劉大朋 李 影 孫作乾 宋 濤 陳 敏

（棗莊科技職業(yè)學院醫(yī)學技術系臨床醫(yī)學教研室，滕州 277599）

心肌細胞凋亡參與多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展，可導致心肌損傷，進而引起炎癥反應，而炎癥細胞浸潤又會加劇心肌細胞凋亡［1-2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α等的分泌，炎癥因子可通過直接或間接方式導致心肌損傷［3］。梔子是我國傳統(tǒng)的常用中藥材，主要含環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、黃酮、皂苷、多糖等化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用［4］。梔子苷可減輕高脂飲食誘導的心肌炎癥和心肌細胞凋亡［5］。梔 子 苷 可 通 過 上 調miR-145-5p表 達 保 護PC12細胞免受LPS引起的炎癥損傷［6］。梔子苷通過下調THRIL減輕心肌細胞的損傷和心臟功能障礙［7］。但梔子多糖對LPS誘導的心肌細胞炎癥反應及凋亡的影響及機制尚不清楚。miRNA不僅參與細胞增殖、分化、凋亡，還參與炎癥免疫等［8］。研究發(fā)現miR-141-3p在內毒素血癥大鼠心肌組織中表達下調，可能與心肌損傷發(fā)生有關［9］。小鼠胚胎成纖維細胞衰老中miR-141-3p表達下降，可能通過調控Keap1-Nrf2/ARE氧 化 應 激 通 路 加 速 衰 老［10］。miR-141-3p對LPS誘導的心肌細胞炎癥反應及凋亡的影響尚不清楚，且梔子多糖影響心肌細胞炎癥反應及凋亡的機制是否與miR-141-3p相關尚未可知。本研究旨在研究梔子多糖對心肌細胞炎癥反應及凋亡的影響及其機制是否與miR-141-3p有關。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細胞H9C2購自深圳市百恩維生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LPS購自北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；梔子多糖購自云南麥瑞科生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自上海繼錦化學科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC和PI試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；熒光定量試劑盒購自美國Progema公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組H9C2細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，將其分為對照組（Con）、LPS組、梔子多糖低、中、高濃度組；對照組細胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS組細胞采用100 ng/ml LPS處理，梔子多糖低、中、高濃度組細胞分別采用終濃度為2.5、5、10μmol/L的梔子多糖和100 ng/ml LPS共同培養(yǎng)。

將anti-miR-NC、anti-miR-141-3p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF6分別轉染至H9C2細胞，再采用10μmol/L梔子多糖和100 ng/ml LPS處理，記為LPS+Experiment-H+anti-miR-NC組、LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p組、LPS+Experiment-H+pcDNA 3.1組、LPS+Experiment-H+pcDNA3.1-KLF6組。

1.2.2 ELISA檢測IL-1β、TNF-α水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 Western blot檢 測Bax、KLF6蛋 白 表 達提取細胞總蛋白，定量后取60μg進行SDSPAGE，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后分別加入一抗和二抗孵育，暗室中曝光顯影、定影，分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白表達。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)48 h，漂洗后加入10μl Annexin V-FITC和PI混勻，避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-141-3p表達 提取細胞總RNA，合成cDNA后以U6為內參進行PCR擴增，循環(huán)條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測miR-141-3p對KLF6的靶向調控作用 構建KLF6的野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-KLF6和MUT-KLF6，將其分別與miR-NC和miR-141-3p共轉染至H9C2細胞中，按試劑盒說明檢測熒光素酶活性。將miR-NC、miR-141-3p、anti-miR-NC、anti-miR-141-3p分別轉染至H9C2細胞中，按1.2.5檢測KLF6表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據采用SPSS20.0軟件分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞炎癥反應的影響 與對照組相比，LPS組H9C2細胞中IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，梔子多糖低、中、高濃度組H9C2細胞中IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05，表1）。

表1 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞炎癥反應的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of gardenia polysaccharide on inflammatory response in cells affected by LPS in H9C2（±s，n=9）

表1 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞炎癥反應的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of gardenia polysaccharide on inflammatory response in cells affected by LPS in H9C2（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.01；compared with LPS group，2）P＜0.01.

Groups Con LPS LPS+Experiment-L LPS+Experiment-M LPS+Experiment-H FP IL-1β/（pg·mg-1）56.85±7.01 394.71±32.521）283.36±31.202）215.62±24.302）103.63±14.012）293.671＜0.001 TNF-α/（pg·mg-1）98.34±12.40 603.37±39.521）491.14±28.182）356.43±19.092）189.52±14.792）630.068＜0.001

2.2 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞凋亡及Bax表達的影響 與對照組相比，LPS組H9C2細胞中Bax表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，梔子多糖低、中、高濃度組H9C2細胞Bax表達顯著降低，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，圖1、表2）。

表2 梔子多糖對LPS作用的細胞H9C2凋亡及Bax表達的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表2 梔子多糖對LPS作用的細胞H9C2凋亡及Bax表達的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.01；compared with LPS group，2）P＜0.01.

Groups Con LPS LPS+Experiment-L LPS+Experiment-M LPS+Experiment-H FP Bax 0.19±0.02 0.81±0.081）0.66±0.052）0.46±0.042）0.27±0.032）257.301＜0.001 Apoptosis rate（%）8.02±0.57 26.91±1.951）21.24±1.822）16.74±1.452）13.00±0.792）235.402＜0.001

圖1 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞凋亡及Bax表達的影響Fig.1 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS

2.3 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞miR-141-3p、KLF6表達的影響 與對照組相比，LPS組H9C2細胞miR-141-3p表達顯著降低，KLF6表達顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，梔子多糖高濃度組H9C2細胞miR-141-3p表達顯著升高，KLF6表達水平顯著降低（P＜0.05，圖2、表3）。

表3 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞miR-141-3p、KLF6表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of gardenia polysaccharide on expressions of miR-141-3p and KLF6 in H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表3 梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞miR-141-3p、KLF6表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of gardenia polysaccharide on expressions of miR-141-3p and KLF6 in H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.01；compared with LPS group，2）P＜0.01.

Groups Con LPS LPS+Experiment-H F P miR-141-3p 0.99±0.08 0.18±0.021）0.72±0.062）441.606＜0.001 KLF6 protein 0.36±0.03 0.81±0.061）0.43±0.042）259.525＜0.001

圖2 KLF6蛋白表達Fig.2 Expression of KLF6 protein

2.4 抑制miR-141-3p表達能逆轉梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞炎癥反應及凋亡的影響 與LPS+Experiment-H+anti-miR-NC組相比，LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p組細胞H9C2中miR-141-3p表達顯著降低，IL-1β、TNF-α水平、Bax表達和細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05，圖3、表4）。

表4 抑制miR-141-3p表達能逆轉梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞中炎癥反應及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-141-3p can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表4 抑制miR-141-3p表達能逆轉梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞中炎癥反應及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-141-3p can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+Experiment-H+anti-miR-NC group，1）P＜0.01.

Groups LPS+Experiment-H+anti-miR-NC LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p tP miR-141-3p 0.71±0.06 0.20±0.021）24.191＜0.001 IL-1β/（pg·mg-1）101.86±7.33 320.92±19.351）31.760＜0.001 TNF-α/（pg·mg-1）190.14±13.09 523.56±22.661）38.223＜0.001 Bax 0.28±0.03 0.66±0.051）19.551＜0.001 Apoptosis rate（%）13.13±0.63 23.51±1.151）23.748＜0.001

圖3 抑制miR-141-3p能逆轉梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞凋亡的影響Fig.3 Inhibition of miR-141-3p reverses effect of gardenia polysaccharide on apoptosis of H9C2 cells induced by LPS

2.5 過表達KLF6能逆轉梔子多糖對LPS作用的細胞H9C2中炎癥反應及凋亡的影響 與LPS+Experiment-H+pcDNA3.1組 相 比，LPS+Experiment-H+pc-DNA3.1-KLF6組細胞H9C2KLF6表達顯著升高，IL-1β、TNF-α水平及Bax表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，表5、圖4）。

表5 過表達KLF6能逆轉梔子多糖對LPS作用的細胞H9C2中炎癥反應及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of KLF6 can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表5 過表達KLF6能逆轉梔子多糖對LPS作用的細胞H9C2中炎癥反應及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of KLF6 can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+Experiment-H+pcDNA3.1 group，1）P＜0.01.

Groups LPS+Experiment-H+pcDNA3.1 LPS+Experiment-H+pcDNA3.1-KLF6 t P KLF6 protein 0.42±0.04 0.75±0.051）15.461＜0.001 IL-1β/（pg·mg-1）102.28±7.77 291.10±18.251）28.558＜0.001 TNF-α/（pg·mg-1）189.33±12.96 507.33±20.731）39.022＜0.001 Bax 0.27±0.03 0.59±0.061）14.311＜0.001 Apoptosis rate（%）13.23±0.94 21.33±1.591）13.156＜0.001

圖4 過表達KLF6能逆轉梔子多糖對LPS作用的H9C2細胞凋亡的影響Fig.4 Overexpression of KLF6 reverses effect of gardenia polysaccharide on apoptosis of H9C2 cells induced by LPS

2.6 miR-141-3p靶 向調 控KLF6 TargetScan預 測顯示KLF6與miR-141-3p存在結合位點（圖5A）。熒光素酶報告實驗顯示，miR-141-3p與WT-KLF6共轉染的H9C2細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而miR-141-3p與MUT-KLF6共轉染的H9C2細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（表6）。過表達miR-141-3p后KLF6表達降低，而抑制miR-141-3p表達后KLF6表達升高（P＜0.05，圖5B、表7）。

圖5 miR-141-3p靶向調控KLF6Fig.5 miR-141-3p targeting regulates KLF6

表6 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.6 Dual luciferase reporting experiment（±s，n=9）

表6 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.6 Dual luciferase reporting experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.01.

Groups miR-NC miR-141-3p tP WT-KLF6 1.02±0.10 0.31±0.031）20.402＜0.001 MUT-KLF6 0.94±0.09 0.98±0.09 0.943 0.360

表7 miR-141-3p調控KLF6表達（±s，n=9）Tab.7 miR-141-3p regulates KLF6 expression（±s，n=9）

表7 miR-141-3p調控KLF6表達（±s，n=9）Tab.7 miR-141-3p regulates KLF6 expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.01；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.01.

Groups miR-NC miR-141-3p anti-miR-NC anti-miR-141-3p FP KLF6 protein 0.40±0.04 0.12±0.011）0.37±0.04 0.94±0.092）376.500＜0.001

3 討論

中藥對心肌損傷具有保護作用［11］。炎癥因子和細胞凋亡均可導致心肌損傷，TNF-α、IL-6、IL-1β均屬于促炎因子，其水平升高會促發(fā)炎癥反應［12］。研究發(fā)現梔子苷通過上調miR-145表達減輕LPS誘導的H9C2細胞損傷［13］。梔子苷可通過激活Keap1/Nrf2通路抑制過氧化氫引起的心肌細胞氧化損傷［14］。梔子苷通過激活AMPKα抑制心肌ROS積累，從而阻斷NLRP3炎癥體介導的心肌細胞凋亡，并改善敗血癥小鼠心臟功能［15］。表明梔子苷對于心肌細胞損傷具有保護作用。本研究采用不同濃度梔子多糖處理LPS誘導的心肌細胞，結果顯示，IL-1β、TNF-α水平、細胞凋亡率顯著降低，說明梔子多糖可抑制LPS誘導的炎癥因子分泌及細胞凋亡。提示梔子多糖也對LPS誘導的心肌損傷具有保護作用。

研究報道m(xù)iR-141-3p過表達降低了慢性炎癥性疼痛小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6水平［16］。說明miR-141-3p可參與調控炎癥反應發(fā)生。本研究結果顯示，LPS誘導的心肌細胞miR-141-3p表達顯著降低，提示miR-141-3p參與心肌細胞損傷過程。為研究梔子多糖對心肌損傷的影響是否與miR-141-3p有關，本研究先檢測梔子多糖處理后miR-141-3p表達，結果顯示，miR-141-3p表達升高，而抑制miR-141-3p表達逆轉了梔子多糖對LPS誘導的心肌細胞炎癥反應和凋亡的抑制作用。表明梔子多糖可能通過調控miR-141-3p影響心肌細胞炎癥反應和凋亡。

研究顯示，Kruppel樣因子（kruppel-like factor，KLF）6可調節(jié)心肌細胞纖維化［17］。KLF6通過抑制B細胞白血病/淋巴瘤6表達促進巨噬細胞介導的炎癥［18］。miR-141-3p可通過靶向KLF12促進子宮內膜間質細胞凋亡［19］。本實驗通過在線軟件預測miR-141-3p可能的靶基因，發(fā)現miR-141-3p與KLF6有結合位點，且進一步通過雙熒光素酶實驗證實miR-141-3p可靶向調控KLF6表達。此外，本研究還發(fā)現梔子多糖可降低KLF6表達，而過表達KLF6逆轉了梔子多糖對LPS作用的心肌細胞凋亡和炎癥因子的抑制作用。提示梔子多糖可能通過調控miR-141-3p進而調控KLF6表達影響心肌細胞炎癥反應和凋亡。

綜上所述，梔子多糖可能通過調控miR-141-3p和KLF6抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡和炎癥因子釋放，對LPS誘導的心肌細胞損傷有保護作用。