王艷平， 潘 紅， 吳 燕， 王顯生， 汪鴻星， 李華勇， 于 堃， 沈 奇

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇南京210014)

玉米是中國種植范圍最廣、用途最多、總產(chǎn)量最高的作物，玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展在保障中國糧食安全和滿足市場(chǎng)需要方面具有至關(guān)重要的作用[1]。良種培育是保證玉米正常生產(chǎn)的關(guān)鍵，近年來國家對(duì)種業(yè)研發(fā)提供了大量政策支持，提高了企業(yè)研發(fā)的積極性。2014年中國頒布了《國家級(jí)水稻玉米品種審定綠色通道試驗(yàn)指南》(簡(jiǎn)稱《指南》)以簡(jiǎn)化審定程序，隨后，中國審定的玉米品種數(shù)量迅猛增長。近3年來，中國每年審定的玉米品種有2 000～3 000份，每年申請(qǐng)品種保護(hù)的玉米品種有2 000多份[2]。2016年中國實(shí)施的新《種子法》中規(guī)定，獲得品種保護(hù)和審定的玉米品種都要滿足品種特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)(簡(jiǎn)稱DUS)測(cè)試的要求，目前中國每年都有大量玉米品種接受DUS測(cè)試。

DUS 測(cè)試是品種權(quán)授權(quán)、品種審定和品種登記的基本技術(shù)依據(jù)，其中特異性測(cè)試在真實(shí)性評(píng)價(jià)、假冒侵權(quán)品種技術(shù)鑒定中尤為重要。特異性是指一個(gè)植物品種有一個(gè)以上性狀明顯區(qū)別于已知品種。近似品種是指在所有已知品種中，相關(guān)特征或者特性與待測(cè)品種最為相似、在DUS測(cè)試中用于田間比對(duì)的品種。由此可見，篩選近似品種是DUS測(cè)試的重要環(huán)節(jié)，對(duì)特異性的判定起著決定性作用。當(dāng)前，特異性測(cè)試主要是根據(jù)植物測(cè)試指南中表型性狀的描述，在已知品種庫中篩選與申請(qǐng)品種表型近似的品種并進(jìn)行田間種植比較。這種根據(jù)表型性狀篩選近似品種的測(cè)試方法在DUS測(cè)試實(shí)踐中存在一些缺陷：一是耗時(shí)長，必須對(duì)申請(qǐng)品種進(jìn)行一年的種植試驗(yàn)，獲得表型性狀數(shù)據(jù)后才能與數(shù)據(jù)庫中的所有品種進(jìn)行比對(duì)；二是現(xiàn)有的植物新品種保護(hù)數(shù)據(jù)庫包括全國各生態(tài)區(qū)的測(cè)試數(shù)據(jù)，直接用不同生態(tài)區(qū)的表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)時(shí)存在環(huán)境誤差。

分子數(shù)據(jù)因具有標(biāo)記位點(diǎn)多、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，在篩選近似品種方面能夠高效鑒定大量的品種。國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)技術(shù)委員會(huì)于1992年成立了生物化學(xué)和分子技術(shù)工作組(BMT)，專門研究DNA分子標(biāo)記在DUS測(cè)試中的應(yīng)用。目前，研究者主要運(yùn)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分子標(biāo)記輔助DUS測(cè)試。UPOV認(rèn)為，SSR標(biāo)記是可以用于構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的一種理想的分子標(biāo)記，并為其應(yīng)用制定了相應(yīng)的技術(shù)文件指導(dǎo)[3]。Hong等[4]用表達(dá)序列標(biāo)簽-SSR(EST-SSR)標(biāo)記構(gòu)建了萵苣DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并將其用于萵苣品種的近似品種篩選和特異性判定。中國在2013年發(fā)布了玉米等10多種作物的SSR標(biāo)記法品種鑒定技術(shù)規(guī)程。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測(cè)試(濟(jì)南)分中心采用發(fā)布的技術(shù)規(guī)程構(gòu)建了小麥、大白菜已知品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并用DNA指紋數(shù)據(jù)庫篩選了小麥DUS測(cè)試品種的近似品種[5]。

目前使用的品種鑒定技術(shù)規(guī)程——SSR分子標(biāo)記法，標(biāo)記數(shù)目有限、信息量較少，且不能滿足大量樣本高通量檢測(cè)的需求。近年來，由于芯片技術(shù)具有標(biāo)記數(shù)量多、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，利用其研發(fā)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)技術(shù)得到快速發(fā)展和應(yīng)用[6-7]。法國專家Delêtre[8]在2020年的UPOV生物化學(xué)和分子技術(shù)工作組第19次會(huì)議上講述了一種用SNP分子標(biāo)記檢測(cè)冬油菜DUS的策略，美國的Achard等[9]已將SNP技術(shù)運(yùn)用到大豆品種保護(hù)的DUS測(cè)試中。

SNP檢測(cè)技術(shù)中的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive allele-specific PCR，KASP)標(biāo)記檢測(cè)法具有穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確性高、成本低的特點(diǎn)，可用于各種目的、各種物種的基因分型，在需要少量到中等數(shù)量標(biāo)記的檢測(cè)中可顯示成本效益和可擴(kuò)展的靈活性[10]，目前已被廣泛應(yīng)用到大麥[11]、小麥[12]、水稻[13]、玉米[14-16]等作物品種的檢測(cè)中。陸海燕等[14]基于205份玉米自交系重測(cè)序數(shù)據(jù), 過濾出1 660 336個(gè)SNP位點(diǎn), 并根據(jù)這些位點(diǎn)開發(fā)、挑選出202個(gè)能有效鑒定玉米品種特異性和真實(shí)性的KASP標(biāo)記。江蘇省于2020年發(fā)布了利用KASP標(biāo)記檢測(cè)的地方標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法》(DB32/T 3860-2020)[17]，該標(biāo)準(zhǔn)推薦了優(yōu)先使用的40個(gè)KASP標(biāo)記。本研究利用表型性狀和上述標(biāo)準(zhǔn)中可用于品種鑒定的40個(gè)KASP分子標(biāo)記，分別對(duì)315份玉米的DUS測(cè)試品種進(jìn)行聚類，分析玉米DUS測(cè)試品種群體的遺傳多樣性，初步探討KASP標(biāo)記在玉米DUS測(cè)試中應(yīng)用的潛力，以期為玉米DUS測(cè)試中近似品種的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

315份玉米DUS測(cè)試品種(表1)，來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測(cè)試(南京)分中心，繁殖類型包含223份單交種、92份自交系，品種類型包含163份普通型、63份甜質(zhì)型、55份糯質(zhì)型和34份甜糯混合型。供試玉米材料來源廣泛，大部分品種來源于長江中下游地區(qū)的江蘇、浙江、上海、安徽等地，少數(shù)品種來源于湖北、河北、河南、山東、天津、北京、四川、福建、江西、廣東等地。

表1 供試玉米品種

1.2 表型數(shù)據(jù)的采集及聚類分析

試驗(yàn)材料于2020、2021年春種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地。按照《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 玉米》(GB/T 19557.24-2018)[18]規(guī)定的測(cè)試方法對(duì)測(cè)試指南中列出的43個(gè)基本性狀進(jìn)行觀測(cè)和記錄，目測(cè)性狀用代碼記錄，測(cè)量性狀用測(cè)量值記錄。使用SPSS 26軟件，采用對(duì)數(shù)似然值距離測(cè)量以及施瓦茨貝葉斯準(zhǔn)則(BIC)進(jìn)行二階聚類，用歐氏距離構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖。

1.3 KASP標(biāo)記的基因分型及聚類

在玉米的3～4葉期，每個(gè)品種剪取5株幼苗的葉片，參照《玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法》(DB 32/T 3860-2020)[17]中列出的40個(gè)KASP標(biāo)記，按照本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法提取樣品DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行基因分型。使用TASSEL 5軟件，通過Neighbor-Joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，用FigTree軟件處理聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米表型性狀的聚類分析

由表2可以看出，將基于43個(gè)玉米表型性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行二階聚類，315份玉米品種被聚為3類，第1類有162份品種，除1份為糯質(zhì)型外，其他全部為普通型；第2類有92份品種，除2份為甜質(zhì)型，2份為普通型外，其他全部為糯質(zhì)型或甜糯混合型；第3類有61份品種，全部為甜質(zhì)型。

表2 315份玉米品種基于表型性狀數(shù)據(jù)的二階聚類分布

對(duì)43個(gè)玉米表型性狀的重要性進(jìn)行預(yù)測(cè)，由圖1可以看出，“籽粒:類型”、“(僅適用于單色玉米)籽粒:頂端主要顏色”、“雄穗:一級(jí)側(cè)枝數(shù)目”和“幼苗:第一葉鞘花青苷顯色強(qiáng)度”這4個(gè)性狀的重要性在0.5以上，對(duì)聚類的貢獻(xiàn)排名位于前4名。

編號(hào)1～43采用的是測(cè)試指南《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 玉米》(GB/T 19557.24-2018)中規(guī)定的性狀序號(hào)。

對(duì)315份玉米品種的表型性狀觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，并將聚類結(jié)果整理成表3、圖2。以歐氏距離25.0為標(biāo)準(zhǔn)，可將315份玉米材料劃分為A、B兩大類群。A類群包含273份玉米品種(包括58份自交系和215個(gè)單交種)，單交種除6份玉米品種聚于B群外，全部聚于A類群。B類群包含42份玉米品種，其中36份玉米品種是自交系，占全部自交系數(shù)量的39.1%。以歐氏距離12.5為標(biāo)準(zhǔn)，可將A類群劃分為A1、A2和A3等3個(gè)亞群，其中A1亞群包含154份玉米品種，其中17份為自交系(占全部自交系數(shù)量的18.5%)，137份為單交種(占全部單交種數(shù)量的61.4%)；A2亞群包含115份玉米品種，其中74份為單交種，41份為自交系；A3亞群包含4份玉米品種，全部是單交種。以歐氏距離10.0為標(biāo)準(zhǔn)，可將A2亞群再劃分為A2-1、A2-2這2個(gè)亞群，其中A2-1亞群包含76份玉米品種，其中70份為單交種(占全部單交種數(shù)量的31.4%)，6份為自交系；A2-2亞群包含39份玉米品種，其中35份為自交系(占全部自交系數(shù)量的38.0%)，4份為單交種。從品種類型來看，B類群包含29份普通型、7份甜質(zhì)型、5份糯質(zhì)型和1份甜糯混合型。A1亞群包含82份普通型、36份甜質(zhì)型、18份糯質(zhì)型和18份甜糯混合型；A2亞群包含58份普通型、21份甜質(zhì)型、19份糯質(zhì)型和17份甜糯混合型；A3亞群包含4份玉米品種，全部是普通型。A2-1亞群包含19份普通型、19份甜質(zhì)型、21份糯質(zhì)型和17份甜糯混合型；A2-2亞群全部是普通型。上述系統(tǒng)聚類結(jié)果顯示，單交種和自交系在表型上的分離相對(duì)比較明顯，普通型與甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型在表型上的分離較明顯，而甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型三者之間的分離不明顯。

圖2 不同類型玉米品種在所劃分類群中的分布

表3 不同類型玉米品種在各類群中的分布

2.2 KASP標(biāo)記聚類分析

采用覆蓋玉米10條染色體的40個(gè)KASP標(biāo)記對(duì)315份玉米品種進(jìn)行基因分型，每條染色體設(shè)4對(duì)多態(tài)性引物。這40個(gè)KASP標(biāo)記位點(diǎn)在315份玉米品種群體中的多態(tài)信息含量(PIC)變化范圍為0.430～0.500，平均值為0.482，最小等位基因頻率(MAF)變化范圍為0.313～0.498, 平均值為0.420，表明所采用的40個(gè)KASP標(biāo)記具有較高的特異性和穩(wěn)定性。

用Neighbor-Joining法對(duì)315份玉米品種進(jìn)行聚類。由圖3可以看出，315份玉米品種分成A、B兩大群，其中A群包含154份玉米品種，除2個(gè)甜質(zhì)型、7份糯質(zhì)型外全為普通型；B群包含161份玉米品種，其中除17份為普通型外，其他為甜質(zhì)型、糯質(zhì)型和甜糯混合型。B群又可分成為B1、B2、B3和B4 4個(gè)亞群，其中B1亞群包含64份玉米品種，除2份為糯質(zhì)型、2份為甜糯混合型外，其他全部為甜質(zhì)型。B2亞群包含79份玉米品種，B3亞群包含7份玉米品種，B2、B3這2個(gè)亞群中除9份為普通型外，其他全部為糯質(zhì)型、甜糯混合型。B4亞群包含11份玉米品種，其中2份為糯質(zhì)型，1份為甜糯混合型，8份為普通型。

圖3 315份玉米品種的KASP標(biāo)記基因分型聚類結(jié)果

上述聚類結(jié)果顯示，在DNA水平上，普通型玉米與甜質(zhì)型、糯質(zhì)型和甜糯混合型玉米明顯分離，甜質(zhì)型玉米與糯質(zhì)型、甜糯混合型玉米也明顯分離，而糯質(zhì)型和甜糯混合型玉米是相互交織，沒有出現(xiàn)明顯分離。在繁育類型上，單交種和自交系沒有各自成群，自交系與單交種交織在一起。

3 討論與結(jié)論

目前，植物品種的DUS測(cè)試仍然是以表型性狀的觀測(cè)數(shù)據(jù)為依據(jù)，但是分子標(biāo)記尤其是SNP標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用越來越受到重視[19-23]，UPOV已經(jīng)將SNP標(biāo)記作為農(nóng)作物品種鑒定和指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的方法之一[24]。

為了探討SNP標(biāo)記在玉米DUS測(cè)試中的應(yīng)用，本研究采用具有高穩(wěn)定性、高準(zhǔn)確性、低成本等優(yōu)點(diǎn)的KASP標(biāo)記檢測(cè)法和玉米DUS測(cè)試的表型觀測(cè)法，對(duì)315份DUS測(cè)試玉米品種群體進(jìn)行聚類分析比較。供試品種涵蓋當(dāng)前中國大部分地區(qū)育成的各類品種，繁育類型包括自交系和單交種，品種類型包括普通型、甜質(zhì)型、糯質(zhì)型和甜糯混合型。

表型性狀的系統(tǒng)聚類結(jié)果顯示，在繁殖類型上，單交種和自交系之間的分離比較明顯；在品種類型上，普通型與甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型間的分離相對(duì)較明顯，而甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型三者之間的分離不太明顯。通過表型的二階聚類，將品種類型分為普通型、甜質(zhì)型、糯質(zhì)型+甜糯混合型3類，甜質(zhì)型與糯質(zhì)型和甜糯混合型玉米分成不同的類群，這是因?yàn)楸硇托誀顢?shù)據(jù)中包含類別變量和連續(xù)變量。二階聚類分析結(jié)果顯示，類別變量、連續(xù)變量具有快速、智能、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適用于大樣本及多變量的研究[25]，并可預(yù)測(cè)每個(gè)變量的重要性。在本研究中，“籽粒:類型”性狀對(duì)聚類結(jié)果的影響最大，因此可以根據(jù)籽粒類型將供試玉米品種分成普通型、甜質(zhì)型、糯質(zhì)型+甜糯混合型3種類型。

在DNA水平上，針對(duì)不同繁殖類型，王鳳格等[26]利用40對(duì)SSR標(biāo)記分析了中國559個(gè)代表性玉米品種資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)在自交系和雜交種之間存在較小的遺傳多樣性差異。本研究的KASP標(biāo)記聚類結(jié)果也顯示，單交種和自交系沒有各自成群，而是自交系與單交種交織在一起，表明單交種可能是由其中的自交系雜交而來，在親緣關(guān)系上與其父母本自交系間存在更為親近的關(guān)系。針對(duì)不同的籽粒類型，雷開榮等[27]利用SSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)研究了不同種群玉米種質(zhì)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)甜質(zhì)型、糯質(zhì)型玉米種質(zhì)間的遺傳距離變異幅度總體上小于它們與普通玉米間的遺傳距離變異幅度。本研究中的KASP標(biāo)記聚類結(jié)果也顯示，普通型玉米與甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型玉米明顯分開，同時(shí)甜質(zhì)型玉米與糯質(zhì)型、甜糯混合型玉米明顯分開，而糯質(zhì)型玉米和甜糯混合型玉米是相互交織，表明在分子水平上普通型玉米與甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型玉米之間具有明顯的遺傳差異，甜質(zhì)型玉米與糯質(zhì)型、甜糯混合型玉米之間也具有明顯的遺傳差異，而糯質(zhì)型玉米和甜糯混合型玉米之間的差異較小。這是因?yàn)樘鹋椿旌闲陀衩淄ǔＪ且耘从衩鬃越幌禐槟副?、甜糯雙隱性玉米自交系為父本雜交選育而來的[28-29]，僅糯質(zhì)型玉米中引入了甜質(zhì)基因。本研究結(jié)果表明，KASP標(biāo)記能夠應(yīng)用在玉米品種遺傳多樣性分析和DUS測(cè)試的近似品種篩選方面，可以實(shí)現(xiàn)快速、高效、大量樣本的高通量檢測(cè)。

綜合分析表型與KASP標(biāo)記2種聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在繁殖類型上，單交種與自交系的表型聚類結(jié)果與分子標(biāo)記聚類結(jié)果明顯不同，在籽粒類型上，4種玉米品種類型之間在表型、分子水平上的差異基本吻合，表明不同類型的玉米品種在表型上的差異與DNA水平上的差異是不完全一致的。這個(gè)結(jié)果與韓瑞璽等[30]根據(jù)SSR標(biāo)記在小麥上的研究結(jié)果所得出的DNA分子水平上的遺傳相似度大小與表型距離無嚴(yán)格線性關(guān)系的結(jié)論相一致。玉米單交種的株高、果穗大小基本優(yōu)于自交系，普通型、甜質(zhì)型、糯質(zhì)型、甜糯混合型玉米品種的籽粒外觀差異也明顯，表型聚類只能反映品種間表型上的相似程度，不能準(zhǔn)確反映品種間DNA水平上的親緣關(guān)系，而分子標(biāo)記聚類是根據(jù)DNA序列上基因型的差異，能較準(zhǔn)確地從遺傳水平上反映各品種間的親緣關(guān)系。Achard等[9]用SNP、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和系譜信息對(duì)322份已知大豆品種進(jìn)行研究，對(duì)SNP數(shù)據(jù)和系譜親緣數(shù)據(jù)的遺傳距離進(jìn)行多變量分析，發(fā)現(xiàn)品種間的關(guān)聯(lián)非常相似，但是這種遺傳水平上的親緣關(guān)系不能全面反映品種間的表型差異。因此，在當(dāng)前以表型為主的DUS測(cè)試中，為提高近似品種篩選的效率、減少誤差，建議設(shè)立基于SNP標(biāo)記的已知品種分子數(shù)據(jù)庫，同時(shí)利用表型和分子數(shù)據(jù)庫綜合篩選近似品種。