田照輝，胡紅霞，王 巍，東 天，孫 愛

(北京農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所暨國(guó)家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，北京 100068)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC) 統(tǒng)稱為MHC分子，是高度多態(tài)的基因群，其編碼產(chǎn)物是一類細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白，非常復(fù)雜且最具多態(tài)性，廣泛存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)，與免疫功能密切相關(guān)[1-3]。MHC分子分為3類，其Ⅰ類、Ⅱ類分子參與抗原呈遞過程[4]。其中MHCⅡ類分子是由α鏈和β鏈組成的跨膜糖蛋白，主要在與呈遞抗原有關(guān)的細(xì)胞中表達(dá)，如B細(xì)胞、激活的T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞膜上[5]，主要功能是將外源性抗原呈遞給T細(xì)胞抗原受體TCR(T cell receptor，TCR)[6]。在病毒感染的過程中，某些病毒蛋白通過干擾MHCⅡ基因的功能，影響機(jī)體正常的免疫識(shí)別[7]。凡是能激活免疫細(xì)胞的刺激源，如感染的病原體、抗原以及各種炎癥反應(yīng)，都能刺激局部組織發(fā)生MHC上調(diào)。細(xì)胞因子IFN-γ可誘發(fā)和增強(qiáng)免疫細(xì)胞(除B細(xì)胞外)表達(dá)Ⅱ類分子并增強(qiáng)它們的表達(dá)；腫瘤壞死因子TNF-α系統(tǒng)能上調(diào)白細(xì)胞介素4從而增強(qiáng)B細(xì)胞表達(dá)Ⅱ類分子[8]。

魚類MHCⅡ基因在魚類機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用，淋巴組織和與免疫相關(guān)的脾臟、鰓、胃、前腸是魚類最易接觸病原體的部位，在魚類處于非抗原攻擊狀態(tài)下，MHCⅡ基因主要在這些器官或組織中表達(dá)[9]。魚類在對(duì)外部生存環(huán)境不斷適應(yīng)的長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，為了抵御病原的侵入，保護(hù)機(jī)體內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，MHCⅡ基因家族形成了極其豐富的多態(tài)性。自Hashimoto等于1990年首次報(bào)道了鯉(Cyprinuscarpio)的部分MHC基因序列以來[10]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[2]、赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelusakaara)[1]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[11]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]等許多魚類的MHCⅡ類基因進(jìn)行了研究。

西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)為鱘科鱘屬，軟骨硬鱗類，是重要的鱘魚養(yǎng)殖品種和育種材料，具有重要的科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被列為《瀕危動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ物種[13]。近年來，隨著鱘魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大，鱘養(yǎng)殖病害問題也日益增多，嚴(yán)重制約著鱘魚產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[14]。目前對(duì)于鱘魚MHC基因的研究主要集中在物種進(jìn)化方面，對(duì)其遺傳和免疫相關(guān)研究較少，不同魚類經(jīng)抗原刺激后其MHCⅡβ基因表達(dá)情況并不一致。本課題組前期進(jìn)行了西伯利亞鱘MHC基因的克隆、組織分布和細(xì)菌感染后的表達(dá)，但對(duì)其MHC免疫功能還缺乏深入研究[14]。鑒于MHCⅡβ基因的重要功能和表達(dá)的復(fù)雜性，本研究構(gòu)建了原核高效表達(dá)載體，制備了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，為深入研究西伯利亞鱘MHCⅡβ基因免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和試驗(yàn)動(dòng)物EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)為TIANGEN公司產(chǎn)品，DH5α感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；克隆質(zhì)粒pGEM-T Vector購于Promega公司，為氨芐抗性；表達(dá)質(zhì)粒Pet30α由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所水族研究室保存提供，為卡那霉素抗性，并帶有6-His標(biāo)簽。西伯利亞鱘由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所鱘魚良種場(chǎng)提供。

1.1.2 主要工具酶及試劑 RNA提取和RNase-Free DNase Set試劑盒(Qiagen公司)，RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、6X His 標(biāo)簽Tag抗體、辣根酶二抗(中杉金橋公司)，彩虹預(yù)染寬分子量蛋白Marker(北京寶如億生物公司)，膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、Ryrobest DNA保真酶、DNA Marker(DL2000、DL10000)、T4DNA連接酶(Takara公司)，雙酶切所用酶NcoⅠ、XhoⅠ(NEB公司)。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為化學(xué)優(yōu)級(jí)純級(jí)。引物合成及序列測(cè)定由北京擎科生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2018年開始在北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所陸續(xù)開展，首先在GenBank數(shù)據(jù)庫查找西伯利亞鱘MHCⅡβ基因序列(登錄號(hào)：JQ288773)，參照質(zhì)粒載體Pet30α序列的酶切位點(diǎn)，用Primer 5.0軟件分析西伯利亞鱘MHCⅡβ基因酶切位點(diǎn)，并根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增可讀編碼框除信號(hào)肽序列的699 bp，上游引物MHC-E-F：catgccatggctGTCGACGGTTACTTGATG，下游引物MHC-E-R：ccgctcgagTTAATCTGATGGCACCAA，并在上、下游引物的5′端分別引入NcoⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)(單下劃線)和保護(hù)堿基(雙下劃線)，引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基后擴(kuò)增片段為720 bp。

1.2.2 基因擴(kuò)增和構(gòu)建克隆質(zhì)粒T-MHCⅡβ試驗(yàn)用西伯利亞鱘魚由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所國(guó)家級(jí)鱘魚良種場(chǎng)提供。取西伯利亞鱘脾臟組織，參照Qiagen總RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以脾臟cDNA為模板，利用引物MHC-E-F和MHC-E-R擴(kuò)增MHCⅡβ目的片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒純化后，連接于pGEM-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，鑒定陽性的菌液由北京擎科生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和參考序列比對(duì)，比對(duì)成功的菌液提質(zhì)粒T-MHCⅡβ。

1.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒Pet30α-MHCⅡβ以 T-MHCⅡβ質(zhì)粒為模板，使用引物MHC-E-F、MHC-E-R和保真酶擴(kuò)增MHCⅡβ目的片段，膠回收純化產(chǎn)物和質(zhì)粒Pet30α分別作為底物進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ酶雙酶切：37 ℃ 2 h，80 ℃ 20 min，酶切產(chǎn)物膠回收純化后，將酶切后的質(zhì)粒Pet30α和MHCⅡβ目的片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含有卡那霉素(Kan)的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，進(jìn)行PCR菌液鑒定，陽性克隆交由北京擎科生物工程有限公司送檢測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)后，選取測(cè)序正確的菌液，提取質(zhì)粒Pet30α-MHCⅡβ，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)中，在含卡那霉素(Kana)的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，接種到LB(Kana+)液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再次進(jìn)行PCR菌液鑒定測(cè)序，測(cè)序正確的菌液用甘油保存于-80 ℃?zhèn)溆茫糜谠吮磉_(dá)研究。將Pet30α空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)中為對(duì)照組。

1.2.4 Pet30α-MHCⅡβ在大腸桿菌中的原核表達(dá)和鑒定 將保存的構(gòu)建好的表達(dá)菌株復(fù)蘇，挑選單克隆接種于LB(kana+)培養(yǎng)基，37 ℃180 r/min振蕩過夜。取過夜培養(yǎng)的菌液2 mL接種于200 mL液體LB(kana+)培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩至D600 nm=0.4～0.6時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，不加IPTG的培養(yǎng)管作為對(duì)照組，37 ℃ 180 r/min 培養(yǎng)6 h收集菌液暫存于4 ℃冰箱備用。取1 mL表達(dá)菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清，用200 μL PBS重懸菌液，加loading buffer混勻后煮沸5 min，再次離心后使用SDS-PAGE、Western Blot檢測(cè)表達(dá)蛋白。

1.2.5 蛋白質(zhì)存在性質(zhì)的鑒定 取100 mL誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，4 000 r/min離心10 min收集菌體，加入 25 mL 的PBST緩沖液，冰浴10 min后超聲13 min。取裂解物1 mL，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，分離上清，沉淀直接制備電泳樣品。往上清中加入1/10體積的三氯醋酸TCA混勻，振蕩15 s，置冰上放置至少15 min，然后14 000g(13 770 r/min)離心 10 min，去上清，加入100 μL丙酮混合，14 000g離心5 min洗沉淀2次，從沉淀中去除丙酮，風(fēng)干沉淀(將蓋子打開至少60 min)。往菌體超聲裂解的沉淀物及TCA沉淀的蛋白中加入100 μL PBS和 100 μL SDS上樣緩沖液振蕩混合，置于沸水中加熱 5 min，再次離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定。

1.2.6 最適表達(dá)時(shí)間和最適表達(dá)溫度 取含有融合質(zhì)粒Pet30α-MHCⅡβ過夜培養(yǎng)的單克隆菌液，以1%的比例接種于200 mL的LB(Kana+)培養(yǎng)基中，當(dāng)D600 nm達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG，180 r/min 37 ℃分別誘導(dǎo)2、4、6、8 h，同時(shí)設(shè)置 180 r/min 27 ℃誘導(dǎo)8 h作為溫度對(duì)照組及不加IPTG的對(duì)照組和Pet30α空質(zhì)粒對(duì)照組。

1.2.7 鎳柱層析純化表達(dá)蛋白 收集破碎后的菌體，用含有8 mol/L尿素的BufferA溶解包涵體，12 000 r/min 離心20 min，取菌體上清，用BufferA+8 mol/L尿素平衡鎳柱，加入包涵體裂解上清，過柱，洗去非特異性結(jié)合，洗脫鎳柱上結(jié)合的重組蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定濃縮的重組蛋白(圖)。采用10 ku的超濾管對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮，到終體積為 2 mL，-80 ℃保存。

1.2.8 多克隆抗體制備及檢測(cè) 以純化重組蛋白為免疫原，免疫2只新西蘭大白兔，抗原濃度為 1 μg/mL，注射劑量為100 μg/只，腿部肌肉皮下多點(diǎn)注射。共免疫9次，每次間隔15 d，從第3次免疫開始，每次免疫7 d 后采血檢測(cè)抗體效價(jià)，第7次采血得到抗體后，進(jìn)行了采全血與純化及純化后的ELISA、SDS-PAGE檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增得到用于蛋白表達(dá)的基因序列

以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以MHC-E-F和MHC-E-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見約720 bp的擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果與參考基因序列比對(duì)，沒有插入、缺失和移碼突變，可用于構(gòu)建原核融合表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒Pet30α-MHCⅡβ

以T-MHCⅡβ質(zhì)粒為模板使用保真酶擴(kuò)增的MHCⅡβ膠回收產(chǎn)物、Pet30α質(zhì)粒進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ 雙酶切，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，酶切后的Pet30α在5 400 bp處、MHCⅡβ在 720 bp 處有目的片段，酶切成功后，用T4連接酶連接構(gòu)建Pet30α-MHCⅡβ質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后，進(jìn)行菌液鑒定，陽性克隆再次送檢測(cè)序，測(cè)序正確的菌株用于蛋白表達(dá)。

2.3 重組蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

軟件分析表明，Pet30a-MHCⅡβ重組蛋白含837 bp堿基，編碼237個(gè)氨基酸，蛋白分子量為 31 287.40 u，包括31個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)，39個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D，E)，81個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、w、V)，71個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)；等電點(diǎn)6.211，在pH值7.0時(shí)帶5.889電荷；蛋白序列含有6個(gè)組氨酸融合標(biāo)簽，便于免疫印跡鑒定和蛋白純化。利用在線工具h(yuǎn)ttp：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/預(yù)測(cè)，表達(dá)蛋白具有6個(gè)糖基化位點(diǎn)(閾值為0.5，附加閾值為0.32、0.75、0.90)(圖3)。

2.4 Pet30α-MHCⅡβ在大腸桿菌中的表達(dá)

含重組質(zhì)粒Pet30α-MHCⅡβ的大腸菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，將菌液收集進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見大小約為36 ku的濃染蛋白帶，用DNAstar預(yù)測(cè)Pet30α-MHCⅡβ表達(dá)的融合蛋白大小為32 ku，與彩虹預(yù)染蛋白Marker指示的36 ku大小略有差異，但基本相符，對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，Western Blot檢測(cè)結(jié)果陽性說明該蛋白是目的蛋白。將菌液超聲波裂解后的上清和沉淀中的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖4)，對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)(圖5)，可見沉淀中的濃染蛋白含量大于上清中的濃染蛋白量，可知該融合蛋白為包涵體蛋白。

將不同表達(dá)時(shí)間和表達(dá)溫度培養(yǎng)的菌液收集處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h均可檢測(cè)到明顯的濃染蛋白帶，未加IPTG誘導(dǎo)檢測(cè)到較低含量的蛋白條帶，未加IPTG和加IPTG誘導(dǎo)的Pet30α空質(zhì)粒對(duì)照均無蛋白條帶(圖6)。用伯樂凝膠成像Image Lab進(jìn)行條帶灰度分析：誘導(dǎo)4 h蛋白表達(dá)量最高；在27 ℃誘導(dǎo)8 h的蛋白條濃度低于相同條件 37 ℃ 誘導(dǎo)的蛋白濃度。Western Blot顯示融合蛋白條帶清晰特異性強(qiáng)。

2.5 蛋白表達(dá)純化

純化濃縮后的蛋白含量為1 mg/mL，SDS-PAGE電泳檢測(cè)濃縮的重組蛋白(圖7)，在36 ku處有較濃的條帶。

2.6 多克隆抗體

免疫后大白兔的血清樣品經(jīng)過離心，過柱，得到的抗體進(jìn)行超濾處理，純化后的抗體ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)為240 W，SDS-PAGE電泳(圖8)、Western Blot顯示，純化的抗體可與抗原特異性結(jié)合。

3 討論

3.1 引物設(shè)計(jì)和基因擴(kuò)增

脾臟是是重要的免疫器官[13]，硬骨魚類受到外源刺激后，其脾、腎、肝等器官中的黑色素巨噬細(xì)胞增多[15]，MHCⅡβ基因在西伯利亞鱘脾臟組織中有較高的基礎(chǔ)表達(dá)[14]。因此本研究以富含淋巴細(xì)胞的西伯利亞鱘脾臟為材料，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增MHCⅡβ基因。引物設(shè)計(jì)引入的酶切位點(diǎn)應(yīng)避免在擴(kuò)增的基因內(nèi)部出現(xiàn)，質(zhì)粒PET30a在N端和C端各有1個(gè)6-His標(biāo)簽，插入目的基因后C端的6-His標(biāo)簽在終止密碼子之后不再表達(dá)，因此引物設(shè)計(jì)只保留了N端的6-His標(biāo)簽，用于Western免疫印跡和蛋白純化。

3.2 重組蛋白的分子量

試驗(yàn)中用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的西伯利亞鱘MHCⅡβ的OFR為801 bp，其中信號(hào)肽序列為102 bp，用于構(gòu)建的重組蛋白不包含此信號(hào)肽序列，為699 bp，編碼233aa，構(gòu)建的Pet30α-MHCⅡβ融合蛋白為278aa，使用DNAstar中的Editseq預(yù)測(cè)為32 ku。而在SDS-PAGE電泳時(shí)預(yù)染彩虹蛋白Marker顯示分子量約為36 ku，這是因?yàn)镾DS-PAGE電泳時(shí)分子量Marker尤其是預(yù)染蛋白Marker，只是一個(gè)參考值，不能作為絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。通常情況下，非預(yù)染蛋白Marker往往比預(yù)染蛋白Marker具有更準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)分子量估算結(jié)果，這是因?yàn)轭A(yù)染蛋白marker為確保一致的遷移率，蛋白會(huì)帶有飽和標(biāo)記的染料，可能會(huì)使蛋白的原始分子量和表觀分子量之間的差異增大。但預(yù)染蛋白marker在免疫印跡時(shí)可以評(píng)估蛋白轉(zhuǎn)印到膜上的效率和指示蛋白分子量。另外，電泳的行為受很多因素的影響，與蛋白的氨基酸組成、修飾情況密切相關(guān)，因此SDS-PAGE不一定能夠準(zhǔn)確反映分子量的大小，尤其是有的蛋白易形成二聚體，還有一些比較難變性而又形成緊湊的球形結(jié)構(gòu)的蛋白，在用常規(guī)方法電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)異常行為，表觀分子量與實(shí)際分子量不符。Abraham等在研究脊髓灰質(zhì)炎病毒多肽SDS電泳遷移時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著分子半徑的變化，SDS結(jié)合增加，分子電荷增大，相對(duì)遷移速度加快，表觀分子量值降低，在SDS中加入尿素或者甲酰胺能使部分多肽的變性更完全、電泳動(dòng)更快、表觀分子量降低[16]。例如，核糖核酸酶是一種低分子量的酸性蛋白質(zhì)，它有3個(gè)二硫橋，這種蛋白質(zhì)在某些情況下表現(xiàn)出異常的電泳行為，未還原蛋白的電泳遷移率與其分子質(zhì)量大致對(duì)應(yīng)，而還原蛋白的遷移則與蛋白質(zhì)二聚體的預(yù)期分子質(zhì)量一致，在某種條件下，該蛋白不結(jié)合SDS，其電泳遷移性僅由其靜電荷和水動(dòng)力特性決定。因此理論分子量可以用軟件預(yù)測(cè)，應(yīng)用分子篩可以得到準(zhǔn)確的蛋白理論值。為了檢驗(yàn)本試驗(yàn)中表達(dá)的融合蛋白的特異性和正確性，試驗(yàn)中利用融合蛋白的6-His標(biāo)簽進(jìn)行Western Blot，結(jié)果表明，彩虹蛋白Marker顯示表觀分子量約為36ku的蛋白正是所構(gòu)建的融合蛋白。

3.3 原核表達(dá)系統(tǒng)

將外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，讓其在E.coli中表達(dá)，宿主菌起初生長(zhǎng)時(shí)lacⅠ產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合，阻斷了外源基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入lac操縱子的誘導(dǎo)物IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖)，阻遏蛋白不再與操縱基因結(jié)合，使得外源基因得以大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)，未加IPTG誘導(dǎo)的菌株不能高效表達(dá)外源蛋白。本試驗(yàn)SDS-PAGE電泳檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)未加IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照組有微弱的目的蛋白條帶，但Western Blot時(shí)沒有檢測(cè)到，推測(cè)表達(dá)菌株不加IPTG也可能會(huì)有極少量表達(dá)；但由于表達(dá)量低，結(jié)合的抗體少，致使Western免疫印跡未能檢出。

在溫度較低時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白質(zhì)合成速率降低，多肽折疊的動(dòng)力學(xué)會(huì)發(fā)生改變，可能會(huì)使蛋白正確折疊的比例增加，更有利于形成穩(wěn)定的可溶性蛋白[17]。但本試驗(yàn)中在27 ℃時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白表達(dá)量明顯低于37 ℃時(shí)的量，因此本試驗(yàn)沒有驗(yàn)證較低溫度時(shí)表達(dá)蛋白的可溶性，這還需進(jìn)一步研究。

一般來說由于MHC基因具有高度的多態(tài)性，制備單克隆抗體具有篩選困難和效率低下的問題[18]，因此本試驗(yàn)利用純化的重組蛋白免疫兔子制備了效價(jià)高且特異性強(qiáng)的多克隆抗體。

總之，本研究成功構(gòu)建了西伯利亞鱘Pet30α-MHCⅡβ原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了結(jié)果鑒定，制備了兔多克隆抗體，為從蛋白水平研究MHCⅡβ的生物學(xué)功能和參與機(jī)體的免疫應(yīng)答調(diào)控提供參考。