伍慧麗，時紅波，劉燕敏，嚴(yán) 艷，王玲玲，丁 美，馬正來，劉 暉，段鐘平

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病科，北京 100069

自身免疫性肝炎(AIH)是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性肝臟炎癥性疾病，近年來發(fā)病呈上升趨勢，臨床特征為血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高、自身抗體陽性、免疫球蛋白G和/或γ-球蛋白血癥，肝組織學(xué)上表現(xiàn)為界面性肝炎、漿細(xì)胞浸潤等，對免疫抑制治療有效。由于目前AIH發(fā)病機制尚未完全明確，免疫介導(dǎo)途徑尤其是T、B淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷是目前重要的發(fā)病機制之一。而細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，降解產(chǎn)生的物質(zhì)可被再利用或者產(chǎn)生能量，因此對于細(xì)胞代謝平衡有著重要的作用。近年來淋巴細(xì)胞自噬在自身免疫性疾病發(fā)病機制中的作用備受關(guān)注，因此針對AIH患者T、B淋巴細(xì)胞及自噬的研究是非常有意義且值得探討的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組 所選病例(62例)均來自于2019年10月—2020年10月在本院門診或住院診治的AIH患者，健康對照組8例來自于體檢者。篩選入組標(biāo)準(zhǔn)：按照2015年歐洲肝病學(xué)會(EASL)推薦的AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]以及1991年國際自身免疫性肝炎小組(IAIHG)評分系統(tǒng)評分[2]，治療前得分高于15分者、治療后得分高于17分者，或者根據(jù)2008年修訂的簡化版評分標(biāo)準(zhǔn)[3]評分大于6分者。臨床診斷為藥物誘的自身免疫性肝炎(DI-AIH)的患者符合Weiler-Normann和Schramm等建立的藥物性肝損傷分類和診斷[4-5]。原發(fā)性膽汁性膽管炎重疊自身免疫性肝炎(PBC-AIH)的診斷符合巴黎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。接受治療的患者給予糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑一線治療標(biāo)準(zhǔn)方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并各種急慢性肝炎病毒現(xiàn)癥感染(HBsAg陽性或HBV DNA陽性、HCV RNA陽性、HEV IgM陽性、巨細(xì)胞病毒或EB病毒核酸陽性)、酒精性肝損傷、脂肪性肝炎、遺傳代謝性肝病等其他原因?qū)е碌母螕p傷；合并腫瘤以及HIV感染者。肝衰竭患者診斷根據(jù)亞太肝病學(xué)會(APASL)[8]和中國《肝衰竭診治指南(2018年版)》[9]，包括急性/亞急性肝衰竭、慢加急/慢加亞急性肝衰竭。肝硬化患者根據(jù)2015年更新的肝硬化循證臨床實踐指南進(jìn)行診斷[10]。合并PBC患者聯(lián)合使用熊去氧膽酸膠囊每日15～20 mg/kg。

按照經(jīng)一線方案治療4周的療效分為未治療組、治療完全緩解組(ALT及AST、IgG復(fù)常)、治療后部分緩解組(ALT、AST及IgG較治療前下降但未完全復(fù)常)；按照診斷類型分為特發(fā)性AIH(I-AIH)組、DI-AIH組、PBC-AIH組；按照肝硬化情況分為無肝硬化組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組；按照肝衰竭情況分為有肝衰竭組和無肝衰竭組。

1.2 各淋巴細(xì)胞亞群的LC3B的檢測方法 采集受試者清晨空腹外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝送檢。每份標(biāo)本事先加入裂解液，后分別加入1 mL血標(biāo)本充分裂解，離心去上清并PBS洗滌3次，兩試管加入細(xì)胞死活染料工作液以及熒光表面抗體CD3、CD4、CD25、CD8a、CD19，避光孵育后加入固定液，最后再加入穿透液，震蕩洗滌穿透共2次，重懸細(xì)胞后加入封閉液進(jìn)行封閉后洗滌細(xì)胞，加入LC3B抗體，同樣避光孵育后洗滌，加入穿透液重懸細(xì)胞后，加入細(xì)胞染色液并上機流式檢測。以平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)表示各淋巴細(xì)胞亞群的LC3B的表達(dá)水平。

1.3 實驗材料及試劑 Brilliant Violet 605TManti-human CD3、PerCP/Cyanine 5.5 anti-human CD4、Brilliant Violet 421TManti-human CD19、Alexa Fluor?700 anti-human CD8、APC anti-human CD25、DyLightTM488 Donkey anti-rabbit IgG均購自Biolegend公司，LC3B抗體購自Thermofisher公司，裂解液、固定液、穿透液、染色液均購自Biolegend公司。流式細(xì)胞儀為Beckman Cytoflex S。

2 結(jié)果

2.1 入組患者一般情況 62例AIH患者中男9例，女53例，年齡(53.7±10.8)歲，范圍37～72歲；8例健康對照者中男1例，女7例，年齡(49.7±8.5)歲，兩組年齡、性別均無統(tǒng)計學(xué)差異(P值均>0.05)。

AIH按照診斷類型分為I-AIH 41例、DI-AIH 11例、PBC-AIH重疊綜合征10例；合并肝硬化34例，其中20例為失代償期肝硬化；30例(48.4%)檢測時已接受過糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑治療；53(85.5%)例患者診斷時有明顯的臨床癥狀，主要是納差、尿黃、腹脹、水腫、惡心、嘔吐、發(fā)熱，合并其他自身免疫性疾病的患者有15例，合并糖尿病患者10例(表1)。

表1 AIH患者臨床特點

2.2 T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá) AIH組和健康對照組在T、B淋巴細(xì)胞自噬MFI表達(dá)上均可見明顯的差別，AIH組CD4+T淋巴細(xì)胞自噬MFI、CD8+T淋巴細(xì)胞自噬MFI、CD19+B淋巴細(xì)胞自噬MFI、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞自噬MFI均高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 AIH組與健康對照組T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬MFI表達(dá)

2.3 AIH亞組T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)差異

2.3.1 AIH患者治療對淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)差異的影響 按照是否使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療及療效將AIH患者分為3個亞組，結(jié)果顯示治療完全緩解的患者CD19+B淋巴細(xì)胞LC3B自噬MFI遠(yuǎn)高于健康對照組，但顯著低于未治療組和治療部分緩解組(P值分別為0.037、0.040)，而CD4+T、CD8+T以及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞自噬MFI在3個亞組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 AIH患者糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療前后T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)

2.3.2 AIH診斷類型與T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬情況 按照疾病診斷類型將AIH分為3個亞組進(jìn)行T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)的分析，結(jié)果顯示PBC-AIH組CD19+B淋巴細(xì)胞LC3B MFI顯著低于I-AIH組和DI-AIH組(P值分別為0.037、0.031)，但是CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞自噬MFI顯著高于I-AIH組和DI-AIH組(P值分別為0.042、0.044)，而CD4+T以及CD8+T淋巴細(xì)胞自噬MFI 3個亞組間均無顯著差異(P值均>0.05)(表4)。

表4 不同AIH診斷類型與T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)

2.3.3 AIH合并肝硬化淋巴細(xì)胞亞群自噬情況 按照是否合并肝硬化將AIH患者分為3個亞組進(jìn)行T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)的比較，合并代償期肝硬化的患者CD19+B淋巴細(xì)胞LC3B MFI顯著低于無肝硬化組和失代償期肝硬化組(P值分別為0.009、0.003)，同時無肝硬化患者CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞LC3B MFI顯著高于肝硬化組，且與代償期肝硬化組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.037)，而CD4+T以及CD8+T淋巴細(xì)胞自噬MFI在3個亞組間均無顯著差異(P值均>0.05)(表5)。

表5 AIH患者肝硬化情況與淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)

2.3.4 AIH合并肝衰竭淋巴細(xì)胞亞群自噬情況 按照是否合并肝衰竭情況將AIH患者分為2個亞組進(jìn)行T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)的比較，結(jié)果顯示無肝衰竭組CD19+B淋巴細(xì)胞LC3B MFI值雖然明顯高于健康對照組(P<0.01)，但顯著低于有肝衰竭組(P=0.042)；對于CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞來說，LC3B淋巴細(xì)胞自噬MFI值在無肝衰竭組顯著高于有肝衰竭組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.043)(表6)。

表6 AIH患者肝衰竭情況與淋巴細(xì)胞亞群自噬表達(dá)之間的關(guān)系

3 討論

目前研究[11-12]證實機體免疫過程均高度依賴細(xì)胞自噬。自噬參與了淋巴細(xì)胞的生長、分化、存活和自我平衡并進(jìn)一步影響機體的免疫過程，是其參與免疫性疾病發(fā)病機制的理論基礎(chǔ)。近年來觀察到自噬參與眾多自身免疫性疾病的發(fā)病機制[13]，而其中有一部分就是淋巴細(xì)胞，例如有研究[14-15]顯示活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物Beclin1和LC3在基因和蛋白表達(dá)水平上均明顯上調(diào)，且其增高與血清IFNα水平正相關(guān)，說明活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞自噬活性增強可能參與了發(fā)病機制。

從本研究中也同樣觀察到，AIH患者T、B淋巴細(xì)胞的自噬水平明顯高于健康人，其中CD19+B淋巴細(xì)胞自噬超過20倍的增加，CD4+T、CD8+T也達(dá)到了近2倍的增加，CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞自噬也達(dá)到4～5倍的增加，增幅的差異可能與不同淋巴細(xì)胞在AIH患者發(fā)病機制中的作用不同有關(guān)，比如AIH患者CD4+CD25+T自噬增強明顯，可能與Treg細(xì)胞的數(shù)量或功能改變有關(guān)，但自噬增加是因還是果尚不清楚。隨后的亞組分析中可看到，在經(jīng)過激素治療完全緩解的患者中CD4+CD25+T自噬水平較健康對照組升高，可見CD4+CD25+T自噬增加很可能是一種保護(hù)機制。此外，無肝硬化以及無肝衰竭的AIH患者CD4+CD25+T自噬水平較(失)代償期肝硬化及合并肝衰竭患者顯著升高，從臨床的角度來看，合并失代償期肝硬化的AIH患者往往經(jīng)歷了長期持續(xù)的肝損傷，而肝衰竭的患者往往存在嚴(yán)重肝損傷，機體免疫紊亂更為嚴(yán)重，因此患者CD4+CD25+T自噬水平下降與疾病的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。

本研究最顯著的差異是AIH患者CD19+B淋巴細(xì)胞自噬的水平顯著上升。既往研究[16]認(rèn)為B淋巴細(xì)胞主要通過產(chǎn)生特異性抗體及提呈抗原，或者與T淋巴細(xì)胞相互作用、分泌炎性細(xì)胞因子和產(chǎn)生異位生發(fā)中心等正向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與自身免疫疾病的發(fā)病，因此B淋巴細(xì)胞不但可以參與抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，也可以參與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。AIH以循環(huán)內(nèi)自身抗體的陽性以及外周血和肝臟組織均有大量B淋巴細(xì)胞分化的終末階段漿細(xì)胞存在[17]，B淋巴細(xì)胞在T輔助淋巴細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞激活下會產(chǎn)生漿細(xì)胞、記憶B淋巴細(xì)胞和長壽漿細(xì)胞，目前認(rèn)為持續(xù)的抗原特異性抗體滴度主要來源于長壽漿細(xì)胞[18]。因此有理由認(rèn)為在B淋巴細(xì)胞數(shù)量不變的情況下要實現(xiàn)參與AIH的發(fā)病機制就必然有其功能上的改變或者B淋巴細(xì)胞各亞群的比例失衡。目前在自身免疫中B淋巴細(xì)胞功能障礙的原因尚不完全清楚，直到最近才被發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞代謝可能是決定B淋巴細(xì)胞功能是否正常的決定因素[19-20]，而自噬作為細(xì)胞代謝的一種表現(xiàn)形式，通過降解并重新利用受損細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)而修復(fù)或改善細(xì)胞的功能，在細(xì)胞營養(yǎng)缺乏期間維持代謝穩(wěn)定起到重要的作用，尤其在對長壽命漿細(xì)胞生存方面起到關(guān)鍵性的作用[21-22]。鑒于以上機制，本研究嘗試從臨床角度區(qū)分B淋巴細(xì)胞自噬在不同類型AIH患者中的表達(dá)和意義，發(fā)現(xiàn)在各亞組中CD19+B淋巴細(xì)胞自噬有顯著差異，比如在未治療的疾病活動期AIH患者顯著升高，治療后的AIH患者次之；診斷類型上I-AIH和DI-AIH升高明顯，PBC-AIH次之；無肝硬化和失代償期肝硬化AIH患者升高明顯，代償期肝硬化AIH次之；合并肝衰竭的患者顯著升高，無肝衰竭患者次之。可以看出CD19+B淋巴細(xì)胞自噬的表達(dá)與疾病的種類、是否治療以及疾病嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，可能是與B淋巴細(xì)胞自噬參與細(xì)胞代謝影響細(xì)胞表達(dá)及功能密切相關(guān)。

綜上所述，AIH患者T、B淋巴細(xì)胞亞群自噬活性明顯上調(diào)，以B淋巴細(xì)胞自噬上調(diào)更為顯著，且與AIH患者診斷類型、是否治療以及疾病嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。對AIH淋巴細(xì)胞自噬的活性的研究將為其發(fā)病機制提供新的參考，淋巴細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)及治療很可能成為今后AIH治療的新思路和新靶點。但是，本研究總體納入的病例數(shù)少，且僅為臨床現(xiàn)象觀察，缺乏更多的基礎(chǔ)及理論研究，其具體作用機制尚缺乏強有力的證據(jù)，故在今后的研究中還需要更深入的探索以及進(jìn)一步的驗證，擴大樣本量，細(xì)化淋巴細(xì)胞亞群分類，增加自噬與相關(guān)信號通路關(guān)系的研究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年3月25日經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審批，批號：LL-2019-184-K。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：伍慧麗、時紅波、劉燕敏負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；劉燕敏、嚴(yán)艷、王玲玲、丁美、馬正來、劉暉參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；段鐘平負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。