張嘉偉 文麗梅 胡君萍 楊建華

(1 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊，830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊，830011)

原發(fā)性肝癌是全球高發(fā)病率和致死率的惡性腫瘤之一，5年內(nèi)的生存率僅為7%[1]。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是其中最主要的病理類型，占85%以上[2]。最新數(shù)據(jù)表明，我國(guó)HCC的病死率和發(fā)病率分別排在所有惡性腫瘤的第3位和第4位，具有發(fā)展較快、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[3-4]。肝癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其發(fā)生可能與宿主基因多態(tài)性、環(huán)境因素(包括代謝綜合征和黃曲霉毒素B1)、飲酒和病毒因素(包括乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染)的相互作用有關(guān)[5]。中藥可用于晚期HCC患者，具有抗腫瘤、減少放療化療的不良反應(yīng)、提高腫瘤患者免疫力、改善生命質(zhì)量等作用[6]。

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖[7]，具有補(bǔ)腎、益精、潤(rùn)燥、通便的功效，是我國(guó)西北干旱地區(qū)特有的名貴補(bǔ)益類藥材，應(yīng)用歷史悠久。肉蓯蓉始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味甘、微溫。主五勞七傷，補(bǔ)中，除莖中寒熱痛，養(yǎng)五臟，強(qiáng)陰，益精氣，多子，婦人癥瘕，久服輕身”，被列為上品[8]。肉蓯蓉苯乙醇總苷(Phenylethanoid Glycosides from Cistanche，CPhGs)作為肉蓯蓉中的主要有效成分，包括毛蕊花糖苷、松果菊苷、紅景天苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、管花苷B等[9]，具有肝臟保護(hù)、抗癡呆、抗疲勞、缺血保護(hù)、抗骨質(zhì)疏松、潤(rùn)腸通便、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老及改善生殖等作用[10]。已有研究證明，CPhGs具有良好的防治肝癌作用。Yuan等[11]的研究表明CPhGs通過(guò)外源性和內(nèi)源性凋亡途徑抑制H22細(xì)胞的生長(zhǎng)。胡瓊等[12]發(fā)現(xiàn)CPhGs能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能與CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP的含量，提高荷瘤小鼠的免疫力有關(guān)。目前，尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)CPhGs防治HCC作用及其分子作用機(jī)制的深入研究，其活性成分、作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將現(xiàn)有的“一靶一藥”方式更新為“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)-多成分”的研究方式，即在此基礎(chǔ)上對(duì)中藥的療效進(jìn)行綜合分析，從系統(tǒng)視角和分子水平探索中醫(yī)藥，構(gòu)建中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)新思路[13-14]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，基于中醫(yī)藥整體觀，對(duì)CPhGs防治HCC的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)探討，結(jié)合“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)模式，預(yù)測(cè)CPhGs防治HCC作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，闡述CPhGs多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用機(jī)制，為顯著提升CPhGs的藥用資源開發(fā)領(lǐng)域，為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 CPhGs類成分的收集 通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)等數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合國(guó)家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(kù)(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)文獻(xiàn)，收集CPhGs類的化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息。通過(guò)在TCMSP、ETCM、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)內(nèi)檢索，最終確定29個(gè)化合物作為候選化合物[15-16]。

1.2 藥物潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及“中藥-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將檢索得到成分的SDF格式文件導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，并采用UniProt KB搜索功能對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正。運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 HCC相關(guān)基因的篩選 將“Hepatocellular Carcinoma”“HCC”作為關(guān)鍵詞在以下4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲得HCC靶點(diǎn)的信息：1)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)；2)DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)；3)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)；4)治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database，TTD，http://db.idrblab.net/ttd)。篩選后將靶點(diǎn)信息進(jìn)行匯總整理。

1.4 CPhGs治療HCC的靶點(diǎn)映射 通過(guò)在線繪圖軟件制作韋恩圖，將CPhGs類成分作用靶點(diǎn)與HCC靶標(biāo)進(jìn)行映射，交集靶點(diǎn)即為CPhGs類成分治療HCC潛在作用靶點(diǎn)，通過(guò)韋恩圖確定CPhGs類成分與HCC的藥物-疾病交集靶點(diǎn)。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)進(jìn)行共有靶點(diǎn)的PPI分析，設(shè)置Combined Score>0.4，并將結(jié)果利用Cytoscape 3.8.0進(jìn)行拓?fù)浞治觯远戎荡笥谥形粩?shù)的2倍篩選出關(guān)鍵共有靶點(diǎn)。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CPhGs和HCC共同作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P≤0.05，篩選出具有顯著性差異的生物過(guò)程和通路，并通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白用于分子對(duì)接，從RCSBPDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取這些靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取這些靶點(diǎn)的活性成分的結(jié)構(gòu)文件，利用Autodock_vina軟件計(jì)算靶點(diǎn)蛋白與活性成分間的最低結(jié)合能并將分子對(duì)接模擬驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 肉蓯蓉苯乙醇總苷的活性成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 最終確定29個(gè)化合物作為候選化合物，包括Echinacoside、Acteoside、Isoacteoside、2′-Acetylacteoside、Tubuloside A等基本信息。見(jiàn)表1。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及PharmMapper預(yù)測(cè)出成分的靶標(biāo)并去重后，獲得410個(gè)可能的靶標(biāo)。

表1 肉蓯蓉苯乙醇苷類成分基本信息

2.2 “中藥-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 “中藥-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)涉及439個(gè)節(jié)點(diǎn)，7 515條邊。圖中白色節(jié)點(diǎn)為中藥；圖中黃色節(jié)點(diǎn)中的縮寫為成分名稱，如PhGs9為Acteoside，其余略；圖中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為靶標(biāo)名稱，如CASP3為Caspase-3蛋白。見(jiàn)圖1。

圖1 CPhGs類成分“中藥-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

2.3 HCC疾病靶點(diǎn)的獲取及CPhGs類成分靶點(diǎn)映射 共獲得HCC相關(guān)靶點(diǎn)1 944個(gè)。通過(guò)韋恩圖將CPhGs成分預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與HCC的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)共有173個(gè)交集靶點(diǎn)，即CPhGs治療HCC的作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 CPhGs-HCC共同靶點(diǎn)數(shù)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 CPhGs治療HCC的靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)涉及173個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 202條邊。見(jiàn)圖3。度值中位數(shù)為20，根據(jù)度值大于中位數(shù)2倍篩選出核心網(wǎng)絡(luò)蛋白29個(gè)，包括ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AA1、MAPK8、ESR1、MMP2、RHOA、MAPK14、ANXA5、CAT、MDM2、KDR、PIK3R1、CDC42、MAP2K1、STAT1、GRB2、AR、IL-2、NOS3、IGF1R、JAK2。以上靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的位置，表明其在CPhGs治療HCC中可能發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖4。

圖3 CPhGs治療HCC潛在作用靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI核心基因柱狀圖

2.5 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析 將篩選出的29個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，得到生物過(guò)程(Biological Process，BP)65條，主要包括蛋白質(zhì)磷酸化，細(xì)胞增殖、遷移、凋亡，腎上腺素信號(hào)通路等；細(xì)胞組分(Cellular Components，CC)18條，主要與細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞間連接，細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)等有關(guān)；分子功能(Molecular Function，MF)23條，主要與蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等有關(guān)。見(jiàn)圖5。以上數(shù)據(jù)P值均小于0.05。通過(guò)KEGG富集得到92條信號(hào)通路(P<0.05)，主要涵蓋癌癥信號(hào)通路(hsa05200：Pathways in Cancer)、癌癥蛋白聚糖通路(hsa05205：Proteoglycans in Cancer)、PI3K-AKT信號(hào)通路(hsa04151：PI3K-AKT Signaling Pathway)、RAS信號(hào)通路(hsa04014：Ras Signaling Pathway)、FoxO信號(hào)通路(hsa04068：FoxO Signaling Pathway)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(hsa04370：VEGF Signaling Pathway)等，排名前20的通路。見(jiàn)圖6。

圖5 CPhGs潛在靶標(biāo)的GO富集分析

圖6 CPhGs潛在靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

2.6 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 CPhGs治療HCC的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)共有79個(gè)節(jié)點(diǎn)和901條邊，涉及29種活性成分、29個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)、20條KEGG通路，體現(xiàn)了CPhGs可能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮多效應(yīng)的特點(diǎn)。見(jiàn)圖7。

圖7 CPhGs成分治療HCC的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的度值選擇CPhGs活性成分5個(gè)(毛蕊花糖苷、松果菊苷、2-乙酰毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A)與PPI分析中度值排名前10的靶點(diǎn)蛋白(ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AA1)進(jìn)行分子對(duì)接，篩選對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能低的分子構(gòu)象即為最優(yōu)對(duì)接結(jié)果，其中活性成分與蛋白間的結(jié)合能等信息。見(jiàn)表2。具體對(duì)接過(guò)程見(jiàn)圖8。結(jié)果顯示，50個(gè)對(duì)接結(jié)果均有較優(yōu)的(Total Score≤-5.0)對(duì)接活性，其中，43個(gè)對(duì)接結(jié)果有強(qiáng)烈的匹配活性(Total Score≤-7.0)。以上對(duì)接結(jié)果充分表明，CPhGs活性組分與HCC關(guān)鍵核心靶基因的結(jié)合作用良好。

表2 活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能(kcal/mol,1 cal=4.184 J)

圖8 靶點(diǎn)受體蛋白與活性成分的分子對(duì)接模式

3 討論

HCC是嚴(yán)重威脅人類健康的十大惡性腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，治療困難、轉(zhuǎn)移概率高的特點(diǎn)[17]。HCC是各種信號(hào)通路及細(xì)胞因子共同參與的病理生理過(guò)程，因此單靶點(diǎn)、單通路治療很難起效。中藥具有多成分、多作用靶點(diǎn)和作用途徑復(fù)雜等特點(diǎn)，并以“人”為核心，將整體與局部相關(guān)聯(lián)，通過(guò)中藥有效成分在體內(nèi)的代謝過(guò)程，進(jìn)而從系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)機(jī)體的調(diào)控。

通過(guò)“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，CPhGs類成分毛蕊花糖苷、松果菊苷、紅景天等均具有較高的防治肝癌活性，在治療過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。毛蕊花糖苷對(duì)環(huán)境、飲食及二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝癌具有預(yù)防作用，其發(fā)揮作用可能是由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3依賴性的氧化應(yīng)激和凋亡調(diào)控介導(dǎo)的[18]。另外，毛蕊花糖苷可通過(guò)干擾JNK信號(hào)通路的激活和調(diào)控自噬蛋白的表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖[19]。研究表明，松果菊苷(ECH)能抑制二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌，并對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞株具有抗增殖和促凋亡作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低骨髓細(xì)胞觸發(fā)受體2(Triggering Receptors Expressed on Myeloid Cells 2，TREM2)的表達(dá)和PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤活性[20]。紅景天苷聯(lián)合奧沙利鉑給藥可以提高HCC患者的化療療效，通過(guò)抑制HIF-1α信號(hào)通路，顯著提高HCC患者對(duì)鉑類藥物的敏感性，抑制缺氧誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transformation，EMT)[21]。

綜上所述，目前針對(duì)CPhGs類成分防治HCC的作用機(jī)制研究較少，尚未見(jiàn)有關(guān)CPhGs防治HCC作用機(jī)制的報(bào)道?；诖耍菊n題應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)CPhGs防治HCC的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，豐富和完善中藥、天然藥物治療HCC的研究資料，拓展新疆地產(chǎn)藥材肉蓯蓉的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

本研究的PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析顯示，CPhGs治療HCC的核心靶點(diǎn)有29個(gè)，其中包括AKT1，PIK3R1，STAT1，SRC，MAPK1，CASP3，MAPK8，MAPK14，IGF1R等，均涉及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖過(guò)程。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述29個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示CPhGs可以對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞免疫等生物過(guò)程起調(diào)控作用，涉及細(xì)胞膜、核、質(zhì)、細(xì)胞器膜及細(xì)胞空間等細(xì)胞組成過(guò)程，并通過(guò)與蛋白、酶各類受體結(jié)合等分子功能產(chǎn)生活性。KEGG功能富集分析結(jié)果顯示，CPhGs防治HCC可能是通過(guò)調(diào)控癌癥信號(hào)通路、癌癥蛋白聚糖通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中均涉及PI3K/AKT信號(hào)通路，其作用尤為關(guān)鍵。

PI3K/AKT信號(hào)通路在肝癌的起始過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，涉及多種生物學(xué)過(guò)程，如增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、抗輻射、能量代謝和自噬等[22-23]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是由調(diào)節(jié)亞單位p85和催化亞單位p110組成的異源性二聚體。根據(jù)底物和序列同源性，將PI3K分為3個(gè)亞型，都能磷酸化磷脂酰肌醇第3位羥基，從而產(chǎn)生特定的磷酸肌醇形式而發(fā)揮作用[24]。蛋白激酶B是位于PI3K下游的靶蛋白，是細(xì)胞增殖和存活的重要調(diào)節(jié)因子。目前，已經(jīng)鑒定出3種AKT基因，分別稱為AKT1、AKT2和AKT3。抑制AKT活性可誘導(dǎo)一系列哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡，因此，將蛋白激酶B抑制劑與抗癌藥物聯(lián)合治療具有突變的腫瘤有一定的療效[25]。

本研究將“中藥-活性成分--靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中排名前5的核心活性化合物與PPI分析中度值排名前10的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)一步明確其發(fā)揮效用的治療機(jī)制。采用Autodock vina進(jìn)行對(duì)接，選取親和力最佳的構(gòu)象，其中最低結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol即表明藥效分子與蛋白對(duì)接效果良好,結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越佳。本研究結(jié)果提示肉蓯蓉中的苯乙醇苷類活性化合物與蛋白激酶B1、HSP90AA1等靶標(biāo)結(jié)合后最低結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，表明其具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，充分驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果。蛋白激酶B是一種人類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是AGC蛋白激酶家族的成員[26]。蛋白激酶B在大多數(shù)癌癥類型中都高度表達(dá)，包括HCC、肺癌、乳腺癌和以及結(jié)腸癌，其中蛋白激酶B1是治療癌癥的主要藥物靶點(diǎn)，在細(xì)胞增殖和抗凋亡的過(guò)程中發(fā)揮作用。有研究表明沉默蛋白激酶B1能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可有效上調(diào)腫瘤抑制人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的表達(dá)、減少Notch1的表達(dá)，靶向蛋白激酶B1可以抑制HCC的發(fā)展[27]。熱激蛋白90α(Heat Shock Protein 90α，Hsp90α)由HSP90AA1基因編碼，是分子伴侶Hsp90的誘導(dǎo)亞型，是真核生物中高度保守且必不可少的伴侶蛋白[28]。HSP90已成為治療癌癥中的關(guān)鍵目標(biāo)，Hsp90與多種促進(jìn)腫瘤發(fā)生的蛋白相互作用，因此，Hsp90是一個(gè)重要的致癌因子。研究表明，HCC患者血清HSP90AA1水平明顯高于健康對(duì)照組[29]，分泌型HSP90AA1可能是HCC良好的生物標(biāo)志物，被批準(zhǔn)用于中國(guó)HCC的臨床診斷[30]。

綜上所述，本文以CPhGs主要活性成分為研究對(duì)象，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析其潛在的防治HCC靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并結(jié)合分子對(duì)接方法初步驗(yàn)證了CPhGs主要活性成分能與HCC靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。