況 欽，吳 勇，杜 彬，毋 楠，周夢(mèng)瑤，楊鑫 ，盧 楊，馮 濤

重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院、重慶市生化與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016

HBV 感染是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在我國(guó)，約85%的肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者有HBV 感染史［1］。與未感染人群相比，慢性HBV 攜帶者患HCC 的終身風(fēng)險(xiǎn)要高15～25倍［2-3］。HBV-HCC 具有起病隱匿、病程進(jìn)展迅速、缺乏治愈方法等特點(diǎn)，是預(yù)后極差的惡性腫瘤之一。乙型肝炎病毒X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）是HBV 發(fā)揮作用的核心功能蛋白，在HBV-HCC 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［4］。

miRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)約19～24 nt 的內(nèi)源非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物及各種微生物中。它可以通過(guò)完全或不完全匹配的方式識(shí)別并結(jié)合靶基因的3＇-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控效應(yīng)，進(jìn)而參與早期胚胎發(fā)育及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)［5-6］。miRNA 的突變、缺失或表達(dá)異常與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，HBx 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA 影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲、自噬、炎癥等多種生物學(xué)過(guò)程，從而促進(jìn)HBV-HCC 的發(fā)展［9-12］。

本課題組前期利用小鼠永生化肝前體細(xì)胞構(gòu)建了能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)HBx 且免疫系統(tǒng)正常的小鼠模型，且在360 d 的模型小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)了癌變組織［13-14］。本研究以miRNA 為著眼點(diǎn)，利用腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析肝癌組織中差異表達(dá)的miRNA，并選擇性檢測(cè)了miRNA-544-3p 在穩(wěn)定表達(dá)HBx 的永生化肝前體細(xì)胞中和小鼠模型體內(nèi)的表達(dá)情況，進(jìn)一步通過(guò)干擾miRNA-544-3p 以探究細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化和靶向調(diào)控機(jī)制，為HBV-HCC 的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和小鼠小鼠永生化肝前體細(xì)胞株14-19 由美國(guó)芝加哥大學(xué)分子腫瘤研究中心惠贈(zèng)，該細(xì)胞株細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，體積較小，呈多邊形，核質(zhì)比例高，增殖旺盛，誘導(dǎo)后可分化為成熟的肝細(xì)胞，且連續(xù)傳代50 代細(xì)胞特性無(wú)明顯改變［13］。含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株EGFP-14-19 及 含HBx 和EGFP 的 慢 病 毒 穩(wěn) 轉(zhuǎn)細(xì)胞株HBx-EGFP-14-19 由本課題組前期構(gòu)建并保存［13-14］。

6～8 周齡雄性昆明小鼠購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2018-0003］，體重25 g 左右，代養(yǎng)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.2 主要試劑DMEM（美國(guó)Gibco 公司）；FBS［賽爾博克斯生物制品（香港）貿(mào)易有限公司］；超純總RNA 提取試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；SYBR Green qPCR Mix 試劑盒（美國(guó)Bimake 公司）；兔抗小鼠HBx 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；兔抗小鼠二磷酸腺苷核糖基化因子6（adenosine diphosphate ribosylation factor 6，Arf6）抗體（上海泊灣生物科技有限公司）；兔抗小鼠Akt 抗體、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗體、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 抗 體、 磷 酸 化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）抗體及GAPDH 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、HRP 標(biāo)記的二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL 顯影液（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；EndoFectinTM-Max 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)GeneCopoeia公司）；miRNA-544-3p模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）、激動(dòng)劑（agomir）、拮抗劑（antagomir）及各自的陰性對(duì)照（negative control，NC）均購(gòu)自上海吉熒生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將凍存于液氮的細(xì)胞取出后于37 ℃水浴中快速解凍、離心后棄上清，加入1 mL 含10% FBS 的DMEM，吹打混勻后均勻滴在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后換液。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞接種于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后分為空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組、miRNA-544-3p mimic 組、miRNA-544-3p NC-inhibitor 組、miRNA-544-3p inhibitor 組，其中空白對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其他4 組分別進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染。所有轉(zhuǎn)染均按照EndoFectinTM-Max 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物模型構(gòu)建雄性昆明小鼠45 只，隨機(jī)分為生理鹽水組（n＝5）、EGFP-14-19 組（n＝5）和HBx-EGFP-14-19 組（n＝35）。小鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后置于超凈臺(tái)中，取仰臥位，腹部經(jīng)乙醇消毒后在劍突下行2 cm縱向切口，打開(kāi)腹腔。用濕潤(rùn)棉簽掀起肝葉，暴露肝門(mén)靜脈。按分組情況分別從肝門(mén)靜脈注入生理鹽水（200 μL）、EGFP-14-19 或HBx-EGFP-14-19細(xì)胞懸液（200 μL，含5×105個(gè)細(xì)胞，提前消化在PBS 中），止血完畢后，關(guān)腹縫合。術(shù)后小鼠自由飲水進(jìn)食。

HBx-EGFP-14-19 模型組取20 只隨機(jī)分為4 個(gè)亞 組（n＝5），分 別 于 造 模 后30、90、180、360 d 腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，將小鼠置于高濃度一氧化碳環(huán)境中處死。取小鼠肝臟儲(chǔ)存于－80 ℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另取HBx-EGFP-14-19 組剩余15 只小鼠（于造模后30 d 處死）隨機(jī)分為5 個(gè)亞組（n＝3），于處死前1 周經(jīng)尾靜脈分別注射生理鹽水、miRNA-544-3p NC-agomir、miRNA-544-3p agomir、miRNA-544-3p NC-antagomir、miRNA-544-3p antagomir。給藥1 周后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，置于高濃度一氧化碳環(huán)境中處死。取小鼠肝臟儲(chǔ)存于－80 ℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 生物信息學(xué)分析利用TargetScan 生物信息學(xué)網(wǎng)站（https://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測(cè)miRNA-544-3p 的靶基因。

1.6 qPCR檢 測(cè)miRNA-544-3p 和 目 的 基 因 的表達(dá) 采用TRIzol 法提取細(xì)胞和小鼠肝組織中總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)ThermoFisher 公司）進(jìn)行RNA 濃度和純度檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)與合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。引物序列：HBx正 向 引 物5＇-TGCGGACGACCCTTCTCGGG-3＇，反 向 引 物5＇-GGGCAACATTCGGTGGGCGT-3＇；miRNA-544-3p 正 向 引 物5＇-AGGGGATTCTGCATTTTTAGC-3＇，反向引物5＇-GTTGTGGTTGGTTGTTTGT-3＇；Arf6正 向 引 物5＇-GTCTGATCTTCGTGGTAGACTG-3＇，反向引物5＇-CTCATCTCCCGGTCATTGATAA-3＇；U6正向引物5＇-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3＇，反向引物5＇-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3＇；GAPDH正 向 引 物5＇-CTCGTCCCGTAGACAAAATGGT-3＇，反向引物5＇-GAGGTCAATGAAGGGGTCGTT-3＇。按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)分離細(xì)胞和小鼠肝組織中總蛋白并煮沸變性，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每組取30 μg 蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，在脫脂奶粉溶液中封閉2 h 后，放入一抗中于4 ℃孵育過(guò)夜，再在HRP 標(biāo)記的二抗中室溫孵育2 h，加入ECL 顯影液并在顯影儀中觀(guān)察目的蛋白的表達(dá)。采用ImageJ 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肝組織中HBx的表達(dá) 將新鮮肝組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片后按照S-P 法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀(guān)察并拍照。

1.9 H-E染色觀(guān)察小鼠肝組織病理學(xué)改變 取造模后360 d 處死的小鼠肝組織，固定、切片，常規(guī)進(jìn)行H-E 染色，用中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀(guān)察并拍照。

1.10 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，用1 000 μL 槍頭在培養(yǎng)孔中劃痕，每孔劃3 條。用PBS洗滌3 次以除去漂浮的細(xì)胞。分別于培養(yǎng)0 h 和24 h 拍照，用ImageJ 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。細(xì)胞劃痕愈合率（%）＝（A0h－A24h）/A0h×100%，其中A0h為0 h 時(shí)的劃痕面積，A24h為培養(yǎng)24 h 時(shí)的劃痕面積。

1.11 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，分別取2×104個(gè)細(xì)胞均勻接種于各Transwell 小室上室中（含200 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基），下室加入750 μL 含20% FBS 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后吸去培養(yǎng)基，將小室放入PBS中洗滌2 次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min；用0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，PBS 洗滌2 次后用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)的細(xì)胞。在顯微鏡下觀(guān)察，隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠與不含血清的培養(yǎng)基以1 ∶10 的比例稀釋?zhuān)鱐ranswell 小室中均加入70 μL 稀釋膠，凝固后接種細(xì)胞，后續(xù)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠永生化肝前體細(xì)胞中HBx的表達(dá) qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中HBxmRNA 相對(duì)表達(dá)量為11 922.37±2 496.61，高于14-19 細(xì)胞（相對(duì)表達(dá)量為0.52±1.17）和EGFP-14-19 細(xì)胞（相對(duì)表達(dá)量為0.20±0.95），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，只有HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中有HBx 表達(dá)（圖1），證明HBx在14-19 細(xì)胞中表達(dá)成功。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)永生化肝前體細(xì)胞14-19 中HBx 的表達(dá)Fig 1 Expression of HBx in immortalized liver precursor cells 14-19 detected by Western blotting

2.2 動(dòng)物模型的鑒定

2.2.1 小鼠肝組織中HBx的表達(dá) qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后30、90、180、360 d 肝組織中HBxmRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為94.56±43.09、211.66±37.75、176.61±61.44、170.13±97.75，均高于生理鹽水組（相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.19）和EGFP-14-19 組（相對(duì)表達(dá)量為0.93±0.25），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后30、90、180、360 d 肝組織中均有HBx 蛋白表達(dá)（圖2）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后30、90、180、360 d 肝組織中均可見(jiàn)HBx 陽(yáng)性染色（圖3）。上述結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的小鼠模型能持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)HBx。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)小鼠肝組織中HBx 的表達(dá)Fig 2 Expression of HBx in mouse liver tissues detected by Western blotting

圖3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠肝組織中HBx 的表達(dá)Fig 3 Expression of HBx in mouse liver tissues detected by immunohistochemical staining

2.2.2 小鼠肝組織腫瘤鑒定HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后360 d 處死時(shí)，肝組織可見(jiàn)腫瘤生成（圖4A）。H-E 染色結(jié)果（圖4B）顯示肝細(xì)胞排列異常，呈多行排列；有的細(xì)胞增大，且核仁偏大，核質(zhì)分布異常，核仁明顯；有的細(xì)胞呈多核，肝組織結(jié)構(gòu)消失。結(jié)果表明小鼠肝組織整體呈現(xiàn)壞死狀態(tài)，病灶處呈纖維化，證明小鼠肝臟發(fā)生惡性腫瘤病變。

圖4 小鼠肝組織腫瘤形成和H-E 染色結(jié)果Fig 4 Formation of mouse liver tumor and H-E staining results

2.3 HBx 對(duì)小鼠永生化肝前體細(xì)胞和小鼠肝組織中miRNA-544-3p表達(dá)的影響14-19 細(xì)胞、EGFP-14-19細(xì)胞和HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞miRNA-544-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為1.66±0.36、1.29±0.23、0.63±0.11，HBx-EGFP-14-19 細(xì) 胞miRNA-544-3p 表 達(dá) 水 平 較14-19 細(xì)胞、EGFP-14-19 細(xì)胞降低（P均＜0.05）。生理鹽水組、EGFP-14-19 組小鼠肝組織中miRNA-544-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為1.31±0.31、1.27±0.36，HBx-EGFP-14-19 組 小 鼠 造 模 后30、90、180、360 d 肝組織中miRNA-544-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為0.70±0.12、0.62±0.13、0.72±0.24、0.85±0.24，HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)肝組織中miRNA-544-3p 表達(dá)均下調(diào)（P均＜0.05）。結(jié)果表明HBx 可在體內(nèi)外將miRNA-544-3p 的表達(dá)維持在較低水平。

2.4 HBx 對(duì)小鼠永生化肝前體細(xì)胞和小鼠肝組織中Arf6水平及Akt-mTOR通路的影響TargetScan預(yù) 測(cè) 結(jié) 果 顯 示，Arf6為miRNA-544-3p 的 靶 基因。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，14-19 細(xì)胞、EGFP-14-19 細(xì) 胞、HBx-EGFP-14-19 細(xì) 胞 中Arf6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.06±0.05、0.91±0.04、1.88±0.14，HBx-EGFP-14-19 細(xì) 胞 中Arf6 蛋白表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05，圖5A）；生理鹽水組、EGFP-14-19 組小鼠肝組織中Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.70±0.21、0.70±0.51，HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后30、90、180、360 d 肝組織中Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.09±0.37、1.27±0.69、1.11±0.11、1.10±0.25，HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)肝組織中Arf6 表 達(dá) 均 上 調(diào)（P均＜0.05，圖5B）。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中Arf6mRNA 相對(duì)表達(dá)量（1.02±0.05）高于14-19 細(xì)胞（0.29±0.26）和EGFP-14-19 細(xì)胞（0.30±0.30），HBx-EGFP-14-19 組 小 鼠 造 模 后30、90、180、360 d 肝組織中Arf6mRNA 相對(duì)表達(dá)量（分別為1.40±0.40、1.55±0.14、1.36±0.29、1.62±0.20）均高于生理鹽水組（0.67±0.21）和EGFP-14-19組（0.73±0.11，P均＜0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.86±0.19）高于14-19細(xì)胞（0.57±0.31）和EGFP-14-19 細(xì)胞（0.43±0.37）（P均＜0.05），Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.93±0.27）與14-19細(xì)胞（0.90±0.28）和EGFP-14-19細(xì)胞（0.86±0.26）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量（1.84±0.38）高于14-19 細(xì)胞（1.00±0.36）和EGFP-14-19 細(xì)胞（1.10±0.71，P均＜0.05），mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量（1.17±0.26）與14-19 細(xì)胞（1.19±0.16）和EGFP-14-19 細(xì)胞（1.10±0.11）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖5C）。HBx-EGFP-14-19組小鼠造模后30、90、180、360 d 肝組織中p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量（分別為0.60±0.37、0.73±0.50、0.68±0.44、0.82±0.49） 均 高 于 生 理 鹽 水 組（0.24±0.47）和EGFP-14-19 組（0.39±0.26，P均＜0.05），Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量（分別為0.79±0.43、0.90±0.30、0.69±0.27、0.87±0.38）與 生 理 鹽 水組（0.79±0.58） 和EGFP-14-19 組（0.81±0.39）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；HBx-EGFP-14-19 組小鼠造模后30、90、180、360 d 肝組織中p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量（分別為1.93±0.55、2.43±0.75、2.11±0.69、1.90±0.62）均高于生理鹽水組（1.25±0.41）和EGFP-14-19 組（1.09±0.57，P均＜0.05），mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量（分別為1.81±0.47、1.80±0.56、1.87±0.53、1.91±0.40）與 生 理鹽水組（1.74±0.36）和EGFP-14-19 組（1.68±0.54）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖5D）。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組小鼠永生化肝前體細(xì)胞14-19 和小鼠肝組織中Arf6、Akt、mTOR 的表達(dá)Fig 5 Expression of Arf6, Akt, and mTOR in immortalized liver precursor cells 14-19 and liver tissues of mice in each group detected by Western blottingA: The expression of Arf6 protein in 14-19 cells; B: The expression of Arf6 protein in the liver tissues of mice; C: The expression

2.5 miRNA-544-3p轉(zhuǎn)染效率 空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組和miRNA-544-3p NCinhibitor 組HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中miRNA-544-3p相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為0.16±0.03、0.16±0.05 和0.11±0.06；與對(duì)照組相比，miRNA-544-3p mimic組HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中miRNA-544-3p 相對(duì)表達(dá)量升高（4.13±2.07），miRNA-544-3p inhibitor組HBx-EGFP-14-19 細(xì) 胞 中miRNA-544-3p 相 對(duì)表達(dá)量降低（0.02±0.01，P均＜0.05）。這表明轉(zhuǎn)染miRNA-544-3p mimic 可上調(diào)miRNA-544-3p的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染miRNA-544-3p inhibitor 可下調(diào)miRNA-544-3p 的表達(dá)水平。

2.6 miRNA-544-3p對(duì)HBx-EGFP-14-19 細(xì) 胞 遷 移和侵襲能力的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6A）顯示，空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組和miRNA-544-3p NC-inhibitor 組HBx-EGFP-14-19細(xì)胞劃痕愈合率分別為（59.13±8.83）%、（62.71±10.74）%、（56.59±11.25）%；與對(duì)照組相比，miRNA-544-3p mimic 組細(xì)胞劃痕愈合率 降 低［（38.25±4.71）%］， 而miRNA-544-3p inhibitor 組 細(xì) 胞 劃 痕 愈 合 率 增 高［（80.45±20.29）%，P均＜0.05］。Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6B）顯示，空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組 和miRNA-544-3p NC-inhibitor 組 穿 透小室濾膜的HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞數(shù)量分別為504.33±64.49、482.33±75.87 和486.67±77.53；與對(duì)照組相比，miRNA-544-3p mimic組穿透小室濾膜的細(xì)胞數(shù)量減少（97.33±7.02），而miRNA-544-3p inhibitor 組穿透小室濾膜的細(xì)胞數(shù)量增加（823.67±23.35，P均＜0.05）。Transwell 細(xì) 胞 侵 襲 實(shí) 驗(yàn)結(jié)果（圖6B）顯示，空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組和miRNA-544-3p NC-inhibitor 組穿透基質(zhì)膠與小室濾膜的HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞數(shù)量分別為221.67±14.22、226.00±11.53 和223.33±11.37；相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p mimic 組穿透基質(zhì)膠與小室濾膜的細(xì)胞數(shù)量減少（40.33±4.04），而miRNA-544-3p inhibitor 組穿透基質(zhì)膠與小室濾膜的細(xì)胞數(shù)量增加（384.00±29.87，P均＜0.05）。

圖6 各組HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞的遷移和侵襲能力檢測(cè)Fig 6 Detection of migration and invasion abilities of HBx-EGFP-14-19 cells in each group

2.7 miRNA-544-3p對(duì)HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中Arf6水平及Akt-mTOR 通路的影響 qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組、miRNA-544-3p mimic 組、miRNA-544-3p NCinhibitor 組、miRNA-544-3p inhibitor 組Arf6mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.24、0.99±0.12、0.53±0.06、0.91±0.16、1.54±0.03，相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p mimic 組Arf6mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，而miRNA-544-3p inhibitor 組Arf6mRNA 相對(duì)表達(dá)量增加（P均＜0.05）?？瞻讓?duì)照組、miRNA-544-3p NC-agomir 組、miRNA-544-3p agomir 組、miRNA-544-3p NC-antagomir 和miRNA-544-3p antagomir 組Arf6mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.57±0.16、1.46±0.21、0.69±0.06、1.67±0.06、2.67±0.13，相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p agomir組Arf6mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，而miRNA-544-3p antagomir組Arf6mRNA相對(duì)表達(dá)量增加（P均＜0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組、miRNA-544-3p mimic組、miRNA-544-3p NC-inhibitor 組和miRNA-544-3p inhibitor 組Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.06、1.15±0.10、0.64±0.10、1.37±0.12、2.09±0.17（圖7A），相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p mimic組Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，而miRNA-544-3p inhibitor 組Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P均＜0.05）；空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-agomir 組、miRNA-544-3p agomir 組、miRNA-544-3p NCantagomir 組 和miRNA-544-3p antagomir 組Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.54±0.24、1.89±0.23、1.18±0.24、1.68±0.18、4.14±0.63（圖7B），相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p agomir 組Arf6 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，而miRNA-544-3p antagomir 組Arf6蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P均＜0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、miRNA-544-3p NC-mimic 組、miRNA-544-3p mimic 組、miRNA-544-3p NC-inhibitor 組和miRNA-544-3p inhibitor 組p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量 分 別 為0.61±0.11、0.70±0.22、0.29±0.07、0.71±0.51、1.11±0.19，Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別 為0.74±0.18、0.77±0.15、0.97±0.12、1.07±0.14、0.81±0.19，p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.48±0.12、0.60±0.12、0.22±0.09、0.43±0.15、1.16±0.16，mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.64±0.03、0.68±0.12、0.75±0.14、0.63±0.14、0.99±0.11（圖7C）。相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p mimic組p-Akt和p-mTOR的表達(dá)均降低，而miRNA-544-3p inhibitor 組p-Akt 和p-mTOR 表達(dá)均增加（P均＜0.05）；各組間Akt 蛋白和mTOR 蛋白的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）?？瞻讓?duì)照組、miRNA-544-3p NC-agomir 組、miRNA-544-3p agomir 組、miRNA-544-3p NC-antagomir 組 和miRNA-544-3p antagomir 組p-Akt 蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá)量 分 別 為0.75±0.15、0.71±0.15、0.42±0.13、0.81±0.15、1.56±0.21，Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.15、0.89±0.11、0.96±0.15、1.07±0.17、1.15±0.25，p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.74±0.13、0.86±0.15、0.50±0.16、0.89±0.12、1.27±0.23，mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.93±0.15、1.16±0.14、1.02±0.08、1.09±0.17、1.26±0.11（圖7D）。相較于對(duì)照組，miRNA-544-3p agomir組p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)均減少，而miRNA-544-3p antagomir 組p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)均增加（P均＜0.05）；各組間Akt 蛋白和mTOR 蛋白的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。上述結(jié)果表明miRNA-544-3p 對(duì)Arf6/Akt-mTOR 信 號(hào) 軸 有 調(diào) 控作用。

圖7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞中Arf6、Akt、mTOR 的表達(dá)Fig 7 Expression of Arf6, Akt, and mTOR in HBx-EGFP-14-19 cells of each group detected by Western blotting

3 討 論

作為許多基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，miRNA 調(diào)控了癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程，如癌細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA-544 在多種癌癥中表達(dá)異常，如骨髓瘤［15］、結(jié)直腸癌［16］、宮頸癌［17］、乳腺癌［18-19］等，這提示miRNA-544 與癌癥存在著一定程度的關(guān)聯(lián)。Chen 等［15］研究指出，miRNA-544 在促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮了十分重要的作用，它通過(guò)直接調(diào)控靶基因軸抑制因子2（axis inhibition protein 2，AXIN2）的表達(dá)參與骨髓瘤的發(fā)生。Yao 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-544 在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和癌組織中過(guò)表達(dá)使靶基因叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Mao 等［17］研究表明，靶基因酪氨酸3/色氨酸5 單加氧酶激活蛋白ζ（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein ζ，YWHAZ）表達(dá)的降低所引發(fā)的效應(yīng)是miRNA-544 發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控和抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用的核心因素。以上研究結(jié)果表明，miRNA-544 在不同類(lèi)型的癌癥中特異性靶向不同基因，從而參與多種不同類(lèi)型癌癥的生理、病理進(jìn)程，發(fā)揮了癌基因樣或抑癌基因樣作用。本研究結(jié)果顯示，miRNA-544-3p 在HBx存在時(shí)呈下調(diào)趨勢(shì)，將miRNA-544-3p mimic 或miRNA-544-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染到HBx-EGFP-14-19 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miRNA-544-3p 能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲。本研究通過(guò)TargetScan 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miRNA-544-3p 的靶基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Arf6可能為miRNA-544-3p 的功能靶基因。

Arf6 是Ras 超家族中的1 個(gè)小GTP 酶結(jié)合蛋白，廣泛存在于人體肝臟、胃、乳腺、前列腺等組織器官中，參與調(diào)控囊泡的形成和運(yùn)輸、細(xì)胞分裂與黏附、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組等，并與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲密切相關(guān)［20］。研究發(fā)現(xiàn)，Arf6 在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，如胰腺癌［21］和 乳 腺 癌［22］。目 前 關(guān) 于Arf6 與HCC 相 關(guān) 的 研究報(bào)道較少。Wang 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，Arf6 在HCC細(xì)胞系和人HCC 組織中高表達(dá)，但其作用機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者指出，Arf6 通過(guò)作用于一系列細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的下游通路，導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力改變并最終引發(fā)腫瘤［24］。Hashimoto等［21］指出Arf6 是Akt-mTOR 通路的上游調(diào)控因子，還有研究表明HBx 通過(guò)激活A(yù)kt-mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)了肝癌的發(fā)生、發(fā)展［25-26］。本研究結(jié)果表明，Arf6 在HBx 存在時(shí)呈上調(diào)趨勢(shì)；上調(diào)或下調(diào)miRNA-544-3p 后Arf6 及Akt-mTOR 通 路 發(fā) 生變化，提示miRNA-544-3p 可能靶向調(diào)控Arf6 并影響Akt-mTOR 通路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miRNA-544-3p 可能通過(guò)調(diào)控Arf6/Akt-mTOR 信號(hào)軸在HCC 發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用。但是，miRNA 與靶基因的關(guān)系是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，同一種miRNA 可調(diào)控多個(gè)靶基因和多個(gè)信號(hào)通路，同一個(gè)靶基因也可受多種miRNA 共同調(diào)節(jié)，miRNA-544-3p 對(duì)其他基因的調(diào)控作用值得進(jìn)一步深入研究。值得一提的是，本研究首次在動(dòng)物體內(nèi)以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的方式考察了從HBx 感染到HCC 發(fā)生過(guò)程中miRNA-544-3p 表達(dá)水平的變化，并進(jìn)一步探討了miRNA-544-3p 在感染HBx過(guò)程中的功能和意義，為HBV-HCC的預(yù)測(cè)、治療及預(yù)后研究提供了具有應(yīng)用價(jià)值的新方向，也為HBV-HCC 的生物治療提供了新的作用靶點(diǎn)。