謝文杰，雷坤陽，孫 庭

南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006

腎細胞癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，其中腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）最常見且具有發(fā)病率高、生存期短等特點。近年來，隨著外科技術的進步，越來越多的早期ccRCC 患者在手術切除腫瘤后長期存活［1］。晚期ccRCC 患者往往失去了手術機會，并且對放射治療和化學治療不敏感，因此在晚期ccRCC 的治療中靶向治療十分重要［2-3］。

lncRNA 是一類不包含任何開放閱讀框的長度大于200 bp 的RNA［4］。盡管lncRNA 不編碼蛋白質，但它卻是生物體內多種生物學過程中不可缺少的調節(jié)因子［5］。已有許多研究表明，lncRNA 與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有非常密切的聯(lián)系［6-7］。多項研究表明lncRNA 在ccRCC 的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，它可通過多種機制促進ccRCC 細胞在體內外的增殖、遷移及侵襲［8-9］。LINC00342 是一種長鏈基因間非編碼RNA，最早在2016 年被報道［10］。目前有關LINC00342 的研究并不少見，例如，有研究發(fā)現(xiàn)LINC00342 可以促進結直腸癌和非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展［11-12］。然而，LINC00342 在ccRCC 中的作用及其機制尚未見報道。本研究旨在探索LINC00342 在ccRCC 中的作用及其分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1 基因表達譜動態(tài)分析（GeneExpression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數據庫分析 通過GEPIA 數據庫分析523 例ccRCC 組織及100 例癌旁組織中LINC00342 的表達水平，并分析513 例ccRCC 樣本（257 例高表達，256 例低表達）中LINC00342 的表達水平與患者生存率的關系。

1.2 臨床標本的獲取65 例ccRCC 組織及配對的癌旁組織來源于2020 年1 月至2021 年1 月在南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科接受腎癌根治術的患者，所有標本均經病理診斷為ccRCC，患者術前均未接受過放射治療和化學治療，組織標本采集后立即放入液氮，后轉移至－80 ℃冰箱內保存供后續(xù)實驗用。本研究通過南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者均知情同意。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染人正常腎小管上皮細胞系（HK-2） 及5 種 人ccRCC 細 胞 系（786-O、A498、ACHN、OS-RC-2、769-P）均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。細胞用含有10% FBS（美國Gibco 公司）和1%青霉素-鏈霉素混合液的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。待細胞生長至融合度為30%～50%時，用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen 公司）進行轉染。轉染分組如下：siRNA 組（轉染si-LINC00342）、陰性對照（negative control，NC）組（轉染LINC00342-NC）和空白對照組。轉染所需的si-LINC00342、LINC00342-NC均購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.4 qPCR檢測LINC00342和miRNA-384表達采用TRIzol 試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）提取組織及細胞中的RNA，用反轉錄試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）合成cDNA，并進行PCR擴增。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃15 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。以β-肌動蛋白及U6作為內參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of primers

1.5 CCK-8檢測細胞增殖能力 將消化、離心并重懸后的細胞按照每孔2×103個細胞的密度接種至96 孔板中，培養(yǎng)0、24、48、72 h 時在每孔內分別加入10 μL CCK-8 試劑（武漢賽維爾生物科技有限公司），在37 ℃條件下孵育2～4 h，用酶標儀測定450 nm 波長處的光密度（D450）值。

1.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力將細胞均勻地接種至6 孔板中，待細胞融合度達到80%時，用槍頭在每孔中做一“十”字劃痕，PBS 清洗后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，于0 h 和24 h 時在顯微鏡下拍照，并計算細胞遷移距離百分比。細胞遷移距離百分比=（各轉染組0 h 劃痕寬度－各轉染組24 h 劃痕寬度）/（空白對照組0 h 劃痕寬度－空白對照組24 h 劃痕寬度）×100%。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 事先在Transwell 小室的上室中涂抹基質膠（美國Corning公司），待其凝固后備用。在下室中加入600 μL含20% FBS 的培養(yǎng)基，放入Transwell 小室。將細胞常規(guī)消化、離心后用無血清培養(yǎng)基重懸，在上室中加入200 μL 含2×104個細胞的細胞懸液。培養(yǎng)24 h 時用棉簽將上室擦洗干凈，用甲醇固定，0.1%結晶紫染色。風干后在顯微鏡下拍照、計數。

1.8 蛋白質印跡法檢測上皮間質轉化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）通路相關蛋白的表達 用RIPA 裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司）裂解細胞后提取蛋白質，用BCA 法檢測所提取蛋白質的濃度。用SDS-PAGE 分離蛋白質，并轉移至PVDF 膜上。將PVDF 膜與波形蛋白（vimentin）、神經鈣黏素（N-cadherin）和上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體（英國Abcam 公司）孵育過夜后，再與二抗（英國Abcam 公司）孵育1 h，最后用顯影液（武漢賽維爾生物科技有限公司）對PVDF 膜進行成像，分析各條帶的灰度值。

1.9 LINC00342下游靶分子的預測及驗證 利用Starbase 網站和LncBook 數據庫預測LINC00342 的下游靶分子，并通過qPCR 驗證其表達，然后預測LINC00342 與miRNA-384 的結合位點，設計并合成LINC00342 的野生型（wild type，WT）和突變型（mutation，Mut）結合位點，構建目的質粒及陰性對照質粒。使用轉染試劑［漢恒生物科技（上海）有限公司］將LINC00342-WT 和LINC00342-Mut 的目的質粒分別與miRNA-384 mimic 和NC mimic［漢恒生物科技（上海）有限公司］共轉染細胞，轉染48 h 后，使用雙螢光素酶報告基因實驗檢測系統(tǒng)檢測螢光素酶的活性。螢光素酶活性計算方法如下：螢光素酶活性＝螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學處理使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖及進行統(tǒng)計學分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。呈偏態(tài)分布的計量資料以中位數表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以例數和百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。生存率的比較采用log-rank 檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 LINC00342在ccRCC 組織及細胞中的表達及其臨床意義 GEPIA 數據庫分析結果顯示，與癌旁組織相比，LINC00342 在ccRCC 組織中高表達（P＜0.05），并且LINC00342 高表達的患者總生存率低于低表達的患者（P＝0.001 8，圖1）。qPCR檢測結果顯示，與癌旁組織和HK-2 細胞相比，LINC00342 在ccRCC 組織和5 種ccRCC 細胞系中均呈高表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05，圖2）。LINC00342 在ccRCC 細 胞 系786-O 和OS-RC-2 中表達最高，因此選擇這2 種細胞系用于后續(xù)實驗。根據LINC00342 表達的中位數（8.396），將65 例ccRCC 患者分為高表達組（n＝32）和低表達組（n＝33）。結果顯示，LINC00342 高表達的ccRCC 患者腫瘤直徑更大、臨床分期更晚（P均＜0.05，表2）。

表2 ccRCC 組織中LINC00342 的表達與患者臨床病理學特征之間的關系Tab 2 Relationship between LINC00342 expression in ccRCC tissues and clinicopathological features of patients n (%)

圖1 LINC00342 在ccRCC 組織中的表達及其與患者總生存率的關系Fig 1 Expression of LINC00342 in ccRCC tissues and its relationship with overall survival rate

圖2 LINC00342 在ccRCC 組織及細胞系中的表達水平Fig 2 Expression of LINC00342 in ccRCC tissues and cell lines

2.2 LINC00342對ccRCC 細胞增殖、遷移及侵襲的影響 CCK-8 實驗結果顯示，利用siRNA 沉默LINC00342 能夠抑制786-O 和OS-RC-2 細胞的增殖能力（P均＜0.05，圖3）。劃痕愈合實驗結果顯示，沉默LINC00342 可使786-O 和OS-RC-2細胞的遷移能力減弱（P均＜0.05，圖4）。Transwell實驗結果顯示，siRNA 組786-O 和OS-RC-2 細胞的侵襲能力低于NC 組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05，圖5）。

圖3 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細胞增殖Fig 3 Silencing of LINC00342 inhibits proliferation of ccRCC cells

圖4 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細胞的遷移Fig 4 Silencing of LINC00342 inhibits migration of ccRCC cells

圖5 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細胞的侵襲Fig 5 Silencing of LINC00342 inhibits invasion of ccRCC cells

2.3 LINC00342對ccRCC 細胞EMT 的影響 蛋白質印跡法檢測結果顯示，沉默LINC00342 可使786-O 和OS-RC-2 細胞中波形蛋白和神經鈣黏素的表達下調，上皮鈣黏素的表達上調（P均＜0.05，圖6）。提示LINC00342 可能通過調節(jié)EMT 進程促進ccRCC 細胞的遷移及侵襲。

圖6 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細胞中EMT 相關蛋白的表達Fig 6 Silencing of LINC00342 inhibits expression of EMT-associated proteins in ccRCC cells

2.4 LINC00342促進ccRCC 細胞惡性表型的機制 生物信息學分析結果顯示，miRNA-384、miRNA-545-5p 和miRNA-19a-3p 可能是LINC00342的下游靶分子（圖7A）。qPCR 結果顯示，沉默LINC00342可使786-O和OS-RC-2細胞中miRNA-384的表達升高（P均＜0.05，圖7B）。雙螢光素酶報告基因實驗顯示，在786-O 和OS-RC-2 細胞中，miRNA-384 mimic 與LINC00342-WT 共 轉 染 后 螢光素酶活性均下降（P均＜0.05），而miRNA-384 mimic 與LINC00342-Mut 共轉染后螢光素酶活性沒有出現(xiàn)明顯下降（P均＞0.05，圖7C～7E），說明miRNA-384 是LINC00342 的下游靶分子。

圖7 miRNA-384 是LINC00342 的靶分子Fig 7 miRNA-384 was a target gene for LINC00342

3 討 論

人類基因組測序結果顯示，編碼蛋白質的RNA只占一小部分，大部分RNA 都是非編碼RNA，其中l(wèi)ncRNA 由于涉及多種生物學機制并且與多種腫瘤密切相關［13］，各國學者一直熱衷于對其進行深入研究。隨著靶向治療的問世，針對腎癌的靶向治療藥物逐漸增多，然而其臨床效果目前尚不能令人滿意，探索lncRNA 在ccRCC 中的作用具有至關重要的意義［14］。本研究在初始階段對GEPIA 數據庫中的數據進行了分析，發(fā)現(xiàn)LINC00342 在ccRCC組織中高表達，并且其高表達與患者生存率降低有關，因此將LINC00342 作為研究對象。

本研究采用qPCR 檢測了65 對ccRCC 組織及癌旁組織、5 種ccRCC 細胞系中LINC00342 的表達量，發(fā)現(xiàn)LINC00342 在ccRCC 組織及細胞系的表達升高，并且其高表達與腫瘤直徑大、臨床分期晚有關。為了驗證LINC00342在ccRCC中的作用，本研究進行了一系列體外實驗，CCK-8 實驗、劃痕愈合實驗和Transwell 實驗結果顯示，LINC00342可以促進ccRCC 細胞的增殖、遷移及侵襲。既往研究發(fā)現(xiàn)LINC00342 在非小細胞肺癌中高表達，并且可以促進肺癌細胞的增殖、遷移及侵襲［11］。LINC00342 在大腸癌中不僅具有促進細胞增殖的作用，還可阻斷細胞周期、抑制細胞的凋亡［12,15］。因此，LINC00342 可能與腫瘤惡性行為密切相關。

EMT 通常是指上皮細胞在經歷多種變化后呈現(xiàn)出間質細胞表型，包括遷移能力、侵襲性和抗凋亡能力的增加，以及大量細胞外基質成分的形成［16］。EMT 的特征是上皮標志物下調、間質標志物上調、基底膜降解、細胞向間質遷移［17］。大多數腫瘤的進展往往伴隨著EMT 的發(fā)生，EMT 在惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移過程中起著至關重要的作用。多項研究表明，lncRNA 可以通過作用于EMT 對腫瘤的進展產生影響［18-19］。本研究中蛋白質印跡法檢測結果顯示，沉默LINC00342 可使ccRCC 細胞中波形蛋白和神經鈣黏素表達下調、上皮鈣黏素表達上調。由此可以推斷，LINC00342 對ccRCC 進展的影響可能與EMT 有關。

miRNA-384 是一種非編碼小RNA，研究表明其參與調控多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。miRNA-384 在膠質瘤中表達下調，上調其表達能抑制膠質瘤細胞的增殖并促進凋亡［20］。miRNA-384還可以抑制非小細胞肺癌細胞增殖［21］。在ccRCC中，miRNA-384 可靶向RAS 癌基因家族成員RAB23 來抑制細胞的增殖和遷移［22］。本研究采用雙螢光素酶報告基因實驗驗證了miRNA-384和LINC00342 之間的靶向關系，發(fā)現(xiàn)miRNA-384是LINC00342 的下游靶分子之一，LINC00342 對ccRCC 細胞惡性表型的調節(jié)作用可能是通過靶向miRNA-384 而實現(xiàn)的。

本研究的不足之處有以下幾點。首先，本研究采集的組織樣本量較小，這可能使研究結論的可靠性下降；其次，由于條件有限，本研究沒有進行在體實驗；最后，本研究沒有就miRNA-384 發(fā)揮作用的下游機制進行深入研究。

綜上所述，LINC00342 在ccRCC 組織中表達上調，且與不良的臨床病理學結果相關。LINC00342可以促進ccRCC 細胞的惡性表型，miRNA-384 是LINC00342 的下游靶分子之一。