高 煒 徐艷霞 劉圓圓 徐 媺

(青島市中心醫(yī)院/青島市腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，青島，266042)

胃癌屬于臨床上較為常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著人們生活方式的不斷改變其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類生命安全的重大疾病之一[1]。且有研究報道表明，幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori,Hp)感染可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，促進(jìn)了胃黏膜細(xì)胞的凋亡[2]。目前，臨床上廣泛用以治療胃癌的化療藥物普遍存在細(xì)胞毒性，患者接受治療后往往會出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，從而影響治療效果以及患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸[3]。因此，近年來不少醫(yī)學(xué)研究人員開始將研究重點轉(zhuǎn)移至從天然藥物內(nèi)尋求存在抗腫瘤活性，且毒性較低的成分。小檗堿主要是由黃連等天然植物中提取而來，具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用[4]。鑒于此，現(xiàn)通過研究小檗堿調(diào)控核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響Hp感染人胃癌細(xì)胞增殖與炎癥反應(yīng)的影響并予以分析，深入探究小檗堿應(yīng)用于胃癌中的可能機(jī)制，繼而為臨床胃癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株由課題組細(xì)胞培養(yǎng)室獲得。胃癌HGC-27細(xì)胞系購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏細(xì)胞庫傳代獲得。

1.1.2 藥物 小檗堿(碧云天生物技術(shù)公司，批號：040801)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國，貨號：16000-044、12800017)。超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號：SCB-1360)。二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國，型號：311)。酶標(biāo)儀(Perkin Elmer公司，美國，型號：EnSpire)。DAB顯色試劑盒(博士德生物公司，批號：AR1026)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 建立Hp感染人胃癌細(xì)胞模型：胃癌HGC-27細(xì)胞系培養(yǎng)在普通的DMEM培養(yǎng)基中，配方添加了10%的胎牛血清，1%雙抗儲存液的DMEM的培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。Hp的培養(yǎng)條件氣體環(huán)境是：5%氧氣、85%氮氣及10%二氧化碳，濕度要求為95%。采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d并且通過紫外分光光度計進(jìn)行計數(shù)。按照比例關(guān)系將Hp加入到胃癌細(xì)胞中進(jìn)行共同培養(yǎng)，檢測Hp對胃癌細(xì)胞增殖的影響。

將上述1)細(xì)胞模型分成4組，包括對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組。其中對照組則予以等量生理鹽水干預(yù)；黃連素組予以100 μg/mL濃度小檗堿干預(yù)；5-氟尿嘧啶組予以5 μg/mL的5-氟尿嘧啶干預(yù)；黃連素+5-氟尿嘧啶組則同時予以上述劑量的小檗堿和5-氟尿嘧啶干預(yù);每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.2 檢測指標(biāo)與方法 以流式細(xì)胞儀完成細(xì)胞周期的檢測Hp和胃癌細(xì)胞共同培養(yǎng)3 d后，將對照組和其他組細(xì)胞進(jìn)行消化，磷酸鹽緩沖液洗過之后用細(xì)胞周期檢測試劑盒的實驗步驟進(jìn)行處理，然后在BD FACSCalibur細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，最后的實驗結(jié)果通過flow Jo軟件進(jìn)行分析。

胃癌細(xì)胞增殖情況評估：將Hp感染人胃癌細(xì)胞進(jìn)行消化計數(shù)，在96孔板中每個孔加入1 000個細(xì)胞，12 h后檢測第1次細(xì)胞活力檢測試劑盒(CCK8)數(shù)值，剩余的樣本待細(xì)胞貼壁后按比例關(guān)系將Hp加入到B～黃連素+5-氟尿嘧啶組中，各組都有3個孔的重復(fù)，24 h，48 h和72 h之后再次檢測CCK8數(shù)值。

核因子κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測:采集上述上清液以Bradford法測定IκB激酶α以及P65蛋白濃度。將20 μg蛋白和6×SDS加樣緩沖液混合，以100 ℃煮沸5 min，實施10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上。在室溫條件下封閉4 h加入相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜后洗去一抗，并加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，反應(yīng)2 h。最后以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，光密度掃描定量分析。相關(guān)抗體均購自美國Santa Cruz公司，貨號：91-95-2。

炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測：調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個/mL，接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，于37 ℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行24 h的培養(yǎng)。預(yù)處理1 h后，于37 ℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行24 h的培養(yǎng)。手機(jī)細(xì)胞上清液，遵循酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書完成白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6水平的檢測。相關(guān)試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司，貨號：94218-72-1。

2 結(jié)果

2.1 各組Hp感染人胃癌細(xì)胞增殖情況比較 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組干預(yù)后2 d、3 d時的胃癌細(xì)胞增殖率呈逐漸下降趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 不同處理方式對Hp感染人胃癌細(xì)胞增殖的影響

表1 各組Hp感染人胃癌細(xì)胞增殖

2.2 各組Hp感染人胃癌細(xì)胞周期變化比較 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組感染人變化比較胃癌細(xì)胞G0/G1期、S期呈逐漸下降趨勢，而G2/M期呈逐漸升高趨勢，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Hp感染人胃癌細(xì)胞周期變化比較

2.3 各組核因子κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組IκB激酶α表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢，而P65蛋白表達(dá)水平呈逐漸降低趨勢，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組核因子κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖2 各組IκB激酶α表達(dá)(HE染色，×400)

2.4 各組炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平評價 對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組白細(xì)胞介素-4水平呈逐漸升高趨勢，而白細(xì)胞介素-6呈逐漸下降趨勢，且經(jīng)單因素方差分析可知各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 各組炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平評價

3 討論

目前，臨床上已有不少研究報道證實，Hp感染在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用，屬于胃癌危險因素之一，且臨床上超過50%的胃癌患者均可檢測到Hp感染[5-7]。雖然近年來針對胃癌的治療手段有明顯的進(jìn)步，但療效以及預(yù)后均無法令人滿意，鑒于胃癌的高發(fā)病率以及高死亡率，探討胃癌的具體發(fā)病機(jī)制，并以此為依據(jù)尋找有效的治療手段是研究學(xué)者的首要任務(wù)[8-10]。核因子κB屬于哺乳動物細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子之一，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路于多種腫瘤中均處于活化狀態(tài)，介導(dǎo)了腫瘤的侵襲以及轉(zhuǎn)移過程[11-13]。由此可見，Hp感染可能是通過核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實現(xiàn)對胃癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控，針對這一機(jī)制尋求一種有效的藥物治療方案具有極其重要的意義。小檗堿是近年來胃癌治療研究的熱點[14-16]，然而關(guān)于其對胃癌細(xì)胞核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否產(chǎn)生影響尚無研究證實，具有一定的研究價值。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小檗堿的應(yīng)用可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，且在和5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用時的抑制效果更為明顯。小檗堿可通過將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而促使細(xì)胞無法進(jìn)入S期合成DNA，進(jìn)一步誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，同時促使腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制，最終發(fā)揮治療胃癌的作用[17-18]。此外，對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組感染人胃癌細(xì)胞G0/G1期、S期呈逐漸下降趨勢，而G2/M期呈逐漸升高趨勢，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示小檗堿抑制胃癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期、S期或G2/M期，從而抑制胃癌細(xì)胞的DNA以及蛋白質(zhì)合成，最終發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。另外，P65可通過和P50結(jié)合形成異二聚體，后者屬于核因子κB的重要活化形式，且在正常生理狀態(tài)下，核因子κB(P65/P50)與IκB激酶α結(jié)合，從而以無活性的復(fù)合物定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞遭受細(xì)胞因子或氧化應(yīng)激刺激時，會引起核因子κB(P65/P50)與IκB激酶α的分離，且IκB激酶α?xí)霈F(xiàn)降解，進(jìn)一步影響靶基因的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)，介導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)化，最終影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組IκB激酶α蛋白表達(dá)水平逐漸升高趨勢，而P65蛋白表達(dá)水平呈逐漸降低趨勢，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，小檗堿可能是通過調(diào)控核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，繼而發(fā)揮抑制Hp感染人胃癌細(xì)胞增殖的作用。本研究結(jié)果還顯示，對照組、黃連素組、5-氟尿嘧啶組以及黃連素+5-氟尿嘧啶組白細(xì)胞介素-4水平呈逐漸升高趨勢，而白細(xì)胞介素-6呈逐漸下降趨勢，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中白細(xì)胞介素-6屬于炎癥起始階段重要的炎癥介質(zhì)之一，與急性期炎癥反應(yīng)中可促進(jìn)反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生以及關(guān)節(jié)軟骨組織的損害。白細(xì)胞介素-4則是一種抗炎因子，可有效抑制多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)。二者均被相關(guān)研究報道參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程[19-20]。由此可見，調(diào)控核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響炎癥介質(zhì)的表達(dá)，可能亦是小檗堿抗胃癌的重要機(jī)制之一。

綜上所述，小檗堿具有明顯的抑制Hp感染人胃癌細(xì)胞增殖與炎癥反應(yīng)作用，而發(fā)揮上述作用的主要機(jī)制可能和調(diào)控核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，值得臨床重點關(guān)注。