辛 寶，解方園，姚 晨，張 菁，黃婷婷，黃玉鳳

海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）第三附屬醫(yī)院藥材科，上海 200438

慈丹膠囊由莪術、牛黃、黃芪、山慈菇、蜂房、丹參、馬錢子、鴉膽子、僵蠶、當歸、冰片等中藥組成，具有消腫止痛、補中益氣、散結化瘀等功效［1］，臨床常用于原發(fā)性肝癌的輔助治療，適用于原發(fā)性肝癌瘀毒蘊結證，聯(lián)合介入化療可提高病灶緩解率。研究證實，慈丹膠囊可使原發(fā)性肝癌患者癥狀改善、免疫力提高、生存期延長［2］。慈丹膠囊所含中藥種類繁多，化學成分復雜，目前其抗肝癌的有效成分及相應的作用機制尚不清楚。

網(wǎng)絡藥理學是研究多靶點干預疾病網(wǎng)絡以期達到理想藥效的理論，基于網(wǎng)絡藥理學的分析方法特別適合復雜生物系統(tǒng)的相互作用研究，為中藥作用機制提供了一個全新的視角和解決方案［3］。本研究通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）及相關文獻收集慈丹膠囊活性成分，并在此基礎上利用藥物靶點分析平臺（Search Tool for Interactions of Chemicals，STITCH）預測慈丹膠囊可能的作用靶點，采用Cytoscape 軟件構建慈丹膠囊抗肝癌作用的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡，對這些靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析，利用注視、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（Database for Annovation, Visualization, and Integrated Discovery；DAVID）進行基因功能和信號通路分析，探討慈丹膠囊抗肝癌作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 慈丹膠囊中活性成分的篩選通過檢索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及相關文獻，分別收集慈丹膠囊中莪術、牛黃、黃芪、山慈菇、蜂房、冰片、丹參、 馬錢子、鴉膽子、僵蠶、當歸的主要化學成分，建立慈丹膠囊化學成分數(shù)據(jù)庫。在此基礎上篩選慈丹膠囊中有效的活性成分，即口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18［4］且相關文獻中報道化合物含量及相關生物功能的化學成分。

1.2 活性成分潛在作用靶點的預測通過STITCH（http://stitch.embl.de）進行分析，將活性成分輸入，選擇人類物種進行搜索。將搜索得到的靶點結果以TSV 格式進行保存，篩選其中結合得分＞0.7 的靶點。通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM；https://omim.org/）中肝細胞癌有關的基因進行比對，獲得與肝細胞癌相關的靶點。

1.3 慈丹膠囊活性成分-作用靶點網(wǎng)絡的構建根據(jù)慈丹膠囊中主要有效成分預測與肝細胞癌相關的靶點，建立活性成分與靶點之間的相互對應關系。將活性成分和作用靶點作為網(wǎng)絡中的節(jié)點，以兩者之間的相互作用作為網(wǎng)絡中的連接，導入Cytoscape 3.8.2 軟件構建慈丹膠囊活性成分-作用靶點網(wǎng)絡。

1.4 PPI網(wǎng)絡的構建 將慈丹膠囊與肝細胞癌相關的靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（http://string-bd.org），獲取蛋白質間的相互作用關系，將結果保存成TSV格式，保留文件中的節(jié)點1、節(jié)點2 和結合得分信息并導入Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制相關作用網(wǎng)絡并進行分析，保存結果。設置節(jié)點的大小和顏色反映節(jié)點度值的大小、邊的粗細反映結合得分的大小，獲得慈丹膠囊作用靶點PPI 網(wǎng)絡圖。

1.5 基因功能和信號通路分析將慈丹膠囊與肝細胞癌相關的靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov），選擇標識符為標準的基因名稱，列表類型設置為基因列表，限定物種為人，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。使用Cytoscape3.8.2 軟件對慈丹膠囊中活性成分作用靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析。

2 結 果

2.1 慈丹膠囊中活性成分的篩選通過TCMSP 從丹參、當歸、黃芪、莪術、鴉膽子、馬錢子、冰片、牛黃、山慈菇中分別收集到202、125、87、81、67、62、31、19、18 個主要的化學成分。以OB＞30%、DL＞0.18 及相關文獻報道作為篩選標準，得到活性成分24 個，其中丹參7 個（黃芩苷、谷甾醇、隱丹參酮、異歐前胡素、木犀草素、丹參新酮、丹參酮ⅡA）、黃芪6 個（樺木酸、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素）、鴉膽子3 個（谷甾醇、鴉膽子苦醇、木犀草素）、當歸2 個（豆甾醇、谷甾醇）、牛黃2 個（膽固醇、脫氧膽酸）、山慈菇2 個（豆甾醇、谷甾醇）、馬錢子1 個（豆甾醇）、冰片1 個（積雪草酸），刪除重復者后共獲得18 個活性成分。

2.2 慈丹膠囊潛在靶點的預測通過STITCH 篩選共得到100 個蛋白靶點，通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 中肝細胞癌有關的基因進行比對，共篩選出97 個可能與肝細胞癌相關的作用靶點。其中與肝細胞癌相關性得分＞20 分并且經(jīng)文獻證實的靶點有20 個，分別為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、caspase（CASP）8、AKT1、G1/S 特異性細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）、 血管內(nèi)皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、Myc 原癌基因蛋白（Myc proto-oncogene protein，MYC）、信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9、含有桿狀病毒 IAP 重復序列的蛋白5（baculoviral IAP repeatcontaining protein 5，BIRC5）、MMP2、NFE2樣 BZIP 轉錄因子 2（NFE2 like BZIP transcription factor 2，NFE2L2）、CASP3、TNF、Jun 原癌基因AP-1 轉 錄 因 子 亞 基（Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit；JUN）、CASP9、細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）1A1、ATP 結合盒亞家族B 成員11（ATP binding cassette subfamily B member 11，ABCB11）、MAPK8、MAPK3、IL-10。

2.3 慈丹膠囊活性成分-作用靶點網(wǎng)絡分析由圖1可知木犀草素、異鼠李素、樺木酸可共同作用于靶點AKT1，脫氧膽酸、谷甾醇可共同作用于靶點ABCB11，芒柄花黃素、異鼠李素、槲皮素可共同作用于靶點CYP1A1，黃芩苷、谷甾醇、木犀草素、樺木酸、芒柄花黃素可共同作用于CASP3，毛蕊異黃酮、芒柄花黃素可共同作用于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A1（uridine diphosphateglucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1），木犀草素、異鼠李素可共同作用于MAPK8，而谷甾醇可同時作用于固醇調節(jié)元件結合轉錄因子（sterol regulatory element binding transcription factor，SREBF）2、三磷酸腺苷結合盒亞家族G（ATPbinding cassette G-subfamily，ABCG）8、ABCG5、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、24-脫氫膽固醇還原酶（24-dehydrocholesterol reductase，DHCR24）、CASP3、SREBF1、ABCB11、細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、 膽 固 醇7α-羥 化 酶（cholesterol 7αhydroxylase，CYP7A）。同一靶點可對應不同的活性成分，不同靶點也可對應相同的活性成分，表明慈丹膠囊具有多成分、多靶點的作用特點。

圖1 慈丹膠囊的主要活性成分-作用靶點網(wǎng)絡圖Fig 1 Component-target network of Cidan capsule

2.4 慈丹膠囊主要活性成分潛在作用靶點PPI 網(wǎng)絡分析將慈丹膠囊主要活性成分的肝細胞癌相關靶點導入String 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質間的相互作用關系，構建的PPI 網(wǎng)絡共涉及88 個節(jié)點和467 條邊（圖2）。網(wǎng)絡分析結果顯示，度值排名靠前的有JUN、STAT3、TNF、AKT1、CASP3、MAPK3、EGFR、MYC、CCND1、細胞癌基因FOS、Toll樣受體（Toll-like receptor 4，TLR4）、VEGFA、MMP9、MAPK8、 轉 錄 因 子SP1、CYP1A1、CYP1A2、IL-10、CYP2B6、 載 脂 蛋 白B-100（apolipoprotein B-100，APOB），度 值 分 別 為33、33、30、28、25、25、22、22、18、18、18、17、17、15、15、15、15、14、14、13，提示這些靶點在網(wǎng)絡調控中起著關鍵作用，很可能是慈丹膠囊治療肝癌的關鍵靶點。

圖2 慈丹膠囊主要活性成分潛在作用靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡Fig 2 Protein-protein interaction network of potential targets of main active components of Cidan capsule

2.5 慈丹膠囊主要活性成分肝細胞癌相關靶點基因功能和信號通路分析GO 富集分析結果顯示，生物學過程中靶點數(shù)目排名靠前的依次有細胞過程、生物調控、代謝過程、對化學刺激的反應、大分子代謝過程的調控、對應激的反應、基因表達調控、小分子代謝過程、大分子生物合成過程的調控、信號通路、信號傳輸、脂質代謝過程、信號轉導、轉錄調控、氮化合物代謝過程的正向調控等，細胞組分中靶點數(shù)目排名靠前的依次是細胞內(nèi)部分、細胞器、細胞內(nèi)膜界類細胞器、細胞質、細胞內(nèi)細胞器部分、膜、核、細胞器腔、膜封閉腔、細胞核部分、細胞器膜、內(nèi)質網(wǎng)、膜部分、不溶性組分、內(nèi)膜系統(tǒng)等，分子功能中靶點數(shù)目排名靠前的依次是蛋白結合、催化活性、蛋白質二聚化活性、酶結合、同源蛋白質結合、轉移酶活性、核苷酸結合、過度金屬離子結合、DNA 結合、腺嘌呤核苷結合、嘌呤核苷結合、核苷結合、嘌呤核苷酸結合、蛋白質異二聚化活性、轉錄調節(jié)活性等。

KEGG 通路分析結果顯示，靶點數(shù)目排名靠前的是TNF、PI3K-AKT、MAPK 等信號通路（圖3）。

圖3 慈丹膠囊主要活性成分潛在作用靶點KEGG 通路富集分析結果Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of main active components of Cidan capsule

3 討 論

本研究通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫及相關參考文獻共篩選出慈丹膠囊中18 種主要的活性成分。隱丹參酮是丹參中的二萜類成分，它可激活CASP 級聯(lián)反應誘導卵巢癌細胞凋亡［5］。黃芪可通過調控肝纖維化大鼠肝臟中MAPK 信號通路上下游相關蛋白的表達抑制纖維化因子的表達，從而抑制肝纖維化［6］。以毛蕊異黃酮和芒柄花黃素為主的黃芪提取物可通過PI3K-AKT 信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖［7］。鴉膽子提取物可通過抑制miRNA-95的表達誘導肝癌細胞凋亡［8］。當歸補血湯加味能明顯改善肝纖維化患者的肝功能、抑制肝膠原纖維合成，從而阻止肝纖維化發(fā)展至肝硬化［9］。牛黃中的熊去氧膽酸能促進正常大鼠膽汁中膽紅素、總膽汁酸的分泌［10］，降低膽汁中膽固醇的含量，并降低血清中膽紅素、總膽汁酸、膽固醇水平［11］，有利于膽結石患者的膽固醇結石逐漸溶解。山慈菇含藥血清能明顯抑制肝癌細胞的生長、誘導凋亡，抑制其上皮間質轉化［12］。馬錢子堿對結腸癌細胞HT-29 活性有較強的抑制作用［13］。

本研究結果表明慈丹膠囊活性成分可作用于100 個蛋白靶點，其中97 個作用靶點可能與肝細胞癌相關，活性成分-作用靶點網(wǎng)絡顯示慈丹膠囊具有多成分、多靶點的抗肝癌作用特點。PPI 網(wǎng)絡顯示慈丹膠囊靶蛋白間存在著相互作用，是復雜交互的網(wǎng)絡，并不是單獨起作用。靶點的GO 分析結果表明，慈丹膠囊的抗肝癌作用涉及細胞過程、生物調控、代謝過程、對化學刺激的反應等生物學過程，細胞內(nèi)部分、細胞器、細胞內(nèi)膜界類細胞器、細胞質等細胞組分，以及蛋白質結合、催化活性、蛋白質二聚化活性、酶結合等分子功能，是一個復雜的過程。KEGG 通路分析分析結果顯示，慈丹膠囊抗肝癌的靶點主要涉及TNF、PI3K-AKT、MAPK 等信號通路。

慈丹膠囊活性成分與肝細胞癌相關的靶點中，PPI 網(wǎng)絡分析結果度值排名前20、與肝細胞癌的相關性得分＞20 分并且有文獻證實條件的基因共有14 個， 分 別 為JUN、STAT3、TNF、AKT1、CASP3、MAPK3、EGFR、MYC、CCND1、VEGFA、MMP9、MAPK8、CYP1A1、IL-10，慈丹膠囊可能主要通過作用于以上靶點實現(xiàn)其抗肝癌作用。CASP3 在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用。匹伐他汀可依賴于人肝細胞癌細胞中的CASP3 通路誘導癌細胞凋亡［14］。EGFR 是一種細胞表面蛋白，它可與表皮生長因子結合誘導受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，從而促進細胞增殖。EGFR的擴增和突變已被證明是許多類型癌癥的驅動因素。在肝癌患者中EGFR 與腫瘤的大小和組織分化相關，是肝癌預后的危險因素［15］。CCND1 屬于高度保守的細胞周期蛋白家族。細胞增殖的調控事件主要發(fā)生在細胞周期的G1期，G1期細胞周期蛋白的異常表達與腫瘤發(fā)生有關。有研究者分析了CCND1 異常表達在肝細胞癌中的作用，發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌后期CCND1 表達下調［16］。MYC 是一種多功能的核磷蛋白，在細胞周期進程、細胞凋亡和細胞轉化中發(fā)揮作用。有研究檢測肝細胞癌和正常肝細胞中的p21ras、c-MYC 和p53，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質參與了人類肝癌的發(fā)生［17］。VEGFA 是血小板源性生長因子/血管內(nèi)皮生長因子家族的成員。血管生成對于實體瘤的發(fā)展和進展至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA 是參與肝細胞癌血管生成的重要因素之一，甚至可能參與了肝細胞癌本身的發(fā)生和進展［18］。MMP2 與MMP9 是MMP家族的成員，該家族成員參與正常生理及疾病過程中細胞外基質的分解。研究發(fā)現(xiàn)，MMP1和MMP2過表達與腫瘤去分化相關，表明MMP 與肝細胞癌的侵襲密切相關［19］。CYP 家族成員可催化涉及藥物代謝及膽固醇、類固醇和其他脂質合成的許多反應，研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌中 CYP1A1 蛋白表達下調［20］。STAT 能與DNA 結合，參與細胞增殖、分化、遷移和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)STAT 的過度表達可能是肝細胞癌的一個重要特征［21］。JUN 是一種與病毒蛋白高度相似的蛋白質，可直接與特定的靶DNA 序列相互作用以調節(jié)基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌腫瘤組織中c-Jun、JunD 和 AP-1 的表達比鄰近非腫瘤組織升高［22］。IL-10 是一種細胞因子，主要由單核細胞產(chǎn)生，在免疫調節(jié)和炎癥反應中具有多效性。研究表明，IL-1、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22、IL-35 和 IL-37 通過調節(jié)細胞信號通路參與多種肝臟疾病的進展［23］。

慈丹膠囊篩選得到的蛋白靶點富集的通路中，PI3K-AKT 信號通路在調節(jié)細胞存活、胰島素信號、血管生成和腫瘤形成中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)AKT1 的減少可誘導肝細胞癌細胞凋亡［24］，還發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號通路在阿帕替尼發(fā)揮放射增敏治療肝細胞癌中發(fā)揮關鍵作用［25］。TNF 信號通路參與多種生物學過程的調節(jié)，包括細胞增殖、分化、凋亡，以及脂質代謝與凝血過程。研究顯示TNF 的遺傳變異與HBV 的清除有關［26］。lncRNA SPRY4-IT1 可通過介導TNF 信號通路促進肝細胞癌細胞的增殖和遷移［27］。MAPK 信號通路參與調節(jié)細胞增殖、分化和細胞周期進程等。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK3 活性在P-糖蛋白介導的多重耐藥肝癌細胞中下調，同時MAPK3 可能是規(guī)避多重耐藥肝癌細胞的潛在藥物靶點［28］。Linc00601 通過激活MAPK 信號通路促進肝細胞癌發(fā)展［29］。慈丹膠囊活性成分可能通過作用于以上靶點及信號通路，實現(xiàn)其抗肝癌作用。

綜上所述，網(wǎng)絡藥理學分析顯示慈丹膠囊的18種活性成分作用于97 個與肝細胞癌相關的蛋白靶點，其中與肝細胞癌關系密切的蛋白靶點有14 個，慈丹膠囊可能通過這些靶點的相互作用及TNF、PI3K-AKT、MAPK 等信號通路改善肝癌患者的癥狀，實現(xiàn)其抗肝癌作用。慈丹膠囊對肝癌的作用機制涉及多個生物學過程、分子和通路，體現(xiàn)了慈丹膠囊多成分、多靶點、多途徑的作用特點。