詹 清，鄭孝賢，王海龍，林夢(mèng)丹，方東升

（福建省微生物研究所，福建福州 350000）

隨著人們對(duì)食品安全問題的日漸關(guān)注，食品微生物檢驗(yàn)的市場(chǎng)需求擴(kuò)大，同時(shí)也對(duì)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的人員和專業(yè)技術(shù)手段提出了更嚴(yán)格的要求。標(biāo)準(zhǔn)菌株作為微生物檢測(cè)工作的關(guān)鍵因素，是檢測(cè)質(zhì)量?jī)?nèi)部控制的一部分[1]。標(biāo)準(zhǔn)菌株是一類遺傳學(xué)特性已得到確認(rèn)和保證，并且可溯源的模式菌株，其在培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量驗(yàn)收、檢測(cè)方法的確認(rèn)和證實(shí)以及確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性等各方面都具有不可替代的重要作用[2]。本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)工作實(shí)際，對(duì)食品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的日常規(guī)范化管理以及質(zhì)量控制進(jìn)行探討。

1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的來源

依據(jù)《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS—CL01-A001：2018）的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室必須有保藏滿足實(shí)驗(yàn)需要的標(biāo)準(zhǔn)菌株，除特殊檢測(cè)方法（如抗菌實(shí)驗(yàn)或藥敏實(shí)驗(yàn)）用到的菌株外，還需具備用于培養(yǎng)基（試劑）驗(yàn)收/質(zhì)量控制、方法確認(rèn)/證實(shí)、陽、陰性對(duì)照、人員培訓(xùn)考核和結(jié)果質(zhì)量的保證等需要的菌株，且標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)該從國(guó)際或國(guó)家認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買[3]。目前，我國(guó)的微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株主要來自以下機(jī)構(gòu)，美國(guó)典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）、中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）和廣東省微生物菌種保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center，GDMCC）[4]。

2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇

由于標(biāo)準(zhǔn)菌株種類繁多，同種或同一亞種的不同菌株的某些生物學(xué)特性可能會(huì)存在一些差別。因此，在選擇菌株的時(shí)候不僅要注意菌株的名稱，還要注意菌株的編號(hào)。如銅綠假單胞菌ATCC27853和銅綠假單胞菌ATCC15442二者產(chǎn)生綠膿菌素的能力差異較大。食品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)所開展的檢測(cè)項(xiàng)目，參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789系列，選擇標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的菌株作為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的陰、陽性對(duì)照[5]。另外，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）規(guī)定了不同種類培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并指定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株[6]。

3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的驗(yàn)收

實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，首先應(yīng)核對(duì)菌株的數(shù)量和名稱，同時(shí)檢查菌株附有的相關(guān)資料以及每一支菌株包裝的完整性，并在菌株接收記錄上登記相關(guān)信息，如菌株名稱、數(shù)量、菌號(hào)、來源途徑和接收日期等。同時(shí)給每支菌株粘貼標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包括菌種名稱、菌號(hào)、代次、接收日期、接收人、貯存條件及有效期至，新購(gòu)入的原始菌株依照隨產(chǎn)品附有的菌株儲(chǔ)存方法進(jìn)行儲(chǔ)存。

4 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活、傳代及確認(rèn)

4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活

得到標(biāo)準(zhǔn)菌株后，應(yīng)盡早進(jìn)行復(fù)活和保藏。在進(jìn)行復(fù)活前，要根據(jù)菌株的特性，確定培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。通常從菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株會(huì)附帶操作說明，可直接按照說明書進(jìn)行復(fù)活。若沒有附帶說明書，可通過查閱文獻(xiàn)等方式確認(rèn)菌株?duì)I養(yǎng)需求和生長(zhǎng)條件。在復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物名錄》《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》《動(dòng)物病原微生物分類名錄》及《實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求》（GB 19489—2008）的規(guī)定，在相應(yīng)的生物安全水平下操作。從菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株通常是凍干粉狀態(tài)，可選擇加入少量生理鹽水或復(fù)蘇液（購(gòu)買菌株包裝中提供），將凍干菌種制成懸浮液，然后用無菌滴管或移液器吸取適量移至固體培養(yǎng)基平板（或液體培養(yǎng)基）中進(jìn)行培養(yǎng)。

4.2 菌株的性能確認(rèn)

為了保證標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)量，菌株經(jīng)過復(fù)活，并在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后，需進(jìn)行純度和性能的確認(rèn)，同時(shí)做好確認(rèn)記錄。純度檢查通常采用平板劃線法，用無菌接種環(huán)將復(fù)活后的菌株劃線于相應(yīng)的鑒別平板或非選擇平板上，分離出單菌落，觀察單菌落形態(tài)是否與菌株特征相符。然后取平板上的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果應(yīng)符合要求。最后利用生理生化試驗(yàn)鑒定菌株的性能。常見的生化鑒定產(chǎn)品有API生化鑒定試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)菌株生化鑒定試劑盒，也可借助全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀等儀器進(jìn)行鑒定。

4.3 菌株的傳代

從菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買回來的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常為0代，將0代標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)接一代后得到的一套完全相同的獨(dú)立菌株，即標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株再轉(zhuǎn)接一代即可獲得工作菌株，理論上工作菌株傳代不超過5代[7]。每次傳代需填寫傳代確認(rèn)記錄表，記錄表內(nèi)容應(yīng)包括菌株名稱、編號(hào)、代數(shù)、制成代編號(hào)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及時(shí)間、純度檢查過程、鏡檢、生化鑒定結(jié)果和操作者等信息，以保證傳代后菌株質(zhì)量的可控性。制備的菌株應(yīng)由管理員統(tǒng)一進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)識(shí)，標(biāo)簽內(nèi)容包括菌株名稱、內(nèi)部編號(hào)、傳代日期及有效期等信息。內(nèi)部編號(hào)規(guī)則通常采用字母加數(shù)字表示，即菌株拉丁文縮寫字母+代次+傳代日期+順序號(hào)。

5 標(biāo)準(zhǔn)菌株的保藏

菌株保藏的主要目的是為了保持原菌株的活力和特性，降低菌株的變異和污染[8]。一種良好有效的保藏方法要能保持原菌株的優(yōu)良特性長(zhǎng)期穩(wěn)定，同時(shí)操作上還須具備簡(jiǎn)便性和經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。食品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用的菌株保藏方法有以下幾種。

5.1 斜面低溫保藏法

將菌株接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌株生長(zhǎng)完全后，轉(zhuǎn)至2～8 ℃的冰箱保藏（需常溫保存的菌株除外，如銅綠假單胞菌和霍亂弧菌等）。此法常用于工作菌株的保藏，一般可保存3個(gè)月左右（不同種類菌株保存周期略有不同）。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、易推廣、存活率高。缺點(diǎn)是保藏周期短、菌株隨著傳代次數(shù)的增加容易發(fā)生變異或引入污染。

5.2 液體石蠟保藏法

在斜面保藏法的基礎(chǔ)上，加入滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟，垂直放置使石蠟高出斜面頂端l cm，將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以此達(dá)到保藏效果。此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，保存時(shí)間長(zhǎng)，一般可保存1～2年。缺點(diǎn)是不適用于能分解烴類的菌株保存，且斜面占用空間大。

5.3 甘油懸液保藏法

用滅過菌的甘油（濃度為15%～20%），將新鮮的純培養(yǎng)物洗脫下來，混合均勻，再分裝至菌種保藏管中，置于-20 ℃低溫保存，一般可保存1年以上。本方法操作簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備，不需反復(fù)傳代，使用方便。

5.4 冷凍真空干燥保藏法

冷凍真空干燥保藏法簡(jiǎn)稱凍干法，它是將需保藏菌株的細(xì)胞懸液或孢子懸液與保護(hù)劑混合，然后置于安瓿管中，在低溫條件下快速凍結(jié)，并減壓抽真空，使水分升華將樣品脫水干燥，制成完全干燥的固體菌塊。在真空條件下將安瓿管立即熔封，最后置于低溫冰箱保存。此方法的優(yōu)點(diǎn)是保存周期長(zhǎng)，一般可達(dá)5年以上，菌株存活率高、變異率低。缺點(diǎn)是該方法操作煩瑣，且需要凍干機(jī)等專用設(shè)備。

6 標(biāo)準(zhǔn)菌株的領(lǐng)用及銷毀

食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)由專人保管，領(lǐng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株和工作菌株時(shí)要做好交接工作，并填寫領(lǐng)用記錄表，記錄表內(nèi)容應(yīng)包括菌株名稱、編號(hào)、使用日期、用途、使用人和管理人簽字確認(rèn)等?！秾?shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求》（GB 19489—2008）規(guī)定了生物安全實(shí)驗(yàn)室處置廢棄物的要求，標(biāo)準(zhǔn)菌株使用完畢后相關(guān)污染物品應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的消毒滅菌處理，并記錄。

7 標(biāo)準(zhǔn)菌株的期間核查

標(biāo)準(zhǔn)菌株是一類易發(fā)生死亡、衰退和被污染的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[9]。為確保標(biāo)準(zhǔn)菌株相關(guān)生物學(xué)性能的穩(wěn)定，微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)菌株期間核查計(jì)劃，對(duì)菌株核查的方法、頻次、文件記錄、結(jié)果判定等方面內(nèi)容進(jìn)行合理規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)工作實(shí)際情況對(duì)保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行核查，主要包括文件的核查和標(biāo)準(zhǔn)菌株純度、活性、穩(wěn)定性和生化特性等指標(biāo)的核查[10]。文件核查的主要工作是查閱菌株檔案以及相關(guān)記錄的完整性，包括菌株溯源證明、標(biāo)準(zhǔn)菌株臺(tái)賬、傳代及確認(rèn)記錄和領(lǐng)用及銷毀記錄等。標(biāo)準(zhǔn)菌株純度、活性、穩(wěn)定性和生化特性的核查可參考菌株的性能確認(rèn)方法，一般情況下，菌株性能的期間核查與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)方法和依據(jù)基本一致，但期間核查可從多方面使用不同的方法進(jìn)行，并不局限于單一的方法。

8 結(jié)語

標(biāo)準(zhǔn)菌株作為重要且特殊的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，貫穿于整個(gè)微生物檢測(cè)過程，并起到內(nèi)外部質(zhì)量控制的作用。微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立一套完善的標(biāo)準(zhǔn)菌株管理和質(zhì)量控制程序，確保標(biāo)準(zhǔn)菌株的溯源性和穩(wěn)定性，從源頭上保證檢測(cè)結(jié)果的有效性和真實(shí)性。