劉二冬，侯明慧，王 向，宗雅麗，王紅陽,，付 靜

1. 復旦大學生命科學學院和代謝與整合生物學研究院，上海 200438

2. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心類器官實驗室，鄭州 450052

3. 海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）第三附屬醫(yī)院膽道二科，上海 200438

4. 海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）國家肝癌科學中心，上海 201805

肝癌是高發(fā)病率、高病死率的惡性腫瘤，其最主要的病理類型為肝細胞癌。因早期診斷困難，僅有5%～15%的肝癌患者能進行有效的手術治療，而相關靶向藥物和免疫藥物的應用仍存在一系列問題，因此肝癌患者的預后較差，5 年生存率不足20%［1-2］。肝癌患者的個體差異、腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性和腫瘤細胞的耐藥性十分復雜，這給肝癌的臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。肝癌臨床治療的發(fā)展受限于肝癌研究模型的缺乏。目前肝癌研究模型主要為原代細胞或細胞系二維培養(yǎng)模型、人源腫瘤異種移植模型等，然而肝癌細胞系不具備體內(nèi)肝臟生理環(huán)境、相關特異性蛋白表達量較低，而動物模型體內(nèi)實驗周期較長、不便開展大規(guī)模的評估和藥物篩選，使得這些模型的應用具有較大的局限性［3］。因此，急需可模擬腫瘤組織結構和分子特征的研究模型用于指導肝癌患者的精準治療。

類器官是指一類具有自我更新能力、能夠在體外自發(fā)形成三維結構且能夠較好地模擬體內(nèi)器官特征和功能的細胞團［4］。近年來，腫瘤來源類器官的培養(yǎng)取得了不小的進展，前列腺癌［5］、胰腺癌［6］、結直腸癌［7］、乳腺癌［8］、膀胱癌［9］等多種腫瘤來源類器官的構建均有報道。腫瘤類器官能夠在體外長時間培養(yǎng)，具有原代腫瘤的結構特征和功能等，為患者的個體化治療帶來了希望。2017 年Broutier 等［10］成功建立了8 例能長期培養(yǎng)的肝癌類器官，以此為基礎進行了基因鑒定和藥物篩選，提出類器官在肝癌藥物篩選中具有廣闊的應用前景。2018 年Nuciforo 等［11］利用肝癌穿刺活檢組織成功培養(yǎng)了類器官，擴展了類器官的組織來源。然而，目前肝細胞癌類器官的建立和培養(yǎng)還存在成功率低、數(shù)量少、無標準化的培養(yǎng)鑒定流程、不能完整模擬體內(nèi)微環(huán)境等問題，這為肝細胞癌類器官的臨床應用帶來了挑戰(zhàn)［12］。此外，由于人種遺傳背景、生活環(huán)境和生活方式等不同，中國人和西方人在肝癌致病因素、驅(qū)動基因變異譜和發(fā)病機制等方面均存在較大差異。目前，我國仍缺乏規(guī)模化的肝癌模型資源庫，尤其是類器官樣本庫，這極大地限制了針對中國肝癌患者的研究和精準醫(yī)學的發(fā)展。

腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）基因編碼抑癌蛋白p53，約13%～48%的肝細胞癌患者帶有TP53突變，TP53突變促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也與患者的臨床分期和預后有著密切關聯(lián)［13］。erb-b2 受體酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶，參與調(diào)控細胞的增殖和分化等，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［14］。本研究通過優(yōu)化類器官培養(yǎng)基，利用我國肝細胞癌患者（伴HBV 感染）的腫瘤標本建立了一株同時攜帶TP53和ERBB2突變的肝細胞癌類器官，使其能夠在體外長期培養(yǎng)，為針對伴TP53和ERBB2突變肝細胞癌患者的臨床治療提供良好的體外模型。

1 材料和方法

1.1 組織標本和實驗試劑新鮮肝細胞癌組織標本來自海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）第三附屬醫(yī)院1 例肝細胞癌患者?；颊邽槟行?，56 歲，經(jīng)病理確診為肝細胞癌Ⅲ級、肝癌微血管侵犯程度分級為M2，伴有HBV 感染、小結節(jié)型肝硬化和慢性膽囊炎。本研究獲得海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）第三附屬醫(yī)院倫理委員會審批，患者已認真閱讀并簽署知情同意書。

終止培養(yǎng)基：DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號L100KJ，上海源培生物科技股份有限公司）中加入1%青霉素-鏈霉素（貨號15140-122，美國Gibco 公司）、1×PrimocinTM（貨號ant-pm-1，法國InvivoGen 公司）、10 μmol/L Y27632（貨號S1049，美國Selleck 公司）和10% FBS（貨號10099-141C，美國Gibco 公司）。

肝細胞癌類器官培養(yǎng)基：高級DMEM/F12 培養(yǎng)基（貨號12634-010，美國Gibco 公司）中加入1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺Ⅰ（貨號35050-061，美國Gibco 公司）、10 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（貨號15630-080，美國Gibco 公司）、1×PrimocinTM、稀釋比例為1∶50 的B27 添加劑（貨號17504-044，美國Gibco 公司）、1.25 mmol/LN-乙酰-L-半胱氨酸（貨號A9165-5G，美國Sigma-Aldrich 公司）、50 ng/mL 重組鼠表皮生長因子（貨號PMG8043，美國Gibco 公司）、10 μmol/L Y27632、500 nmol/L A8301（貨 號2939， 英 國Tocris 公司）、100 ng/mL 重組人成纖維細胞生長因子10（貨號100-26，美國PeproTech 公司）、1 ng/mL 重組人堿性成纖維細胞生長因子（貨號100-18B，美 國PeproTech 公 司）、10 nmol/L Forskolin（貨號S2449，美國Selleck 公司）、25 ng/mL 重組人肝細胞生長因子（貨號100-39，美國PeproTech 公司）、10 mmol/L 煙酰胺（貨號N0636-100G，美國Sigma-Aldrich 公司）、體積分數(shù)為5%的Noggin 條件培養(yǎng)基（中國科學院上海分院高棟課題組提供）、3 nmol/L 地塞米松（貨號D4902-25MG，美國Sigma-Aldrich 公司）和10 nmol/L 重組人（Leu15）-Gastrin Ⅰ（貨號05-23-2301，美國Sigma-Aldrich 公司）。

細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）抗體（貨號180234）購自美國ThermoFisher 公司，p53 抗體（貨號bs-2090R）購自美國Bioss antibodies 公司，細胞角蛋白8（cytokeratin 8，CK8）抗體（貨號ab53280）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC-3）抗體（貨號ab207080）購自英國Abcam公司。羊抗兔IgG（貨號ab205718）和羊抗鼠IgG（貨號ab6789）購自英國Abcam 公司。

1.2 組織處理手術切除腫瘤標本后迅速將其置于冰上，隨后分成3 份，其中2 份分別用于類器官建立、免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）分析，另外1 份于－80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 類器官培養(yǎng)用PBS 沖洗腫瘤組織標本2 次，剪成大小約1 mm3的組織小塊，加入膠原酶消化液（4 mg/mL 的膠原酶D 消化液；貨號11088866001，瑞士Roche 公司）于37 ℃消化1～2 h，待無明顯小塊時用預冷的終止培養(yǎng)基終止消化。將含有細胞的消化液通過孔徑為70 μm 的濾網(wǎng)，濾液經(jīng)300×g離心3 min，離心后去除上清，用終止培養(yǎng)基重懸沉淀，重復2 次。以預冷的肝細胞癌類器官培養(yǎng)基重懸細胞，將5 000～10 000 個細胞與50 μL 基質(zhì)膠（Matrigel；貨號356231，美國Corning 公司）混合后接種于24 孔培養(yǎng)板中。置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中1 h 待基質(zhì)膠凝固后，再加入1 mL 肝細胞癌類器官培養(yǎng)基，每隔3～4 d 換液1 次。培養(yǎng)1～2 周后待細胞密度達到80%左右時，用移液槍頭反復吹打類器官使細胞分散，然后按照1∶2 的比例重新接種進基質(zhì)膠中進行傳代培養(yǎng)。

1.4 H-E 和IHC染色分析類器官和腫瘤組織標本用4%多聚甲醛溶液浸泡過夜，隨后進行梯度乙醇脫水、石蠟包埋及切片，常規(guī)進行H-E 染色，在光鏡下觀察組織和類器官形態(tài)。將3 μm 厚的切片置于60 ℃烘箱烘烤30 min，脫蠟，用3%過氧化氫甲醇溶液室溫孵育20 min，然后置于檸檬酸緩沖液中煮沸進行抗原修復，待冷卻后用1%牛血清白蛋白封閉30 min，滴加一抗（CK7、p53、CK8、GPC-3 抗體）于4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育30 min 后進行DAB 顯色。根據(jù)IHC 染色的強弱和陽性細胞數(shù)量將結果分為陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性［15］。

1.5 靶向測序與數(shù)據(jù)分析通過文獻檢索選取與肝癌相關的565 個基因組成基因panel。提取類器官基因組DNA 建立文庫，使用Illumina NovaSeq 6000 System 進行測序。用fastp 0.20.0 軟件對原始數(shù)據(jù)進行預處理以便于后續(xù)分析。利用SAMtools 1.4 軟件對數(shù)據(jù)進行排序和索引，然后用ANNOVAR 軟件進行注釋。

1.6 藥物篩選用TrypLE 消化液（貨號12604-013，美國Gibco 公司）將類器官消化成單細胞，計數(shù)細胞并稀釋成密度為1×105/mL 的細胞懸液，在96 孔板中每孔加入7 μL 細胞懸液，37 ℃孵育1 h 后加入varlitinib（表皮生長因子受體/ERBB2特異性抑制劑；貨號S2755，美國Selleck 公司）、索拉非尼（激酶多靶點抑制劑；貨號S7397，美國Selleck 公司）、順鉑（貨號S1166，美國Selleck公司）或nutlin3（p53 激活劑；貨號10004372，美國Canman Chemical 公司）。5 d 后用CellTiter-Glo細胞活性檢測試劑盒（貨號G9682，美國Promega公司）檢測細胞活力。采用GraphPad Prism 7 軟件計算藥物IC50。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 肝細胞癌類器官的建立原代肝細胞癌細胞接種于基質(zhì)膠中，用肝細胞癌類器官培養(yǎng)基培養(yǎng)，1 周左右基質(zhì)膠中形成了緊密不光滑的球狀結構，與肝癌類器官的形態(tài)結構相符（圖1）。當類器官細胞密度長至80%時，按照1∶2 的比例進行傳代或凍存，該類器官能穩(wěn)定傳代半年以上。類器官在凍存復蘇后，其形態(tài)沒有發(fā)生明顯改變。

圖1 肝細胞癌類器官的培養(yǎng)Fig 1 Culture of the hepatocellular carcinoma organoid

2.2 肝細胞癌類器官的結構和IHC特征 H-E 染色結果（圖2）顯示，相較于癌旁正常組織，類器官和原代腫瘤組織中細胞排列結構紊亂，細胞形狀不規(guī)則，細胞核大、核質(zhì)比較高，呈現(xiàn)惡性細胞的表型。IHC 染色結果（圖2）顯示，類器官與腫瘤組織中CK8 分別為強陽性和中等陽性，p53 均為中等陽性，CK7 均為陰性，表明類器官和腫瘤組織具有高度相似的分子標志物表達；肝癌標志物GPC-3在原代腫瘤組織中廣泛表達（強陽性），而在類器官中少部分細胞為陽性、大部分細胞為陰性（弱陽性），說明在類器官培養(yǎng)過程中也會丟失少部分特征，這可能與類器官培養(yǎng)還不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境、培養(yǎng)過程具有篩選效果等有關。上述結果表明，本研究建立的肝細胞癌類器官保留了原代腫瘤組織的結構特征，與原代腫瘤組織具有高度相似的分子標志物表達。

圖2 肝細胞癌類器官與原代腫瘤組織的H-E 和IHC 染色結果Fig 2 H-E and IHC staining results of the hepatocellular carcinoma organoid and primary tumor tissues

2.3 肝細胞癌類器官的突變基因分析對565種常見的腫瘤相關基因進行深度靶向測序，結果（表1）表明肝細胞癌類器官中的突變基因有TP53（E271K，100.00%）、ERBB2（A1232V，62.29%）、RUNX 轉 錄 因 子1（RUNX family transcription factor 1，RUNX1）（E395A，20.21%）和雄激素受體（androgen receptor，AR）（Q91dup，70.00%）。上述結果顯示用該肝細胞癌患者的腫瘤標本培養(yǎng)的類器官存在ERBB2突變，這為該患者的個體化治療用藥提供了參考。

表1 肝細胞癌類器官靶向測序結果Tab 1 Targeted sequencing results of the hepatocellular carcinoma organoid

2.4 肝細胞癌類器官對不同藥物的敏感性分析本研究檢測了肝細胞癌類器官對varlitinib（表皮生長因子受體/ERBB2 特異性抑制劑）、索拉非尼（多靶點激酶抑制劑）、順鉑和nutlin3（p53激活劑）這4 種化合物的敏感性，結果（圖3）顯示，varlitinib 和索拉非尼對類器官的IC50分別為2.81 μmol/L 和1.327 μmol/L，順鉑對類器官的IC50為40.98 μmol/L，而nutlin3 干預對細胞的生長無明顯抑制作用，這與基因突變的結果是相符的。這些藥物篩選結果為該患者的臨床治療提供了重要參考。

圖3 肝細胞癌類器官對4 種藥物的敏感性Fig 3 Sensitivity of the hepatocellular carcinoma organoid to 4 drugs

3 討 論

類器官技術的發(fā)展為腫瘤研究提供了簡便、穩(wěn)定的模型。相較于細胞系，腫瘤組織的結構特性、藥物敏感性及基因突變圖譜在類器官上均有良好的體現(xiàn)［16］。類器官技術的發(fā)展有望為腫瘤精準治療提供巨大的幫助。我們在類器官培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)肝細胞癌類器官培養(yǎng)成功率較低，這可能與組織的處理方式、患者的病情階段、取材部位等有關。建立類器官時通常用膠原酶消化腫瘤組織，本研究也采用此方法，但膠原酶消化時間對細胞活性有著明顯影響，消化時間過長不利于類器官的生長，過短則不能讓組織充分解離，無法得到足夠的細胞。我們發(fā)現(xiàn)肝細胞癌腫瘤組織含有較多纖維，消化時間通常需1.5～2 h，這可能是肝細胞癌類器官培養(yǎng)成功率較低的原因之一。近年有研究顯示將組織剪碎直接培養(yǎng)能取得良好效果，如Hu 等［17］將肺癌組織研磨為40～100 μm 的細胞團進行培養(yǎng)，快速建立了肺癌類器官。此方法能否提高肝細胞癌類器官的培養(yǎng)成功率有待進一步研究。

正常細胞的污染是腫瘤類器官培養(yǎng)過程中的一個難題。目前常見的做法是將腫瘤類器官挑出或用nutlin3 等抑制正常細胞生長的方式進行篩選，但這可能會對組織細胞的多樣性造成破壞。本研究發(fā)現(xiàn)nutlin3 對攜帶TP53突變的類器官的細胞活性無明顯影響，提示其可用于TP53突變腫瘤類器官的常規(guī)培養(yǎng)，但如何提高無TP53突變腫瘤類器官的純度仍需進一步探索。

本研究成功建立了1 例同時攜帶TP53和ERBB2突變的肝細胞癌類器官，該類器官保留了原代組織的結構和分子特征。TP53是一種抑癌基因，具有激活DNA 修復、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等多種重要功能，超過50%的惡性腫瘤存在TP53基因突變［18］。本例類器官測序結果顯示p53 蛋白存在錯義突變E271K，該突變位點位于核心DNA 結合結構域，有可能影響p53 蛋白與DNA的結合及其功能，進而促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展。目前有關該突變位點的報道較少，與之相鄰的位點R273 是TP53最常見的突變位點之一，有報道顯示R273C 的突變影響了p53 蛋白與DNA 的結合，具有致瘤性［19］。ERBB2 是一種酪氨酸激酶受體，其同源或異源受體二聚化后能夠激活下游一系列信號通路，從而促進細胞的生長。在臨床上，ERBB2 是一個重要的抗腫瘤靶點，其抑制劑顯示出了良好的應用前景。在乳腺癌的治療中，已開發(fā)出多種針對ERBB2 靶點的藥物［20］。本研究中表皮生長因子受體/ERBB2 特異性抑制劑varlitinib 對類器官有明顯的抑制作用，這將為該患者的臨床治療提供重要的參考。然而本研究結果來自1 例肝細胞癌類器官，尚缺乏不同患者個體、不同基因背景對相關藥物響應的比較。此外，本研究測試的藥物種類較少，后續(xù)仍需在更多的肝細胞癌類器官中進行大規(guī)模的藥物敏感性檢測，以期探究不同患者類器官對相關藥物的敏感性及其機制。

綜上所述，本研究成功建立了1 例同時攜帶TP53和ERBB2突變的肝細胞癌類器官，該類器官對多靶點抑制劑索拉非尼和表皮生長因子受體/ERBB2 特異性抑制劑varlitinib 較敏感，為該患者的臨床治療提供了重要參考，也為TP53和ERBB2突變腫瘤的靶向治療提供了良好的研究模型。