李 敏 郭 淼 孫建華 翟鳳霞 李 娜

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州，450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州，450000)

早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Failure，POI)是指40歲之前的女性因卵巢功能減退而出現(xiàn)的一系列臨床綜合征，影響女性生育力及身心健康，其臨床患病率為1%～3%[1]。目前，激素補(bǔ)充是西醫(yī)臨床主要治療方案，即單純雌激素治療，雌孕激素序貫或連續(xù)聯(lián)合治療和陰道局部應(yīng)用雌激素治療[2]。這些治療方案對調(diào)整月經(jīng)周期，改善低雌激素狀態(tài)，緩解并發(fā)癥狀具有一定的治療作用，但在臨床應(yīng)用存在一定的禁忌證及潛在的血栓、腫瘤等風(fēng)險[3]。

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家普遍認(rèn)為該病虛實(shí)夾雜，但總以腎氣虧損為基本病機(jī)。因此當(dāng)以滋補(bǔ)腎氣為主要治療原則。二仙湯是第六批全國名老中醫(yī)藥專家王麗娜教授治療POI的常用方，該方具有溫腎陽，補(bǔ)腎精，交通心腎，調(diào)理沖任的功效。二仙湯聯(lián)合西藥治療POI相較于單純西藥，在療效及安全性方面，具有明顯的優(yōu)越性[4]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，二仙湯能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的作用[5-6]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)支持[7]，本研究旨在活性成分、核心作用靶基因及信號通路方面，系統(tǒng)闡釋二仙湯作用于POI的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究做準(zhǔn)備。

1 資料與方法

1.1 篩選、獲取二仙湯活性成分和靶基因 本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php),以藥物口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件，篩選二仙湯的6味藥物仙茅、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、當(dāng)歸的活性成分[8]。并在該數(shù)據(jù)庫中查詢藥物活性成分所對應(yīng)的靶基因，建立藥物靶基因數(shù)據(jù)集。

1.2 查詢、收集疾病靶基因 將POI的英文名稱“Premature Ovarian Insufficiency”分別輸入在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)進(jìn)行查詢，以獲得POI相關(guān)的疾病靶基因，建立疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

1.3 構(gòu)建藥物活性成分與作用靶基因的網(wǎng)絡(luò) 利用ClusterProfiler軟件包進(jìn)行韋恩分析，取疾病靶基因與藥物活性成分靶基因的交集，建立疾病-藥物數(shù)據(jù)集，將該數(shù)據(jù)集與活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集共同導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制藥物活性成分與作用靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化。

1.4 預(yù)測二仙湯作用于POI的核心靶基因 將交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲得二仙湯活性成分靶基因和POI相關(guān)靶基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出核心靶基因。

1.5 二仙湯治療POI的生物學(xué)過程與通路分析 采用ClusterProfiler軟件包對作用靶基因先后進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，并繪制通路圖，進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯的活性成分篩選 得出92個活性成分，并將其作為候選化合物。這些成分相對應(yīng)靶基因205個，整理活性成分靶基因數(shù)據(jù)集。

2.2 疾病靶基因篩選 通過OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫分別收集到靶基因392個、3 032個，去重后共計3 425個，整理為疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

2.3 藥物活性成分-作用靶基因網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 由圖1可知，有173交集靶基因，即為二仙湯治療POI的作用靶基因。圖2包括239個節(jié)點(diǎn)，代表藥物活性成分和作用靶基因，1 153條邊。二仙湯的主要活性成分為Stigmasterol(豆甾醇)、Kaempferol(山柰酚)、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Luteolin(木犀草素)、Anhydroicaritin(淫羊藿苷元)、Quercetin(槲皮苷)等。

圖1 二仙湯-POI靶基因韋恩圖

圖2 藥物活性成分-作用靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 二仙湯對POI核心靶基因的預(yù)測 結(jié)果顯示：Degree值最大是36，最小是1。其中排名前4的基因是AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶1(MAPK1)、活化蛋白(AP)-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(JUN)、核因子κB/p65(RELA)。見圖3。

圖3 二仙湯與POI的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 二仙湯治療POI核心靶基因GO富集分析 生物過程(Biological Process，BP)條目1 939個，富集基因數(shù)量較大的有對營養(yǎng)水平的反應(yīng)(Response to Nutrient Levels)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(Response to Oxidative Stress)、對金屬離子的響應(yīng)(Response to Metal Ion)、對脂多糖反應(yīng)(Response to Lipopolysaccharide)、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)(Response to Molecule of Bacterial Origin)、類固醇激素反應(yīng)(Response to Steroid Hormone)等。見圖4。細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)條目72個，富集基因數(shù)量較大的有膜筏(Membrane Raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(Membrane Microdomain)、膜區(qū)域(Membrane Region)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(Transcription Factor Complex)、神經(jīng)元胞體(Neuronal Cell Body)等。見圖5。分子功能(Molecular Function，MF)條目141個，富集基因數(shù)量較大的有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-Binding Transcription Activator Activity，RNA Polymerase II-Specific)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(Ubiquitin-Like Protein Ligase Binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(Cytokine Receptor Binding)、受體配體活性(Receptor Ligand Activity)等。見圖6。KEGG通路富集篩選得到164條信號通路，根據(jù)富集基因數(shù)量進(jìn)行排序，選擇前20個通路進(jìn)行柱狀圖展示，其基因靶基因主要富集于Toll樣受體信號通路(Toll-Like Receptor Signaling Pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF Signaling Pathway)、低氧因子信號通路(HIF-1 Signaling Pathway)、T細(xì)胞受體信號通路(T Cell Receptor Signaling Pathway)等相關(guān)信號通路。

圖4 作用靶基因的GO-BP分析氣泡圖(前20條)

圖5 作用靶基因的GO-CC分析氣泡圖(前20條)

圖6 作用靶基因的GO-MF分析氣泡圖(前20條)

2.6 二仙湯治療POI信號通路的KEGG富集分析 圖7X軸代表富集在信號通路上的基因數(shù)目，顏色代表富集的相關(guān)性。由圖可知，主要涉及PI3K-AKT Signaling Pathway、MAPK Signaling Pathway、TNF Signaling Pathway等信號通路。

圖7 作用靶基因的KEGG分析柱狀圖(前20條)

3 討論

二仙湯通過包括槲皮苷、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素等在內(nèi)的66個有效成分作用于POI。槲皮苷是一種能促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵巢顆粒細(xì)胞增殖的黃酮類化合物，可促使雌激素分泌，以改善雷公藤多苷致POF動物模型的卵巢功能[9]。山柰酚也是在植物中提取的黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可通過下調(diào)Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch Intracellular Domain，NICD)mRNA的表達(dá)，降低Notch1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑制卵巢細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)其凋亡的作用[10]。曾莉萍等[11]研究觀察到β-谷甾醇具有雌激素活性，具有誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞分化，促進(jìn)雌激素合成的作用。豆甾醇與β-谷甾醇同為植物甾醇類雌激素，具有降低血清中膽固醇水平的功能[12]，改善低雌激素水平下的心腦血管的功能。木犀草素在卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，當(dāng)其濃度達(dá)到12.5 μg/mL時，能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素[13]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)可知，二仙湯治療POI可能主要通過作用MAPK1、AKT1、JUN、RELA等靶標(biāo)來發(fā)揮作用。細(xì)胞外因子激活MAPK，由此可將信號由細(xì)胞表面?zhèn)魉椭良?xì)胞核內(nèi)部。MAPK1基因蛋白在卵巢發(fā)育后期的前期卵巢中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在卵母細(xì)胞及卵巢的發(fā)育和成熟過程中該基因可能起重要作用[14]。AKT1參與增殖、存活、生長等多種生物學(xué)過程?；罨牡鞍准っ窧可激發(fā)下游的叉頭盒O類1A(Forkhead Box，Class O，1A，F(xiàn)oxo1a)mRNA的表達(dá)，從而影響卵巢顆粒細(xì)胞的增殖[15]?；罨鞍?1是有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的JUN蛋白，在不同疾病中表現(xiàn)出上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)。作為核因子κB家族的重要成員之一，RELA通過對靶的調(diào)節(jié)，發(fā)揮在顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡、免疫應(yīng)答等過程中相關(guān)作用[16]。

KEGG分析結(jié)果顯示，二仙湯通過PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路等作用于POI。PI3K-AKT信號通路參與原始卵泡的發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖和分化等生物過程[17]。促卵泡素促進(jìn)顆粒細(xì)胞中蛋白激酶B的磷酸化，并通過PI3K-AKT信號通路抑制顆粒細(xì)胞凋亡[18]。MAPK信號通路對卵巢的顆粒細(xì)胞增殖發(fā)揮促進(jìn)或抑制雙面作用，即，各種因子可通過MAPK信號通路能夠發(fā)揮對卵巢顆粒細(xì)胞上調(diào)、下調(diào)的作用[19]。國內(nèi)回顧性研究發(fā)現(xiàn)POI患者血清中TNF-α水平低于正常水平，而在POI的發(fā)病過程中，TNF-α起著重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，加入TNF-α的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞,表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力,即TNF-α能促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞增殖[21]。

綜上所述，就活性成分、靶基因、信號通路三方面而言，二仙湯治療POI是具有多途徑的，這為之后開展動物與臨床試驗(yàn)研究，提供一定的依據(jù)。