晏婭蓉，高亞敏，廖 娟，周全惠，陰歡歡

（文山學(xué)院 三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663000）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.），其他名稱還有大椒、檓和蜀椒等，主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、酰胺和生物堿[1]。花椒是一種有價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物，我國資源豐富，是栽培、產(chǎn)量的第一大國[2]。把花椒作為一種中藥材治療疾病在我國很早就開始了[3]。研究人員大多都是對花椒籽粒、果皮成分進(jìn)行探索[4-7]，而對花椒葉抑菌方面的研究和報(bào)道較少。

花椒種植中產(chǎn)量最大的副產(chǎn)物是花椒葉，花椒葉味辛、性熱和無毒，化學(xué)成分主要有生物堿、木脂素、酰胺和黃酮等[4]。近年很多文獻(xiàn)報(bào)道稱，花椒葉中的黃酮具有降血脂、抗炎和抗病毒等作用[8]。而Chang 等[9]國外學(xué)者的研究報(bào)道證明花椒葉中的多酚物質(zhì)具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及抗氧化作用。呂可等[10]采用花椒葉浸提液對土壤微生物進(jìn)行研究，結(jié)果顯示花椒葉浸提液讓根際的活性降低，對真菌根際活性減弱最多，細(xì)菌中等，放線菌最少。龔晉文等[11]對花椒葉提取物在不同條件下對3 種常見菌的抑菌作用進(jìn)行研究，結(jié)論為花椒葉提取物對3 種常見菌有明顯的抑菌效果。

引起食源性疾病的主要因素之一是食品中污染的病原細(xì)菌，在食物中常見的污染細(xì)菌是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）[12]。在空氣、土壤、水及食具中金黃色葡萄球菌大量分布，人和動物帶菌率極高[13]。能引起骨髓炎、心內(nèi)膜炎和壞死性筋膜炎等多種疾病[14]。我國每年的食物中毒事件大多由金黃色葡萄球菌引起[15]。最常見的病原細(xì)菌還有大腸桿菌，致病性是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中常見的[16]。

本研究以花椒葉作為實(shí)驗(yàn)材料，探究不同方法提取花椒葉提取物在不同pH、溫度和濃度下對2 種常見菌的抑制作用，為花椒葉的科學(xué)研究和產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

花椒葉在文山學(xué)院校園內(nèi)花椒樹上采摘，品種為秦椒，保鮮儲存。大腸桿菌菌株ATCC25922（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌菌株ATCC6538（Staphylococcus aureus，S.aureus）于北京生物保藏中心購買。

實(shí)驗(yàn)器材包括：DHP-9052 恒溫培養(yǎng)箱，廠家為上?！憧茖W(xué)儀器有限公司；Scout SE-SE602 F 天平，廠家為奧豪斯儀器有限公司；N-126（D）顯微鏡，廠家為寧波永新光學(xué)股份有限公司；LDZX-50L 高壓蒸汽滅菌鍋，廠家為上海申安醫(yī)療器械廠；TS-200B 恒溫?fù)u床，廠家為上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；TY-837打孔器，廠家為通用集團(tuán)國際有限公司；尼康數(shù)碼相機(jī)D7500。

試劑包括：75%酒精，級別為分析純，廠家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蒸餾水，文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；LB 培養(yǎng)基（1 000 mL 蒸餾水），文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；10 g 胰蛋白胨，級別為生物試劑，廠家為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5 g酵母提取物，級別為實(shí)驗(yàn)試劑，廠家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；10 g NaCl，級別為分析純，廠家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；5 mol/L NaOH（氫氧化鈉），級別為分析純，廠家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；7 g 瓊脂，級別為生物試劑，廠家為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花椒葉提取物的制備

采摘新鮮花椒葉后研磨搗碎，采用過濾法、萃取法和蒸餾索式提取法制備花椒葉提取物。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

LB 培養(yǎng)基：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要計(jì)算所需藥品量，分別稱量，先將瓊脂加入蒸餾水加熱完全溶解，再根據(jù)培養(yǎng)基的成分在適量蒸餾水中加入酵母提取物、胰蛋白胨和NaCl，與已經(jīng)溶解的瓊脂混勻。用5 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH 至7.0，用蒸餾水定容至目標(biāo)體積，定容后分裝，將適量培養(yǎng)基分別裝入250 mL 錐形瓶中，用棉塞和牛皮紙封裝，在101.2 kPa 的高壓下蒸汽滅菌30 min，培養(yǎng)皿亦進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。

1.2.3 活化菌種與制備菌懸液

活化大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，檢查是否有雜菌污染，在超凈工作臺中涂布，在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 代，選取菌種活力最佳的菌，將活化的供試菌制備成菌懸液。

1.2.4 制備濾紙片與菌液涂布

使用打孔器打出圓形濾紙片，進(jìn)行滅菌，將濾紙片浸于花椒葉提取物中備用，接著進(jìn)行菌液涂布，將菌液加到培養(yǎng)基中，用涂布棒涂布均勻，置于恒溫箱一段時間后取出備用。

1.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

在超凈工作臺上，先用不同方法制備的花椒葉提取物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，把培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察，查看抑菌圈的大小并測量其直徑，分別用抑制作用最好的方法獲得花椒葉提取物，在不同條件（溫度、濃度和pH）下觀察花椒葉提取物對2 種菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法獲得的花椒葉提取物對2 種菌的抑制作用

由表1 可知，不同方法提取花椒葉，蒸餾索式提取法得到的花椒葉提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，其次是過濾法，最后是萃取法。萃取法得到的花椒葉提取物對大腸桿菌抑制作用最好，其次是蒸餾索式提取法，最后是過濾法。用不同方法提取的花椒葉對2 種菌的抑制作用不同，初步分析可能是菌種的類別差異所致，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，2 者的形態(tài)、構(gòu)造和生長所需的營養(yǎng)條件不同，使得2 種菌對不同方法獲得的花椒提取物抑菌成分呈現(xiàn)明顯差別[17]。

表1 不同方法獲得的花椒葉提取物對2 種菌的抑制作用

2.2 花椒葉提取物在不同濃度下對2 種菌的抑制作用

由表2 可知，當(dāng)花椒葉提取物濃度（濃度用體積百分比表示）為0%時，對2 種菌基本無抑制效果，當(dāng)花椒葉提取物濃度為50%時，對2 種菌均有較為明顯的抑制效果，當(dāng)花椒葉提取物濃度為100%時，對2 種菌抑制作用最佳。隨著花椒提取物濃度的提升對2 種菌的抑制作用也隨之增強(qiáng)，可能原因是隨著花椒提取物濃度增加，起抑制作用的有效成分隨之增加，在其他條件一致，花椒提取物濃度增加的過程中，2 種菌的抑菌圈呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。此外，在花椒提取物濃度相同的條件下，對2 種菌的抑制程度出現(xiàn)細(xì)小差異，可能原因是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在菌體結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)方式等方面的不同，引起其對抑菌有效成分反應(yīng)不同[17]。

表2 花椒葉提取物在不同濃度下對2 種菌的抑制作用

2.3 花椒葉提取物在不同pH 下對2 種菌的抑制作用

由表3 可知，當(dāng)pH 為7 或大于7 時，花椒葉提取物對2 種菌的抑制作用明顯，當(dāng)pH 小于7 時，花椒葉提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌基本無抑制作用，且對2 種菌的抑制作用差異不顯著。可能原因是pH 對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度起作用，進(jìn)一步導(dǎo)致菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，代謝反應(yīng)中酶的活性不同，從而使得2 種菌在不同pH 條件下對花椒葉提取物抑菌成分敏感程度呈現(xiàn)差異[17]。

表3 花椒葉提取物在不同pH 下對2 種菌的抑制作用

2.4 花椒葉提取物在不同溫度下對2 種菌的抑制作用

由表4 可知，溫度為20 ℃時，花椒葉提取物對2種菌的抑制作用明顯，溫度為15 ℃和25 ℃時，花椒葉提取物對2 種菌的抑制作用較明顯，且在3 個溫度下對2 種菌的抑制作用差別不顯著。初步分析導(dǎo)致不同的溫度對2 種菌的抑制作用不同，可能原因是不同的溫度下菌體的蛋白酶活性不同，同時溫度還影響菌體內(nèi)生物大分子的物理狀態(tài)，最終使得2 種菌對花椒提取物抑菌有效成分呈現(xiàn)不同的反應(yīng)，但溫度對2 種菌的抑制作用影響較小[17]。

表4 花椒葉提取物在不同溫度下對2 種菌的抑制作用

3 結(jié)論

本研究采用不同提取方法獲得花椒葉提取物，在不同條件下對2 種菌的抑制作用進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：采用蒸餾索式提取法獲得的花椒葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳，采用萃取法獲得的花椒葉提取物對大腸桿菌的抑制作用最佳。花椒葉提取物對2 種菌都有一定的抑制作用，對2 種菌來說，提取物濃度越高抑制作用越明顯；溫度影響花椒提取物對2 種菌的抑制作用，但是影響較小；此外，pH 也影響花椒提取物對2 種菌的抑制作用，中性（pH=7.0）至偏堿性（pH=7.0～10.0）條件下，花椒提取物對2 種功的抑制作用明顯，而在酸性（pH=4.0～6.0）條件下幾乎無抑制作用。

通過實(shí)驗(yàn)獲得了因提取方法不同，pH、溫度和花椒葉提取物濃度不同，對2 種菌的抑菌作用差異的相應(yīng)數(shù)據(jù)。以期將花椒葉這一副產(chǎn)物變廢為寶，為新的抑菌藥品、天然防腐劑的研發(fā)提供理論參考，來促進(jìn)花椒葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使花椒這一經(jīng)濟(jì)作物得到全面利用，擴(kuò)大花椒資源的經(jīng)濟(jì)效益[18]。