梁 悅，胡永紅，劉 偉，慕永平，陳佳美，劉 平,3

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，上海 201203；2 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海市中醫(yī)藥化學(xué)生物學(xué)前沿基地，上海 201203

終末期肝病(end-stage liver disease, ESLD)以肝功能不能滿足人體的正常生理需求為特征，是各種急、慢性肝損傷所致的晚期階段，主要包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病引起的失代償期肝硬化及肝衰竭。本類疾病病死率高、醫(yī)療負(fù)擔(dān)重，嚴(yán)重危害人民健康。肝移植作為臨床有效治療方法，存在供體短缺、費(fèi)用高昂等問題[1]。近年來細(xì)胞療法研究突顯間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)治療肝病的潛在臨床應(yīng)用優(yōu)勢。MSC可從骨髓、脂肪、臍帶血以及胚胎等組織分離，但不同來源的MSC的生物學(xué)特性不同。一項(xiàng)研究[2]表明，骨髓來源MSC遷移能力最強(qiáng)，而這種能力是組織再生修復(fù)過程中不可或缺的因素。同時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)具有強(qiáng)大的旁分泌功能，特別是其來源的外泌體在肝病治療中頗受關(guān)注。本文就BMSC及其外泌體在ESLD中的研究進(jìn)展作一綜述，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供部分參考。

1 BMSC及其外泌體概述

BMSC是源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并能在特定條件下分化為多種組織細(xì)胞，如骨、軟骨、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。目前BMSC仍缺乏特異性標(biāo)志物，通常認(rèn)為其表達(dá)CD73、CD90和CD105，而不表達(dá)CD14、CD34和CD45。由于免疫原性低，不易觸發(fā)受體免疫反應(yīng)，BMSC適用于同種異體或自體移植。BMSC可以遷移到受損肝組織并直接分化為肝細(xì)胞，也可旁分泌可溶性因子，如前列腺素E2、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、吲哚胺2，3-雙加氧酶和血管內(nèi)皮生長因子等以改善肝組織微環(huán)境，促進(jìn)受損肝細(xì)胞修復(fù)[3-4]。

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)的多泡小體與細(xì)胞膜融合并釋放到細(xì)胞外空間的細(xì)胞外囊泡，直徑40～160 nm，是一種新的非細(xì)胞性的信號傳遞方式。外泌體攜帶大量生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA、微小RNA，通過不同的信號通路誘導(dǎo)靶細(xì)胞活性的改變。外泌體幾乎可由各種細(xì)胞類型分泌和吸收，BMSC是其重要細(xì)胞來源[5]。與BMSC相比，BMSC來源外泌體(bone marrow mesenchymal stem cells-Exosome，BMSC-Ex)更容易獲取，不存在免疫排斥反應(yīng)，安全性更好，且具有跨生物屏障能力，可開發(fā)為藥物遞送載體。BMSC-Ex向受損肝臟傳遞生物信息，參與調(diào)控肝細(xì)胞再生、肝纖維化與肝臟炎癥損傷等病理生理過程[6-7]。

2 BMSC移植治療ESLD的臨床應(yīng)用

已有大量臨床研究表明，BMSC移植治療以失代償期肝硬化與肝衰竭為代表的ESLD具有顯著的臨床效果。

2.1 治療失代償期肝硬化的臨床研究 失代償期肝硬化是慢性肝病的終末階段，由于廣泛的肝細(xì)胞壞死與肝組織結(jié)構(gòu)破壞，造成肝功能失代償，出現(xiàn)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥[8]。BMSC移植對多種原因引起的失代償期肝硬化具有良好療效。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[9]招募了56例乙型肝炎肝硬化患者，經(jīng)肝動脈注入自體BMSC，隨訪24周，共39例患者完成試驗(yàn)，其中移植組20例，對照組19例。結(jié)果顯示，自體BMSC移植組患者的肝功能、終末期肝病模型(MELD)評分和Child-Pugh評分改善程度顯著優(yōu)于常規(guī)治療組。同樣，自體BMSC經(jīng)外周靜脈移植治療丙型肝炎肝硬化[10]，經(jīng)肝動脈移植治療酒精性肝硬化[11]均能改善患者肝功能并減輕纖維化程度。然而，并非所有研究均呈現(xiàn)BMSC移植對肝硬化患者有理想療效。如一項(xiàng)隨機(jī)對照臨床研究[12]招募了27例肝硬化失代償期患者，其中15例患者從外周靜脈注射自體BMSC，12例患者注射等體積的生理鹽水作為對照，12個(gè)月后觀察兩組的肝功能、Child-Pugh評分、MELD評分、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)變化均無顯著差異。這可能與BMSC移植的細(xì)胞數(shù)量、移植途徑以及移植前是否預(yù)處理等因素有關(guān)。

2.2 治療肝衰竭的臨床研究 肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝損傷，導(dǎo)致肝功能嚴(yán)重障礙，出現(xiàn)以黃疸、腹水、凝血功能障礙、肝性腦病等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。一項(xiàng)隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)[13]經(jīng)外周靜脈輸注自體BMSC治療乙型肝炎相關(guān)肝衰竭患者，每周1次，持續(xù)4周，隨訪24周，結(jié)果顯示，BMSC移植組累積存活率(73.2%)顯著高于常規(guī)治療組(55.6%)，且BMSC移植可顯著降低患者血清TBil水平、改善MELD評分以及降低嚴(yán)重感染的發(fā)生率，提高24周生存率。另有研究[14]對BMSC進(jìn)行預(yù)處理后注入丙型肝炎相關(guān)肝衰竭患者體內(nèi)觀察其療效。20例患者經(jīng)皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子5 d后抽取其BMSC，經(jīng)分離純化后由外周靜脈輸注于自體接受治療；隨訪26周以上，移植組中54%患者的血清ALT、AST恢復(fù)正常，肝臟合成功能改善。另一項(xiàng)研究[15]將自體BMSC向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后移植入體內(nèi)，隨訪6個(gè)月，結(jié)果顯示，BMSC移植可顯著改善肝衰竭患者的腹水、下肢水腫、血清白蛋白含量和Child-Pugh評分。

3 BMSC移植治療ESLD的作用機(jī)制

ESLD的病理學(xué)特點(diǎn)是大量肝組織炎癥壞死及膠原纖維沉積。對重度肝損傷、肝纖維化模型的干預(yù)研究均表明，BMSC移植療法可促進(jìn)肝細(xì)胞再生，減輕肝臟炎癥及抑制肝纖維化進(jìn)程(圖1)。

圖1 BMSC及其外泌體治療ESLD的作用機(jī)制

3.1 BMSC促進(jìn)肝細(xì)胞再生 肝細(xì)胞作為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分，負(fù)責(zé)肝臟生物合成、轉(zhuǎn)化、代謝等功能，維持肝臟穩(wěn)態(tài)。持續(xù)的慢性肝損傷造成大量肝細(xì)胞壞死、凋亡，肝細(xì)胞增殖能力嚴(yán)重不足，無法滿足機(jī)體肝功能需求。因此，有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生是治療ESLD的重要途徑。BMSC移植療法促進(jìn)肝再生。如給D-半乳糖胺/脂多糖[16]以及90%肝切除[17]誘導(dǎo)的肝衰竭大鼠注射BMSC，肝組織增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Ki-67陽性染色面積顯著增加，且肝細(xì)胞中β-catenin發(fā)生核易位，上調(diào)原癌基因和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。這種現(xiàn)象與BMSC歸巢至受損肝臟，通過直接分化或旁分泌功能促進(jìn)肝細(xì)胞再生有關(guān)。給CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠[18]尾靜脈注射BMSC，綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSC遷移到受損肝臟，肝組織肝細(xì)胞標(biāo)志物Alb的表達(dá)升高。在細(xì)胞因子包括HGF、血管內(nèi)皮生長因子、半乳糖凝集素-3或巨噬細(xì)胞集落刺激因子的作用下[3,19-20]，BMSC向肝臟歸巢并分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的能力增強(qiáng)。BMSC向肝臟歸巢的機(jī)制并未完全闡明，研究[21]表明與SDF-1/CXCR4軸活化有關(guān)。肝損傷時(shí)肝組織SDF-1表達(dá)升高，刺激其受體CXCR4在BMSC表面的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)BMSC遷移至受損肝組織。

外泌體是BMSC旁分泌機(jī)制的重要組成部分，發(fā)揮與其母體細(xì)胞類似的生物學(xué)功能。動物實(shí)驗(yàn)[22]表明，BMSC-Ex可遷移至刀豆球蛋白-A(concanavalin A，Con-A)誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟，抑制肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)肝組織再生修復(fù)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[23]證實(shí)，BMSC-Ex通過自噬途徑抑制肝細(xì)胞凋亡，顯著降低促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，而上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。同時(shí)，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型中G0期肝細(xì)胞重新進(jìn)入G1期，顯著上調(diào)cyclin D1和PCNA的表達(dá)，加速肝細(xì)胞再生周期[24]。

3.2 BMSC抑制肝纖維化進(jìn)展 肝纖維化是響應(yīng)慢性肝損傷的病理變化，是失代償期肝硬化的重要病理基礎(chǔ)。肝損傷刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，并轉(zhuǎn)分化為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，分泌大量膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[8]。動物實(shí)驗(yàn)[25]表明，BMSC移植可減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，發(fā)揮顯著的抗肝纖維化作用。這種作用主要?dú)w結(jié)于BMSC可抑制HSC活化并誘導(dǎo)活化的HSC凋亡。在采用TGFβ1誘導(dǎo)人HSC活化細(xì)胞模型[26]中觀察到，BMSC干預(yù)后，HSC的活化能力顯著減弱，且α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)顯著下降。BMSC可通過調(diào)控多條信號通路作用于HSC發(fā)揮抗肝纖維化作用。給硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝硬化大鼠移植BMSC后，肝組織TGFβ1及其下游受體Smad3的表達(dá)水平顯著降低，且α-SMA的表達(dá)減少，提示BMSC可通過調(diào)控TGFβ/Smad信號通路抑制HSC活化進(jìn)而改善肝纖維化[27]。NADPH氧化酶是自由基(ROS)的主要來源，ROS參與肝纖維化病理過程。BMSC降低HSC中ROS的標(biāo)志物4-HNE與NOX的亞型p47phox的表達(dá)，通過調(diào)控NADPH氧化酶通路抑制HSC活化[26]。另外，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解受基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)調(diào)控。BMSC移植可上調(diào)肝組織MMP-9的表達(dá)，下調(diào)肝組織TIMP-1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解[28]。

BMSC-Ex也能有效干預(yù)HSC活化環(huán)節(jié)，阻止肝纖維化進(jìn)展。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型[29]中，人來源BMSC-Ex能抑制HSC中Wnt/β-catenin通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少HSC增殖、活化，從而減輕肝纖維化。此外，外泌體可作為信號遞送載體在細(xì)胞間傳遞。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染環(huán)狀DNA circDIDO1進(jìn)入BMSC中，隨后circDIDO1成功包裝到BMSC-Ex內(nèi)，分離攜帶circDIDO1的BMSC-Ex并與LX2細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)BMSC-Ex介導(dǎo)的circDIDO1轉(zhuǎn)移通過上調(diào)PTEN以抑制AKT信號通路活性，從而抑制HSC的活化[30]。

3.3 BMSC參與免疫調(diào)控 BMSC具有強(qiáng)大的調(diào)控免疫的能力，通過改善肝臟免疫細(xì)胞狀態(tài)，抑制促炎因子分泌，減輕肝臟炎性損傷。巨噬細(xì)胞是固有免疫的主要參與者，通常認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，而M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型[31]中，BMSC干預(yù)后促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2亞型極化，抑制其向M1亞型極化，從而降低炎性因子IL-12b、IFNγ、TNFα和IL-6的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。同樣，BMSC干預(yù)Con-A誘導(dǎo)的肝損傷小鼠后，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，且血清IL-10水平上調(diào)并刺激信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3的磷酸化，進(jìn)而降低肝組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量和cleaved-Caspase3/8/9的蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡[32]。BMSC也可調(diào)控Hedgehog/SMO/Gli1通路和Notch1信號發(fā)揮抑制炎癥作用，BMSC上的CD47和巨噬細(xì)胞中SIRPα直接結(jié)合可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Gli1和Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch1 intracellular domain，NICD)的核易位，而NICD與Gli1相互作用并調(diào)節(jié)其靶基因Dvl2，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體驅(qū)動的炎癥反應(yīng)[33]。T淋巴細(xì)胞被激活后，大量增殖、分化，同時(shí)釋放促炎因子以發(fā)揮其效應(yīng)功能[34]。BMSC抑制肝臟T淋巴細(xì)胞向CD4+亞型分化，進(jìn)而降低血清促炎因子與肝組織α-SMA的表達(dá)，減輕炎癥與纖維化[35]。同樣，使用攜帶Becn1-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSC也顯示出抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖能力[36]。此外，將肝臟脫細(xì)胞生物支架植入大鼠體內(nèi)，外周靜脈輸注BMSC后能減輕中性粒細(xì)胞浸潤和纖維組織形成，但這作用僅能維持2周左右[37]。

在膽汁淤積性肝損傷環(huán)境下，肝臟血管內(nèi)皮黏附分子1表達(dá)升高，招募中性粒細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)膽道周圍炎性損傷以及纖維化；而BMSC-Ex可降低血管內(nèi)皮黏附分子1的表達(dá)，減少免疫細(xì)胞浸潤，保護(hù)肝臟免受炎癥損傷[38]。另外，外泌體包含的miRNA是其發(fā)揮作用的重要生物活性物質(zhì)之一。研究[39]發(fā)現(xiàn)使用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-223的BMSC-Ex能夠改善小鼠肝功能與肝組織炎性損傷，且顯著降低肝組織NLRP3和Caspase-1的表達(dá)，而抑制BMSC-Ex中miR-223的表達(dá)后其治療作用消失，提示BMSC-Ex中miR-223通過抑制NLRP3炎癥小體信號通路發(fā)揮抗炎作用。

4 中醫(yī)藥聯(lián)合BMSC移植干預(yù)ESLD的作用

近年來，大量研究[40]集中于如何提高BMSC治療ESLD的臨床效果，常用方法如基因編輯技術(shù)、細(xì)胞因子或生長因子對BMSC進(jìn)行預(yù)處理，但是基因重編程具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。值得關(guān)注的是，已有研究[41-42]表明中醫(yī)藥能促進(jìn)BMSC增殖分化能力，且具有低成本、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，有望開發(fā)成為潛在的BMSC移植的輔助治療投入應(yīng)用。

越來越多研究顯示，中藥復(fù)方與BMSC聯(lián)用干預(yù)ESLD具有協(xié)同增效作用。如BMSC聯(lián)用一貫煎[43]、鱉甲煎丸[44]、濟(jì)生腎氣丸[45]均能改善CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝功能，減輕肝纖維化，兩者聯(lián)用的效果優(yōu)于單用BMSC移植。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及其有效成分可增強(qiáng)BMSC歸巢至受損肝臟并分化為肝細(xì)胞的能力。如在CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型[41]中，柔肝化纖顆粒聯(lián)用BMSC移植組肝組織內(nèi)綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSC數(shù)量明顯多于單用BMSC移植組。體外采用蟲草多糖含藥血清培養(yǎng)大鼠BMSC，發(fā)現(xiàn)蟲草多糖組7天時(shí)細(xì)胞可見AFP的表達(dá)，14天時(shí)細(xì)胞表達(dá)CK18與Alb，提示蟲草多糖能誘導(dǎo)BMSC向肝細(xì)胞分化[42]。

課題組前期采用膽管結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)肝臟Notch信號通路活化并促進(jìn)肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化，伴隨Notch信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子Numb表達(dá)水平降低，阻斷Notch信號可抑制肝纖維化進(jìn)展[46]。黃芪湯干預(yù)可顯著抑制Notch信號的活化及肝纖維化進(jìn)展，并顯著提高Numb的表達(dá)水平[47]。進(jìn)一步在膽管結(jié)扎的同時(shí)將BMSC和Numb敲減的BMSC(BMSCNumb-KD)經(jīng)脾臟注射大鼠肝內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSC移植可顯著降低肝組織膠原沉積，并抑制膽管反應(yīng)和HSC活化，提示BMSC移植可抑制膽汁性肝纖維化進(jìn)展；而BMSCNumb-KD移植后，可見其主要分化為膽管上皮細(xì)胞，促進(jìn)膽管反應(yīng)及肝纖維化進(jìn)展，提示Numb在膽汁性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。且當(dāng)BMSCNumb-KD細(xì)胞移植后再給予黃芪湯干預(yù)，盡管肝纖維化程度有所改善，但Hyp含量、天狼星紅膠原染色陽性面積、α-SMA及CK7、CK19的表達(dá)水平等均顯著高于BMSC和黃芪湯單用組，提示Numb可能是黃芪湯抗膽汁性肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)[48]。

5 問題與展望

BMSC及其外泌體治療ESLD具有獨(dú)特優(yōu)勢，尤其是大部分臨床試驗(yàn)均顯示出BMSC移植的安全性與有效性。但仍有一些研究報(bào)道在體外培養(yǎng)BMSC時(shí)會發(fā)生染色體畸變致瘤[49]，且長期體外培養(yǎng)會降低BMSC增殖與分化能力[50]，尚需開展大樣本的隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)提高其臨床研究證據(jù)質(zhì)量。針對BMSC-Ex治療ESLD目前處于基礎(chǔ)研究階段，外泌體內(nèi)涵物質(zhì)的定性以及確切的生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步解析。值得注意的是，自體BMSC在肝損傷過程中自骨髓中動員并通過外周循環(huán)遷移到損傷肝臟是其發(fā)揮作用的先決條件[51]，如何調(diào)動自體BMSC向肝臟歸巢并促進(jìn)肝組織修復(fù)與再生可避免BMSC移植帶來的弊端，是治療ESLD的重要思路。中藥復(fù)方及其有效成分可改善肝臟微環(huán)境，而肝臟微環(huán)境對于BMSC向肝臟歸巢及分化能力至關(guān)重要。因此深入挖掘中藥復(fù)方及其有效成分、如何調(diào)動自體BMSC向肝臟歸巢并修復(fù)受損肝組織減輕纖維化，是今后極具挑戰(zhàn)和有意義的研究方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：梁悅負(fù)責(zé)收集、分析資料，撰寫論文；胡永紅、劉偉、慕永平參與收集文獻(xiàn)，修改論文；陳佳美負(fù)責(zé)擬定文章框架，指導(dǎo)撰寫文章并修改稿件；劉平負(fù)責(zé)擬定文章思路，指導(dǎo)撰寫文章并修改稿件，最后定稿。