmol/L 到10 nmol/L 而降低，說明褪黑素通過阻斷StAR 蛋白表達(dá)、特異性結(jié)合位點(diǎn)抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇生成。

2 生物鐘

2.1 生物鐘的組成 晝夜更替是地球自轉(zhuǎn)而產(chǎn)生，生物體為適應(yīng)這種環(huán)境，在生物體內(nèi)產(chǎn)生的呈周期性、穩(wěn)定可持續(xù)的內(nèi)源性生物現(xiàn)象為晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律使得生物體的各項(xiàng)生理活動(dòng)呈現(xiàn)一定的時(shí)間周期變化，包括激素的分泌、睡眠與覺醒、新陳代謝與細(xì)胞分裂、血壓體溫等的周期性變化[27]。在生物體內(nèi)，月節(jié)律、年節(jié)律、周節(jié)律都屬于節(jié)律系統(tǒng)。

生物鐘作為晝夜節(jié)律振蕩器的重要組成元件，幾乎在所有組織中都存在。主時(shí)鐘位于哺乳動(dòng)物大腦區(qū)域的下丘腦視交叉上核（SCN），其他器官的生物鐘被稱為外周生物鐘。中樞時(shí)鐘系統(tǒng)由時(shí)鐘基因Period（Per1/2/3）、Crytochrome（Cry1/2）、Clock、Bmal1、CKIε、Rev-Erbα等和其編碼的蛋白，以及一些代謝相關(guān)基因組成。通過神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌和體液等的傳導(dǎo)作用于外周時(shí)鐘系統(tǒng)，和外周時(shí)鐘系統(tǒng)共同組成生物鐘[28]。哺乳動(dòng)物內(nèi)源性的晝夜節(jié)律與環(huán)境保持同步，主要依賴于中樞時(shí)鐘系統(tǒng)與外周時(shí)鐘系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)作用，晝夜節(jié)律也協(xié)調(diào)哺乳動(dòng)物的生命活動(dòng)和生理狀態(tài)的平衡有序。

生物節(jié)律形成的核心分子機(jī)制就是生物鐘構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路。時(shí)鐘蛋白Clock 和Bmal1 形成異二聚體，它們識(shí)別并結(jié)合到E-box（CACGTG）上，E-box是下游鐘控基因的啟動(dòng)子。于是靶基因的轉(zhuǎn)錄被激活，翻譯出新的蛋白質(zhì)，調(diào)控機(jī)體的節(jié)律。白天Bmal1-Clock 異二聚體作為反饋環(huán)中的核心調(diào)節(jié)因子，使細(xì)胞核內(nèi)Per、Cry或其他基因的轉(zhuǎn)錄活性增加，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中Cry 和Per 的蛋白水平的升高。夜間這些蛋白通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，并形成Cry-Per 復(fù)合物，識(shí)別并結(jié)合到Bmal1-Clock 異二聚體上，抑制了Bmal1-Clock 異二聚體的功能，導(dǎo)致Per、Cry基因的轉(zhuǎn)錄活性關(guān)閉，隨后Cry-Per 復(fù)合物被泛素化后降解。于是隨著Cry-Per復(fù)合物被蛋白酶體降解，解除了對(duì)Bmal1-Clock 異二聚體的抑制，這樣新一輪的轉(zhuǎn)錄又將開始[29]。如此就形成了一個(gè)轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)（圖3）。

圖3 主時(shí)鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)的的調(diào)節(jié)模式[30]

與外周生物鐘不同，SCN 主鐘對(duì)于生物體生物鐘節(jié)律至關(guān)重要，一旦SCN 主鐘遭到損壞，整個(gè)生物個(gè)體生物鐘節(jié)律可能直接喪失。Ralph[31]以松鼠猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象得出以下結(jié)論，當(dāng)松鼠猴的SCN 被破壞后，它的節(jié)律性行為及內(nèi)分泌消失，當(dāng)重新移植SCN 后，松鼠猴的節(jié)律性行為又得以恢復(fù)。SCN 主鐘的生物鐘節(jié)律表現(xiàn)非常穩(wěn)定，尤其是與外周生物鐘相比較而言。

2.2 生物鐘對(duì)季節(jié)性繁殖動(dòng)物的作用機(jī)制 SCN 核團(tuán)作為中央生物鐘，是通過一種偶聯(lián)同步化機(jī)制來(lái)確保有機(jī)體的各項(xiàng)機(jī)能維持穩(wěn)定，血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）神經(jīng)肽就是一個(gè)起到重要作用的神經(jīng)遞質(zhì)。SCN 通過產(chǎn)生VIP 和精氨酸加壓素（AVP）2 種神經(jīng)肽，將生物鐘信號(hào)傳至卵巢、睪丸等外周組織。VIP 也可直接刺激下丘腦的GnRH 神經(jīng)元活動(dòng)，影響GnRH 的分泌，并且能間接作用于RF 酰胺相關(guān)肽（抑制GTH 的釋放）神經(jīng)元活動(dòng)，抑制其對(duì)GnRH 神經(jīng)元的作用，從而參與HPGA 的調(diào)控[32]。Hughes 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠VIP基因或是VIP 受體基因（Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 2，VIPR2）敲除后，小鼠的日常行為及生理水平的生物鐘節(jié)律都受到了很大的破壞和影響，盡管基因敲除小鼠的生物鐘負(fù)反饋環(huán)路在細(xì)胞水平上的是完整的，同時(shí)其生物鐘在細(xì)胞水平上的運(yùn)行也是正常的，但是對(duì)于小鼠機(jī)體生物鐘的破壞是存在的。

受節(jié)律生物鐘的調(diào)控，雌激素、睪酮、褪黑素、糖皮質(zhì)激素等的分泌通常呈現(xiàn)一種周期性規(guī)律。在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，性激素分泌的晝夜節(jié)律發(fā)生變化，晝夜節(jié)律紊亂導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病率增高[19]。很多研究數(shù)據(jù)顯示，生物鐘與雌二醇-雌二醇受體（E2-ERa）信號(hào)通路間存在關(guān)聯(lián)，并且E2-ERa 信號(hào)通路參與了生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄過程[34]。Rossetti 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，E2 使生物鐘基因Bmal1表達(dá)上調(diào)，其相互作用在乳腺導(dǎo)管的發(fā)育過程中產(chǎn)生重要作用，在人乳腺細(xì)胞系中敲低ERa，并加入E2 發(fā)現(xiàn)，Per2和Bmal1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，雌二醇受體以雌二醇依賴的方式調(diào)控Per2-Bmal1 時(shí)鐘機(jī)制。在E2-ERa 信號(hào)通路的下游存在生物鐘基因Per2，Per2的啟動(dòng)子上存在雌激素反應(yīng)元件（ERE），ERa 結(jié)合在ERE 上促使Per2的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Per2 蛋白含量升高；升高的Per2 蛋白反過來(lái)抑制ERa 與ERE 結(jié)合，使乳腺腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，研究發(fā)現(xiàn)，具有家族原發(fā)性乳腺癌患者的乳腺組織，生物鐘基因Per1和Per2的表達(dá)顯著低于正常人群的乳腺組織[36]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，體外培養(yǎng)大鼠的子宮上皮細(xì)胞加入E2 后Per1基因高表達(dá)[37]。這進(jìn)一步表明了E2 與生物鐘存在關(guān)聯(lián)。

3 褪黑素信號(hào)通路與生物鐘交互作用

3.1 褪黑素與生物鐘基因在中樞途徑中的交互作用 褪黑素對(duì)于大多數(shù)生物體來(lái)說，其最主要的功能就是為生物體提供時(shí)間信息。松果體和視網(wǎng)膜產(chǎn)生的褪黑素晝夜變化規(guī)律從魚類到哺乳動(dòng)物都是非常恒定的，褪黑素波峰都出現(xiàn)在夜晚。褪黑素合成酶（AANAT）是褪黑素合成的限速酶，該酶活性和褪黑素的水平具有同步性。生物鐘可以調(diào)節(jié)AANAT 活性，AANAT 活性在也受到光照條件的抑制[38]。研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1-Clock 異二聚體能夠作用于AANAT基因啟動(dòng)子的E-box 元件上，增強(qiáng)了AANAT基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了褪黑素的合成，這樣使得AANAT的表達(dá)和褪黑素的濃度也表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性，即夜間表達(dá)較高；而在白天，由于Bmal1-Clock 異二聚體受到Cry 蛋白的抑制，AANAT基因的轉(zhuǎn)錄也受到抑制，使AANAT表達(dá)較低，褪黑素的合成也隨之減少，在白天出現(xiàn)表達(dá)較低的現(xiàn)象[39]。

Yamanaka 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，給與小鼠5d 的全黑暗條件，垂體細(xì)胞中Clock基因表達(dá)升高，Per1/2及Bmal1基因表達(dá)降低；用褪黑素注射處理后，Clock基因表達(dá)水平降低，Per1/2的表達(dá)水平升高，Bmal1沒變化，推測(cè)褪黑素、褪黑素合成酶及生物鐘基因之間存在反饋?zhàn)饔铆h(huán)路。還有實(shí)驗(yàn)表明，生物鐘Cry基因是感光基因，且是AANAT 轉(zhuǎn)錄的阻遏物，在Cry1和Cry2雙缺陷小鼠（Cry1-/-/ Cry2-/-）中褪黑素含量很低，將Cry1-/-/ Cry2-/-小鼠持續(xù)一段黑暗時(shí)間的處理后，其生物鐘節(jié)律丟失，AANAT和時(shí)鐘基因Per1的表達(dá)水平很高[41]。還有研究表明，較長(zhǎng)光照時(shí)間的刺激，能夠引發(fā)Per2基因的高表達(dá)，而Per2基因的高表達(dá)會(huì)抑制AANAT表達(dá)，因而推測(cè)Per2基因的表達(dá)與褪黑素的合成具有相反的模式[42]。當(dāng)敲除小鼠松果體細(xì)胞中的褪黑素受體MT1時(shí)，小鼠垂體細(xì)胞中Per1、Cry1、Clock和Bmal1基因的表達(dá)顯著降低，說明生物鐘基因節(jié)律性表達(dá)與褪黑素受體的存在有著密切關(guān)系[43]。

本實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)在前期以季節(jié)性繁殖動(dòng)物雙峰駝卵巢顆粒細(xì)胞為模型，研究其生殖調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)，通過免疫定位實(shí)驗(yàn)顯示MT1 和MT2 受體蛋白主要存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，Cry1 和Cry2 蛋白主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)過表達(dá)基因MT1/2后，Cry1/2基因的表達(dá)顯著增加，可通過cAMP/PKA/CREB 通路解釋清楚；但是當(dāng)過表達(dá)Cry1/2后，MT1/2基因的表達(dá)也顯著增加，推測(cè)Cry基因?qū)T1/2的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，暗示MT1/2的啟動(dòng)子中含有Cry基因的結(jié)合元件[44]。

3.2 褪黑素與生物鐘基因在外周途徑中的交互作用 褪黑素作為中樞生物鐘的輸出和外周振蕩器的輸入，在調(diào)節(jié)中起著重要作用。關(guān)于褪黑素的生物作用已經(jīng)被報(bào)道過很多，但最好的描述是它作為一種神經(jīng)激素和光/暗周期的牽引劑，以及SCN 外周時(shí)鐘的同步器的生物鐘作用[9]。夜間血液中褪黑素水平升高，會(huì)通知身體細(xì)胞和器官現(xiàn)在是夜間，并幫助組織目標(biāo)器官和器官系統(tǒng)進(jìn)入適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)平衡代謝節(jié)奏，白晝長(zhǎng)度或光照時(shí)間/相位的改變都會(huì)使SCN 活動(dòng)及伴隨的松果體產(chǎn)生褪黑素的活動(dòng)不同步[18]。

LH 作為調(diào)控生殖的重要激素，在哺乳動(dòng)物的排卵、性激素的分泌過程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，褪黑素對(duì)LH 有直接調(diào)節(jié)作用，其關(guān)鍵作用是影響前列腺素合成酶（又稱環(huán)氧合酶，Cyclooxygenase2，COX2)，COX2 也是影響排卵的重要因素，COX2啟動(dòng)子中存在E-box 序列，Bmal1-Clock 異二聚體可與E-box 序列結(jié)合調(diào)控COX2的表達(dá)，當(dāng)敲除卵巢顆粒細(xì)胞中的Bmal1基因，COX2表達(dá)和前列腺素合成顯著降低[45]。這表明前列腺素使卵泡破裂的調(diào)控機(jī)制依賴于卵巢上的生物鐘的調(diào)控。

Ding 等[46]研究還發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以間接影響睪酮水平，睪丸內(nèi)睪酮的合成需要一系列睪丸合成酶(P450scc、P450c17、3β-HSD、17β-HSD) 的作用形成，睪丸內(nèi)存在Bmal1基因，該基因可誘導(dǎo)睪丸合成酶合成。Chung 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，類固醇急性調(diào)節(jié)基因（StAR）的轉(zhuǎn)錄可以直接被Bmal1基因激活；當(dāng)敲除小鼠Bmal1基因時(shí)，StAR基因表達(dá)顯著降低，睪酮水平也隨之降低，可以看出，Bmal1基因在調(diào)控哺乳動(dòng)物分泌睪酮時(shí)起到關(guān)鍵作用。另外，當(dāng)切除小鼠的松果體后，睪酮和Bmal1、StAR、Rev-erbα的表達(dá)均發(fā)生顯著變化，當(dāng)注射褪黑素后各項(xiàng)參數(shù)得到恢復(fù)[48]。因此可以得出，褪黑素可通過調(diào)控鐘基因Bmal1的表達(dá)來(lái)影響睪酮生成。在敘利亞倉(cāng)鼠中，給與正常的光照節(jié)律，其Bmal1基因的表達(dá)無(wú)明顯節(jié)律，而Per1基因存在節(jié)律性，其在夜間的表達(dá)水平最高；將倉(cāng)鼠長(zhǎng)時(shí)間置于黑暗環(huán)境時(shí)，其褪黑素分泌的節(jié)律性消失，倉(cāng)鼠性腺衰退，而此時(shí)Bmal1基因的表達(dá)則表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性，Per1基因的節(jié)律性消失[49]，說明褪黑素和生物鐘基因都受光暗條件的限制，相互依存、相互影響。

AANAT、HIOMT、MT1、MT2基因是褪黑素合成和發(fā)揮作用的關(guān)鍵。文獻(xiàn)報(bào)道，在大鼠的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）中存在上述基因，同時(shí)，還存在Clock、Bmal1、Cry1/2、Per1/2等生物鐘基因，在排卵后輸卵管壺腹部獲得的成熟COC 上的Bmal1基因表達(dá)水平較高，其他基因在卵巢組織中分離的未成熟COC上的表達(dá)水平較高；切除松果體后，COC 中AANAT、HIOMT、MT1、MT2等基因的表達(dá)水平發(fā)生變化；注射褪黑素后，上述基因的表達(dá)恢復(fù)生物鐘節(jié)律[50]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素通過影響COC 進(jìn)而影響生物鐘基因的表達(dá)，對(duì)卵巢功能具有調(diào)控作用。

Steven 等[19]研究表明，MT1 蛋白和MT2 蛋白形成的異二聚體抑制cAMP 的積累，與cAMP 相關(guān)的信號(hào)通路受到調(diào)控，使生物鐘基因表達(dá)發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，Cry 蛋白主要存在于卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核中，卵巢顆粒細(xì)胞上存在褪黑素受體基因（MT1、MT2）和節(jié)律基因（Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Per3）的表達(dá)；過表達(dá)MT1/2基因后，cAMP 產(chǎn)生受到抑制，除Cry1/2表達(dá)極顯著升高外，其他基因（GNB2、PKA、CREB、Per1/2/3、Clock）均極顯著降低[44]。過表達(dá)Cry1/2后，cAMP 的產(chǎn)生受到抑制，除MT1/2的表達(dá)極顯著升高外，其他基因均顯著降低[44]。MT與Cry通過cAMP/ PKA/ CREB 通路構(gòu)成一個(gè)環(huán)路（圖4）。此結(jié)果解釋為，當(dāng)過表達(dá)MT1/2基因，cAMP 產(chǎn)生受到抑制，使有活性的PKA 生成降低，進(jìn)一步影響CREB 的磷酸化，使得Per的轉(zhuǎn)錄受到抑制，負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子Cry 激活，其表達(dá)含量升高。該結(jié)果與核心節(jié)律的生物鐘調(diào)控機(jī)制完全一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證基因的相關(guān)性，當(dāng)過表達(dá)基因Cry后檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路基因的變化，結(jié)果顯示與過表達(dá)MT的結(jié)果完全一致。有2 種分析途徑，一是過表達(dá)的Cry抑制了cAMP，進(jìn)而影響cAMP/PKA/ CREB 信號(hào)通路，使結(jié)果與過表達(dá)MT完全一致，二是暗示了MT和Cry之間存在的聯(lián)系發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 cAMP/PKA/CREB 信號(hào)通路介導(dǎo)的褪黑素對(duì)生物鐘基因的作用機(jī)制[44]

4 總結(jié)與展望

生物鐘基因受光照控制，其分子機(jī)制根據(jù)轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路進(jìn)行振蕩，控制生物體的各項(xiàng)節(jié)律性生理活動(dòng)和行為。本文總結(jié)了有節(jié)律的褪黑素合成不但通過HPGA 通路調(diào)控哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖，還通過下丘腦甲狀腺激素-GnRH 調(diào)控動(dòng)物的繁殖。位于SCN 的主生物鐘通過感光基因表達(dá)的變化引起生物鐘基因的節(jié)律性振蕩，之后將這種振蕩傳遞給外周生物鐘，使性激素合成相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)控生殖。本文分別從生物鐘基因?qū)ι车恼{(diào)控，及褪黑素介導(dǎo)的生物鐘基因?qū)ι车恼{(diào)控，從中樞途徑和外周途徑兩方面入手闡述其相互作用關(guān)系，為完善褪黑素、生物鐘作用的季節(jié)性繁殖規(guī)律提供更具體的思路，是控制動(dòng)物季節(jié)性繁殖行為的重要內(nèi)容。

動(dòng)物利用光周期的變化來(lái)適應(yīng)即將到來(lái)的繁殖季節(jié)，這對(duì)于深入理解動(dòng)物季節(jié)性繁殖的機(jī)制有幫助。雖然人類不是季節(jié)性的，但人類有很多生物節(jié)律，如睡眠-覺醒節(jié)律、青春期發(fā)育等。生物節(jié)律的紊亂導(dǎo)致體內(nèi)激素水平異常，與乳腺癌、甲狀腺疾病有很大的聯(lián)系，因此了解動(dòng)物季節(jié)性繁殖的分子機(jī)制有助于更好地理解人類的生物節(jié)律。盡管人們已經(jīng)非常了解褪黑素的合成途徑，但是，褪黑素驅(qū)動(dòng)節(jié)律本身的機(jī)制，以及與生物鐘分子機(jī)制中存在的千絲萬(wàn)縷關(guān)系還是未知的，褪黑素受體基因啟動(dòng)子中是否含有誘使或者結(jié)合生物鐘基因轉(zhuǎn)錄的核心位點(diǎn)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，這也是本實(shí)驗(yàn)室的下一步計(jì)劃。