劉旭初，覃世運(yùn)，陳麗君，陳 娟，尤曉光

1 海南省第三人民醫(yī)院(三亞中心醫(yī)院)a.腫瘤治療中心, b.藥學(xué)部，海南 三亞 572000；2 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 放射科，?？?570102

原發(fā)性肝癌作為臨床最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是最為常見(jiàn)的癌癥相關(guān)性死亡原因之一[1-2]。由于原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿，患者缺乏早期典型的臨床癥狀，大部分患者在臨床確診時(shí)已經(jīng)處于疾病的中晚期階段，能夠進(jìn)行根治性手術(shù)切除的患者比例甚至不足20%。經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)是中晚期原發(fā)性肝癌患者治療的主要手段，可有效改善患者臨床預(yù)后[3-5]。然而，當(dāng)前仍缺乏評(píng)價(jià)中晚期肝癌TACE術(shù)后預(yù)后的有效方式。研究[6-7]顯示，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)通路是原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。KRAS基因?qū)儆赗as原癌基因家族中的一員，不僅是抗EGFR靶向治療選擇的重要依據(jù)，同時(shí)也可能成為患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。本研究探討KRAS基因狀態(tài)對(duì)TACE治療中晚期肝癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年4月—2020年5月在海南省第三人民醫(yī)院接受TACE治療的中晚期肝癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均經(jīng)穿刺活檢，臨床病理診斷為原發(fā)性肝癌患者；(2)心、肺、腎等機(jī)體主要器官功能無(wú)明顯障礙患者；(3)巴塞羅那肝癌臨床分期(BCLC)B期或C期患者；(4)肝功能Child-Pugh分級(jí)為A級(jí)或B級(jí)患者；(5)無(wú)法接受外科手術(shù)治療切除患者；(6)卡氏(KPS)評(píng)分>60分；(7)術(shù)前未接受其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重凝血功能障礙患者；(2)大量腹水或頑固性腹水患者；(3)有TACE治療禁忌證患者；(4)合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者。

1.2 TACE治療方法 使用Seldinger法穿刺患者股動(dòng)脈，插管直至肝總動(dòng)脈進(jìn)行造影，以明確腫瘤大小、數(shù)目、位置。以微導(dǎo)管超選擇插管至支配肝癌病灶的主要供血?jiǎng)用}內(nèi)，將化療藥物(氟尿嘧啶750 mg/m2，奧沙利鉑60 mg/m2)稀釋液緩慢注入，然后使用15～25 mL 40%碘化油栓塞腫瘤末梢血管。若有必要可使用明膠海綿顆粒，以盡可能完全阻斷患者腫瘤血供。根據(jù)患者腫瘤大小、數(shù)量以及患者肝功能具體情況確定碘化油及栓塞劑的使用劑量。此外，根據(jù)患者情況決定TACE治療次數(shù)，本研究患者治療2～3次。

1.3 KRAS基因檢測(cè) TACE手術(shù)前，在超聲引導(dǎo)下對(duì)肝癌組織進(jìn)行穿刺取材，取5 g左右腫瘤組織，按照QIAamp DNAFFPF Kit試劑盒(Qiagen公司)步驟提取腫瘤組織DNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA濃度，然后調(diào)節(jié)濃度至100 μg/mL，-20 ℃保存待測(cè)。擴(kuò)增KRAS基因12/13號(hào)密碼子特需特異性引物，根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，引物序列，正義：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′，反義：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′。引物及Premix PCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，PCR反應(yīng)體系50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 40 s，共完成30個(gè)循環(huán)，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，選取PCR陽(yáng)性凝膠條帶作為目的片段，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司)對(duì)PCR產(chǎn)物回收，然后送至上?；蚣夹g(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 隨訪 所有患者在接受TACE術(shù)后，每月復(fù)查肝功能、AFP、肝臟增強(qiáng)CT或MRI，以評(píng)估患者腫瘤控制情況以及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，記錄患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)以及總體生存期(OS)。PFS指的是從患者TACE術(shù)后到觀察到疾病進(jìn)展或發(fā)生死亡(由于任何原因)之間的時(shí)間；OS指的是從患者TACE術(shù)后到患者死亡(由于任何原因)之間的時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變檢測(cè)結(jié)果 97例患者中男61例、女36例，年齡30～78歲，平均(56.48±12.31)歲。腫瘤最大徑2.89～9.74 cm，平均(7.19±2.08)cm；腫瘤單個(gè)89例、≥2個(gè)18例。在本組97例晚期肝癌患者中，共檢出KRAS基因突變患者34例(35.05%)，其中檢出12號(hào)密碼子突變患者21例(61.76%)，13號(hào)密碼子突變患者13例(38.24%)。在檢出KRAS基因突變患者中，均為單個(gè)堿基的點(diǎn)突變，而并未檢出兩個(gè)或兩個(gè)以上堿基突變或其他形式的突變(圖1)。

注：a,KRAS基因12、13密碼子野生型基因序列；b,KRAS基因12密碼子GGT→GAT突變；c,KRAS基因12密碼子GGT→GTT突變；d,KRAS基因13密碼子GGC→GAC突變。

2.2 KRAS基因突變狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系 KRAS基因突變型與野生型比較，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為3.965、6.593，P值均<0.05)(表1)。

表1 KRAS基因突變狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系

2.3 KRAS基因突變狀態(tài)與患者生存分析 對(duì)本組97例患者進(jìn)行追蹤隨訪顯示，KRAS基因野生型患者平均PFS為11.35個(gè)月，突變型患者平均PFS為19.65個(gè)月；KRAS基因野生型患者平均OS為19.18個(gè)月，突變型患者平均OS為26.54個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均顯著優(yōu)于KRAS突變型(P值均<0.05)(圖2、3)。

圖2 KRAS基因狀態(tài)與患者PFS的關(guān)系

2.4 影響患者預(yù)后的Cox分析 對(duì)可能影響患者總體生存預(yù)后的各因素進(jìn)行Cox分析，結(jié)果顯示，KRAS基因狀態(tài)(RR=18.273,95%CI：5.584～98.305)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(RR=11.475,95%CI：3.029～56.490)、腫瘤數(shù)目(RR=10.038,95%CI：2.973～19.328)、BCLC分期(RR=12.384,95%CI：2.385～29.305)與患者預(yù)后密切相關(guān)，為影響患者總體生存預(yù)后的重要因素(P值均<0.05)(表2)。

表2 影響患者預(yù)后的Cox分析

圖3 KRAS基因狀態(tài)與患者OS的關(guān)系

3 討論

目前，TACE已經(jīng)成為無(wú)法外科切除中晚期肝癌患者的首選治療方式。肝癌的主要供血為肝動(dòng)脈供血。經(jīng)肝動(dòng)脈碘油注射后，碘油可在肝癌的組織間隙、肝竇以及細(xì)小血管內(nèi)選擇性停滯，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞失去血液供應(yīng)而導(dǎo)致腫瘤組織缺血壞死[9-10]；在碘油中混合化療藥物，從而使化療藥物在腫瘤組織中緩慢釋放，延長(zhǎng)了化療藥物與腫瘤細(xì)胞之間的接觸時(shí)間，進(jìn)而顯著提高化療藥物治療效果，同時(shí)可顯著減小化療藥物對(duì)患者全身的不良影響，并阻斷腫瘤血供，引起腫瘤組織發(fā)生缺血性壞死，進(jìn)一步增加抗腫瘤療效[11-12]。研究提出[13-14]，采取非手術(shù)多模式治療，尤其對(duì)于原發(fā)性肝癌患者采取TACE治療，可有效延長(zhǎng)患者生存期，在中晚期肝癌的治療中具有重要作用。

原發(fā)性肝癌是多基因、多分子、多通路間相互作用的結(jié)果，因此檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者基因突變狀況，對(duì)于患者治療反應(yīng)以及生存預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值，從而有助于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化治療的目的[15-16]。KARS基因突變?cè)谠l(fā)性肝癌患者中具有著較高的發(fā)生率。研究[17-18]顯示，原發(fā)性肝癌的發(fā)生是一種多步驟過(guò)程，而在腫瘤惡性發(fā)生的整個(gè)過(guò)程中，均與KRAS基因突變有關(guān)。有研究[19-20]認(rèn)為，KRAS基因突變被認(rèn)為是原發(fā)性肝癌發(fā)生的啟動(dòng)性因子，尤其G-A堿基突變，可能在多種惡性腫瘤發(fā)生中具有重要作用。

本研究結(jié)果顯示，在本組97例中晚期肝癌患者中，共檢出KRAS基因突變患者34例(35.05%)，其中檢出12號(hào)密碼子突變患者21例(61.76%)，13號(hào)密碼子突變患者13例(38.24%)，且檢出的患者均為單個(gè)堿基突變。本組結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果基本一致[21]。KRAS基因突變率接近35%，是一種較為常見(jiàn)的基因突變形式。此外，KRAS基因突變與患者肝硬化、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目有關(guān)。提示KRAS基因突變的存在可能與肝癌疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，從而為KRAS突變可能成為預(yù)測(cè)患者治療預(yù)后的因素提供一定的基礎(chǔ)。

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均顯著優(yōu)于KRAS突變型。表明了KRAS基因狀態(tài)與患者TACE術(shù)后生存狀況密切相關(guān)。KRAS基因野生型患者可受上游EGFR信號(hào)通路的調(diào)控，而當(dāng)KRAS基因發(fā)生點(diǎn)突變時(shí)，導(dǎo)致該基因編碼P21蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的變化，不再受上游EGFR信號(hào)的調(diào)控。KRAS基因突變亞型不同，可能也會(huì)導(dǎo)致該基因的空間構(gòu)象發(fā)生變化，引起相應(yīng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路不同，從而影響化療藥物的結(jié)合位點(diǎn)，也可能導(dǎo)致患者對(duì)化療藥物的敏感性有所差別，進(jìn)而影響患者預(yù)后。

同時(shí)，本研究進(jìn)一步對(duì)可能影響患者術(shù)后預(yù)后的各因素進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，KRAS基因狀態(tài)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目、BCLC分期進(jìn)入回歸模型，為影響患者總體生存預(yù)后的重要因素。腫瘤數(shù)目、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及BCLC分期均可有效提示原發(fā)性肝癌患者自身狀態(tài)及腫瘤的進(jìn)展情況，故而可影響患者預(yù)后，而KRAS基因狀態(tài)同樣進(jìn)入了Cox回歸模型，提示KRAS基因狀態(tài)也對(duì)患者臨床預(yù)后有著重要的影響。此外，通過(guò)Kaplan-Meier生存分析以及Cox多因素分析，進(jìn)一步確定了KRAS基因狀態(tài)與患者TACE術(shù)后預(yù)后具有密切關(guān)系，可能成為預(yù)測(cè)患者術(shù)后預(yù)后的重要因素之一。KRAS基因突變，可能是導(dǎo)致患者術(shù)后預(yù)后較差的因素，因此關(guān)注肝癌TACE患者KRAS基因狀態(tài)，對(duì)于提前制訂相關(guān)治療計(jì)劃具有重要價(jià)值。

但是由于本研究納入樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果可能存在一定的偏差，后期研究將進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量，以獲得更為可靠的臨床研究數(shù)據(jù)。

綜上所述，KRAS基因突變?cè)谠l(fā)性肝癌中較為常見(jiàn)，與患者TACE術(shù)后不良預(yù)后密切相關(guān)，可成為患者臨床預(yù)后監(jiān)測(cè)的潛在指標(biāo)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2017年1月8日經(jīng)海南省第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：倫(審)2017-09，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉旭初、覃世運(yùn)、陳麗君、陳娟、尤曉光負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；劉旭初負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。