李桂民 李耀輝 李 哲 曾 璐 見婷雯

(1 陜西中醫(yī)藥大學，西安，712046；2 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安，710003；3 中國中醫(yī)科學院發(fā)展研究中心，北京，100700)

肺癌是我國乃至世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，據全球腫瘤統(tǒng)計數據(GLOBOCAN)估計2018年全球有209萬肺癌新發(fā)患者占癌癥發(fā)病總數的11.6%，以及176萬死亡患者占癌癥總數18.4%[2]，我國癌癥中心估計每年新發(fā)肺癌約為78.7萬例，死亡約為63.1萬，發(fā)病率和死亡率居所有癌癥的首位[3]。證據研究表明吸煙、職業(yè)接觸致癌物、空氣污染、既往肺部疾病等都會增加患肺癌風險，其中吸煙是最主要的肺癌致病因素[4]。早期肺癌患者臨床癥狀不明顯，篩查診斷難度大，肺癌發(fā)現(xiàn)后多為中晚期且預后極差，接受一線化療肺癌患者的總生存率中位數為7～12個月，肺癌嚴重威脅人類的生命健康[5]。目前手術治療、放療、化療、靶向治療是肺癌主要治療手段，但這些方法對中晚期患者都不能達到較好療效。同時放化療靶向治療給患者帶來疼痛、惡心嘔吐、厭食、乏力、便秘、骨髓抑制等嚴重不良反應，同時大部分患者伴有恐懼、焦慮、抑郁等精神問題，這些都嚴重影響患者預后[6]。因此減少患者痛苦、延長生存周期、改善生命質量是肺癌治療重要方向。中藥聯(lián)合放化療很好切合了這一方向，使更多患者受益。

沙參麥冬湯出自清代名醫(yī)吳鞠通的《溫病條辨》，全方由沙參、麥冬、玉竹、天花粉、扁豆、甘草、桑葉組成，是清養(yǎng)肺胃、生津潤燥代表方劑。肺癌中醫(yī)證候梳理顯示放化療及靶向治療患者多以陰虛內熱、氣陰兩虛多見，沙參麥冬湯是益氣養(yǎng)陰良方，臨床研究證實可以有效改善肺癌患者臨床癥狀[7]。現(xiàn)代藥理學研究表明沙參麥冬湯可以減少化療藥物導致的不良反應，提高患者免疫功能，下調血清缺氧誘導因子-1α、誘生型一氧化氮合酶、血管生成素-2水平，改變腫瘤基因表達[8-9]?；颊卟涣挤磻档停委熌褪苄蕴岣哌_到更好的治療效果?，F(xiàn)為進一步研究沙參麥冬湯治療肺癌的藥物作用機制，本研究通過網絡藥理學篩選沙參麥冬湯的主要活性成分、作用靶點、信號通路及潛在網絡關系，探討其治療肺癌的作用機制。

1 資料與方法

1.1 沙參麥冬湯成分與靶點收集 通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫[10]，檢索沙參、麥冬、玉竹、天花粉、扁豆、甘草、桑葉全部化學成分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件篩選主要成分并收集化合物對應靶點，由于TCMSP數據庫獲得“扁豆、玉竹、天花粉”成分較少，且沒有“麥冬”化學成分，故通過中醫(yī)分子機制生物學信息分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[11]進行補充，以Score cutoff≥20且P-value cutoff<0.05為篩選條件。將2個數據庫得到的成分靶點去除重復后合并，得到沙參麥冬湯的成分靶點數據集，借助UniProt(https://www.uniprot.org)數據庫對基因名進行標準化處理[12]。

1.2 肺癌靶點收集 以“Lung Cancer”“Small Cell Lung Cancer”“Non-Small Cell Lung Cancer”為疾病檢索詞，分別在GeneCards(https://www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca)進行搜索，收集肺癌疾病相靶點。

1.3 “活性成分-靶點”網絡圖的繪制 將獲取的成分靶點與疾病靶點通過Venny2.1.0平臺進行映射得到交集靶點，運用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“活性成分-靶點”網絡圖，并根據度值(Degree)，篩選出沙參麥冬湯核心成分。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡的構建 將共有基因導入STRING(https://string-db.org)數據庫獲取蛋白相互作用關系并構建PPI網絡，將獲得的TSV文件導入Cytoscape利用CytoNCA內置插件進行網絡拓撲分析，最終得到核心蛋白。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將成分與疾病共有靶點錄入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)平臺[13]，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，并對數據進行可視化處理。將富集分析結果導入Cytoscape繪制“方劑-活性成分-交集靶點-肺癌-信號通路”圖。

1.6 分子對接 計算“活性成分-靶點”網絡圖中活性成分的度值，將Degree>25的6個活性成分與查閱文獻后保留6個密切度高的核心蛋白進行分子對接，在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取活性成分的2D結構，并借助Chem3D軟件進行結構優(yōu)化。PDB(http://www.rcsb.org)數據庫獲取蛋白結構，通過AutoDockTools軟件進行處理蛋白和小分子配體，AutoDock-Vina進行分子對接計算結合能，Pymol進行數據可視化處理。

2 結果

2.1 沙參麥冬湯活性成分與靶點篩選 通過TCMSP數據庫共獲得活性成分141個，其中沙參9個、玉竹8個、扁豆1個、桑葉29個、天花粉2個、甘草92個，TCMSP數據庫未收錄麥冬。在BATMAN-TCM檢索麥冬20個活性成分，因扁豆、玉竹、天花粉檢索成分較少，所以通過BATMAN-TCM予以補充，其中扁豆10個、玉竹12個、天花粉8個。整合2個數據庫刪除重復成分，因此共獲得沙參麥冬湯活性成分192個，對應靶點3 585個，刪除重復值后對應化合物靶點有866個。

2.2 肺癌靶點整合 將3個數據庫檢索的肺癌靶點進行整合，OMIM獲得508個，GeneCards獲得11 573個，根據文獻經驗Score值越大相關性越強，通過(Relevance Score≥16.85)篩選獲得1 450個，DrugBank獲得310個，去除重復值得到1 910個疾病基因。將疾病基因與藥物靶點取交集，獲得共有基因191個。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點韋恩圖

2.3 “中藥-活性成分-靶點網絡圖”的分析 將191個共有靶點使用Cytoscape 3.8.0構建的“中藥-活性成分-靶點”網絡圖包含330個節(jié)點，1 750條邊。并通過內置數據分析計算出每個節(jié)點的度值(Degree)，度值越大則表示該化合物發(fā)揮治療作用的可能越大。通過網絡分析篩選出度值最大的10個成分。化合物為:Quercetin、Stigmasterol、Beta-Carotene、Kaempferol、Beta-Sitosterol、Glabrene、Naringenin、Arachidonic Acid、Formononetin、Glabridin。見表1。因此我們預測上述10個化合物可能是沙參麥冬湯治療肺癌的重要成分。見圖2。

表1 度值前10活性成分

圖2 “中藥-活性成分-靶點”網絡

2.4 PPI網絡構建與分析 將獲得的數據錄入Cytoscape進行網絡分析，得到106個節(jié)點，742條邊。平均Degree值為7，PPI網絡圖Degree值越大顏色越深節(jié)點越大。見圖3。CytoNCA是蛋白互作網絡集中性分析和評估的算法之一,使用CytoNCA插件對核心聚類蛋白進行分析，以Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC等6個值為篩選條件,篩選流程見圖4。經過2次篩選得到10個基因核心互作網絡。見表2。

圖3 PPI網絡

圖4 CytoNCA篩選流程

表2 CytoNCA核心蛋白

2.5 GO富集分析 借助Metascape數據庫進行GO富集分析，得到2 684條生物過程(BP)，主要與無機物的反應、血管發(fā)育、凋亡信號通路、細胞死亡的正調控、細胞增殖負調控、細胞分化負調控等功能有關；得到117條細胞組分(CC)，主要與轉錄因子復合物、死亡誘導信號復合物、細胞體、細胞外基質、早期內小體、細胞質核周區(qū)等有關；得到210條分子功能(MF)，主要與轉錄因子結合、激酶結合、蛋白質同聚活性、細胞因子受體結合、蛋白酶結合、蛋白質結構域特異性結合等功能相關。根據富集基因數目繪制柱狀圖。見圖5。

圖5 交集靶點GO富集分析

2.6 KEGG通路分析 使用Metascape數據庫進行KEGG富集分析，得到366條富集通路，結果顯示基因主要富集在癌癥途徑、TNF信號通路、蛋白多糖在癌癥中的作用、癌組織中的微RNA、鉑耐藥、腫瘤的轉錄調控失調、核因子κB信號通路等信號通路。見圖6。使用Cytoscape繪制“沙參麥冬湯-活性成分-關鍵靶點-肺癌-信號通路”見圖7。

圖6 交集靶點KEGG富集分析

圖7 “沙參麥冬湯-活性成分-關鍵靶點-肺癌-信號通路”網絡圖

2.7 分子對接分析 為了進一步探討沙參麥冬湯對肺癌的作用關系，借助AutoDock Vina軟件進行分子對接，將度值最高的6個活性成分(Quercetin、Stigmasterol、Beta-Carotene、Kaempferol、Beta-Sitosterol、Naringenin)與6個密切度最高的蛋白(STAT3、MAPK14、TP53、TNF、IL-6、MYC)進行分子對接。據有關文獻研究成分與蛋白結合自由能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)認為二者結合穩(wěn)定[14]。結果顯示活成成分與蛋白結合能均小于-5 kcal/mol。見表3。以上對接結果表明了沙參麥冬湯中活性成分與肺癌的靶點基因有著很好的結合作用。

表3 核心活性化合物與核心蛋白結合能(kcal/mol)

圖8 部分蛋白和活性成分分子對接圖

3 討論

肺癌是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，沙參麥冬湯聯(lián)合放化療治療肺癌有獨特優(yōu)勢?，F(xiàn)代藥理研究表明麥冬湯具有提高人體免疫力、保護胃黏膜、抗炎、抗腫瘤的作用[15]。通過上調Smad7信號變大與抑制TGF-β1信號通路，減緩腫瘤微環(huán)境及腫瘤血管生成，而控制人類癌細胞的生長、黏附和轉移[16]。降低患者白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，減輕炎癥反應[17]。提高患者CD3+T、CD4+T淋巴細胞比例，提高CD4+/CD8+T淋巴細胞比值，提高患者免疫力，減輕患者惡心、嘔吐、腹瀉、食欲不振、乏力等不良反應[9,18-19]。

本研究通過對沙參麥冬湯的活性成分篩選，發(fā)現(xiàn)槲皮素、豆甾醇、β-胡蘿卜素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、花生四烯酸等化合物分子與肺癌的靶點具有高度活性?；A研究報道槲皮素具有抑制腫瘤細胞傳導、增強化療敏感性、誘導腫瘤細胞凋亡或自噬等作用，通過激活AMPK-mTOR信號通路，促進肺癌細胞株A549細胞自噬抑制細胞增殖[20]。抑制ADAM9(解整聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶家族成員)的表達，降低肺癌細胞的侵襲能力，促進組織纖溶酶原激活物介導的遷移蛋白的裂解抑制細胞遷移和侵襲，還可以抑制腫瘤骨轉移并延長壽命[21]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌的藥理作用，抑制肝癌細胞的增殖并誘導其凋亡，降低腫瘤壞死因子-α的轉錄，破壞腫瘤血管生成抑制膽管癌生長，通過抑制JAK/STAT信號通路，降低胃癌細胞增殖遷移，與肺癌的關聯(lián)性有待研究證明[22]。β-胡蘿卜素具有抗氧化作用，通過抑制細胞核分裂，誘導肺癌YTMLC-90細胞凋亡[23]，調節(jié)DNA甲基化，修復DNA損傷，增強抗腫瘤免疫反應，同時攝入β-胡蘿卜素可以降低患肺癌的風險[24]。山柰酚是一種可以抑制腫瘤發(fā)生的飲食類黃酮，研究證明山柰酚抑制肺癌A549細胞形成和損傷修復，通過TGF-β通路降低癌細胞侵襲和遷移能力[25]，調節(jié)miR21/PTEN信號通路抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖[26]。上調miR-340的表達使PI3K/AKT通路失活而抑制肺腺癌A549細胞增殖，誘導細胞凋亡和自噬[27]。β-谷甾醇抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。柚皮素通過P38 MAPK通路誘導細胞肺癌發(fā)生氧化應激反應，使A549細胞產生凋亡和增殖抑制[29]，抑制TNF-α的血管平滑肌細胞因子，限制腫瘤細胞生長并誘導癌細胞凋亡[30]。由此可見，這些活性成分通過影響癌細胞周期、凋亡、增殖、侵襲，血管生成、轉移和炎癥等多途徑實現(xiàn)抗癌作用，是沙參麥冬湯治療肺癌的主要物質基礎。

研究基于網絡藥理學將獲得的191個疾病藥物共有靶點進行PPI核心網絡分析，得到10個關鍵靶點為JUN、MAPK8、MYC、MAPK14、STAT3、MAPK1、RELA、TP53、IL-6。其中MAPK8、MAPK14、MAPK1皆為促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)家族蛋白。MAPK調控異常與腫瘤細胞增殖、轉移及侵襲密切相關[31]。JUN是活化蛋白-1(Activating Protein-1,AP-1)轉錄因子的關鍵亞基，在調節(jié)細胞增殖和分化中起著至關重要的作用，與多種蛋白和信號通路直接相互作用使癌細胞的增殖抑制[32]。信號轉導及轉錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3的激活與惡性腫瘤之間的關系十分密切，是致癌信號轉導通路中的重要分子，直接參與肺癌的發(fā)生發(fā)展[33]，提高肺癌細胞對順鉑的敏感性。腫瘤蛋白P53(Tumor Protein P53，TP53)是腫瘤相關性較高的抑癌基因，在肺癌中易發(fā)生基因突變，破壞腫瘤抑制因子的功能，對臨床用藥和預后具有指導意義[34-35]。MYC可以消除干擾素反應性的障礙，增強T細胞的吸引力，并引起直接的抗腫瘤細胞增殖作用[36]。沙參麥冬湯的以上靶點發(fā)揮了對肺癌的治療功效，分子對接驗證了篩選的有效成分和蛋白靶點之間密切結合。

在KEGG候選靶標的通路富集分析中，蛋白多糖在癌癥中充當癌癥生物學的負調節(jié)劑，抑制生長信號轉導影響細胞增殖，作用于血管內皮生長因子信號轉導，調節(jié)腫瘤中的血管生成[37]。作用于上皮細胞黏附分子從而在調節(jié)癌細胞的黏附和遷移[38]。TNF信號通路屬腫瘤壞死因子超家族。參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程的調節(jié)。研究表明微RNAs參與了肺癌的發(fā)病機制，參與細胞生長、凋亡、發(fā)育和分化等多種生物學過程[39]。微RNA-134被證明能調節(jié)細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉換，降低EGFR的表達抑制腫瘤生長?？勺鳛楸砥どL因子受體靶向治療的抗腫瘤藥物[40]；微RNA-34a通過調節(jié)Bcl-2、SIRT1、E2F3、Fra-1通路能夠誘導細胞凋亡，抑制細胞遷移和腫瘤生長[41]；微RNA-31通過靶向BAP-1mRNA降低BAP-1蛋白水平，誘導肺癌增殖和抑制凋亡[42]。微RNA15/16直接調節(jié)肺癌細胞周期蛋白D1、D2和E1，誘導細胞周期G1期阻滯[43]，微RNA-16通過靶向Bcl-2使對紫杉醇耐藥肺癌細胞重新敏感[44]。核因子κB信號通路與惡性腫瘤的發(fā)展關系密切，能抑制腫瘤細胞增殖、轉移、干預炎癥，過度活化干擾腫瘤微環(huán)境，改變腫瘤細胞生物學特征，加劇腫瘤發(fā)展[45]。

綜上所述，沙參麥冬湯治療肺癌的作用機制，是中藥復方多成分、多靶點、多通路、協(xié)同治療的過程，沙參麥冬湯可能通過槲皮素、豆甾醇、山柰酚等成分與STAT3、MAPK1、TP53等蛋白結合，通過蛋白多糖、微RNA、腫瘤的轉錄調控失調等信號通路，通過影響細胞周期、凋亡、增殖、自噬，腫瘤血管生成，腫瘤細胞轉移，減少炎癥反應，提高機體免疫能力，提高化療藥物敏感性等多方面達到肺癌協(xié)同治療作用。