毛 靜，楊 品，2，周 媛，童 俊，徐冬云

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，湖北武漢 430075；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070)

杜鵑是杜鵑花屬(Rhododendron)植物的統(tǒng)稱，泛指杜鵑花科杜鵑花屬植物，是世界上著名的觀賞花卉，也是我國傳統(tǒng)的十大名花之一，因其花色艷麗、綠葉鮮亮、充滿野趣等特點(diǎn)備受人們喜愛。病蟲害的防治在杜鵑繁育栽培過程中尤為重要，其中以杜鵑冠網(wǎng)蝽(Stephanitispyriodes)的危害最為嚴(yán)重和普遍。杜鵑冠網(wǎng)蝽是半翅目(Hemiptera)網(wǎng)蝽科(Tingidae)杜鵑冠網(wǎng)蝽屬(Stephanitis)昆蟲，能危害杜鵑花亞科杜鵑花屬的大部分杜鵑種或園藝栽培品種。杜鵑冠網(wǎng)蝽以成蟲和若蟲在葉背上密集取食和排泄糞便，導(dǎo)致葉片銹黃，葉片正面出現(xiàn)白色斑點(diǎn)，影響杜鵑葉片光合作用，從而導(dǎo)致葉片提前脫落，植株生長不良，降低了其觀賞價(jià)值。

植物表皮毛狀體是由表皮細(xì)胞發(fā)育形成的一種具有特殊結(jié)構(gòu)的毛狀附屬物[1-2]，它與植物抗蟲能力存在密切關(guān)系[3-4]。一般非腺體表皮毛可通過其形體機(jī)械式地限制阻隔害蟲在植物體表面的侵害，而有腺毛狀體則用其分泌的黏液或毒素，來擾亂、誘捕或致死害蟲[5]。同時(shí)，葉片表皮毛的分布與形態(tài)特征也因植物的屬種差異表現(xiàn)出一定的異同性[6-7]。在杜鵑屬的分類與種間關(guān)系問題方面，葉片表皮毛的有無與微觀形態(tài)特征一直都是重要鑒別指標(biāo)[8-9]。植食性昆蟲對(duì)寄主植物存在選擇偏好性[10-11]。杜鵑冠網(wǎng)蝽對(duì)不同品種杜鵑葉片的危害程度差異明顯[12]。有研究表明，杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食偏好性與葉片面積、葉綠素含量以及葉表毛狀體密度等因素顯著相關(guān)[13]。而不同杜鵑品種葉片上覆蓋有不同形態(tài)和密度的毛狀體，葉表毛狀體形態(tài)特征和密度差異是否影響杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食選擇偏好性尚不明確。本研究通過對(duì)不同杜鵑品種葉片的表皮毛微觀結(jié)構(gòu)比較觀測(cè)，分析杜鵑不同形態(tài)的表皮毛與杜鵑冠網(wǎng)蝽取食偏好性之間的關(guān)系，以期為杜鵑葉片表皮毛功能研究提供參考，豐富杜鵑生物脅迫的抗性研究內(nèi)容。同時(shí)，研究不同品種葉片表皮毛特征并比較其抗蟲功能差異，可為以后在分子水平上分離杜鵑表皮毛或腺毛發(fā)育的關(guān)鍵基因，利用其改良低抗蟲性杜鵑品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試杜鵑：選取“胭脂蜜”“楊貴妃”“紫鶴”“泰勒”4個(gè)杜鵑品種，采用口徑為24 cm、高19.5 cm的塑料盆栽苗，植株冠幅為50 cm×60 cm左右，盆栽基質(zhì)為泥炭土 ∶樹皮 ∶珍珠巖=1 ∶1 ∶1(體積比)，盆栽苗均置于武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院杜鵑種質(zhì)資源圃。

供試蟲源：杜鵑冠網(wǎng)蝽，從武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院杜鵑種質(zhì)資源圃中收集而來，于人工氣候箱(光—暗周期為14 h—10 h，溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為80%)中培養(yǎng)3代以上。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片表皮毛觀測(cè)與密度統(tǒng)計(jì) 體視熒光顯微鏡觀察：2021年4月中旬于武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院杜鵑種植資源圃，分別取不同品種杜鵑枝條上第1輪新葉、第2輪成熟葉與第3輪老葉，采用直徑為 8 mm 的打孔器，沿主脈取葉片中部位置葉盤，置于奧林巴斯顯微鏡(SZX2-ILLT)自然光、藍(lán)光紫外熒光下觀察。葉片應(yīng)盡量展平，在視野中觀察表皮毛形態(tài)結(jié)構(gòu)，拍照記錄，并統(tǒng)計(jì)每張葉片盤上的表皮毛數(shù)量。每輪葉片分別選取3張用于密度統(tǒng)計(jì)。表皮毛密度(個(gè)/mm2)=所觀測(cè)視野中的表皮毛數(shù)量總和/視野面積。

掃描電鏡觀察：2021年4月中旬，在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源圃挑選無蟲害植株，并選擇健康葉片。沿主脈將葉片切成約1 cm2的正方形，觀察面盡量平整，同時(shí)要注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，保護(hù)掃描面；將切下的葉片放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛中固定過夜，然后吸出固定劑，用0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)浸洗3～5次，每次15 min；然后用系列梯度乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、95%)逐級(jí)脫水，每次15 min，再用100%乙醇溶液徹底脫水2次，每次10 min；將樣品放入德國徠卡臨界點(diǎn)干燥儀(EM CPD300)干燥后，用德國徠卡離子濺射鍍膜儀(EM ACE200)均勻噴鍍，完成后用日立掃描電鏡儀(SU-8010)觀察表皮毛并拍照記錄。

1.2.2 杜鵑冠網(wǎng)蝽取食選擇偏好性測(cè)定 杜鵑冠網(wǎng)蝽取食偏好性試驗(yàn)于2021年4月中旬在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所植物生理實(shí)驗(yàn)室開展。采用直徑為15 mm的打孔器，沿主脈取葉片中部位置葉盤，置于鋪墊濕潤濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上。將10頭杜鵑冠網(wǎng)蝽幼蟲饑餓處理8 h后，放置培養(yǎng)皿中心位置，任其在2個(gè)品種杜鵑葉盤間選擇取食，分別在0、1、2、4、6、24 h記錄不同品種杜鵑葉片上取食的杜鵑冠網(wǎng)蝽幼蟲數(shù)量。相同的方法改變?nèi)~片左右方位并在每個(gè)方位上重復(fù)5次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同杜鵑品種間差異用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種杜鵑葉片表皮毛形態(tài)特征比較

2.1.1 自然光與紫外熒光下杜鵑葉片表皮毛形態(tài)特征 在體視顯微鏡的可見光下，不同品種杜鵑葉片上的表皮毛呈現(xiàn)不同的形態(tài)(圖1)。在相同的放大倍率視野下，“胭脂蜜”葉片表皮毛明顯呈直線長發(fā)狀，葉脈處的毛狀體較短且粗壯(圖1-A、圖1-B)；“楊貴妃”葉片表皮毛與“紫鶴”相近，都為直線發(fā)狀，但單個(gè)毛狀體較“紫鶴”的短且細(xì)軟(圖1-D、圖1-E)；“紫鶴”的表皮毛粗壯且筆直，朝向基本一致，葉脈上的毛狀體也較為密集(圖1-G、圖1-H)；“泰勒”葉表與葉脈都覆蓋黑色彎曲狀毛狀體且更為濃密蓬亂，其頭部或中部呈彎曲狀，長短不一，毛狀體朝向不整齊(圖1-J、圖1-K)。

不同品種的葉片表皮毛形態(tài)差異在熒光激發(fā)下更為明顯。在藍(lán)光紫外熒光下，葉片中的葉綠素在紫外光下反射紅色背景，表皮毛因細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量較少，呈現(xiàn)黃色或黃綠色。不同品種之間的葉片表皮毛除了有覆蓋密度、粗細(xì)以及柔軟程度的差異外，還觀察到腺體組織形態(tài)的差別。在“胭脂蜜”“楊貴妃”“紫鶴”3個(gè)品種的葉片上均發(fā)現(xiàn)了形態(tài)相似的頭狀腺毛，其頂端與直線發(fā)狀毛狀體明顯不同，呈圓形或橢圓形?！半僦邸比~片上頭狀腺毛最為密集；“楊貴妃”葉片上的腺毛較少，但其單個(gè)頭狀腺毛較大；“紫鶴”的頭狀腺毛較為細(xì)小(圖1-C、圖1-F、圖1-I)。“泰勒”葉片上的腺毛在熒光下不僅密度較大且形態(tài)上呈管筒狀，頭部呈長橢圓形且較小，但柄狀基部較長(圖1-L)。在紫外熒光下還發(fā)現(xiàn)，不論是直線發(fā)狀毛狀體、頭狀或是管筒狀腺毛，受紫外熒光激發(fā)后，杜鵑葉片上能呈現(xiàn)不同的顏色。部分表皮毛呈現(xiàn)暗紅色，或因其細(xì)胞中含少量葉綠素；頭狀腺毛在熒光下主要呈現(xiàn)為黃色或金黃色，且亮度各異，可能因其腺毛處在不同的發(fā)育階段，或是頭狀腺毛中內(nèi)含物發(fā)生了復(fù)雜的生物合成或分泌等過程，導(dǎo)致熒光顏色差異。

2.1.2 不同發(fā)育階段葉片表皮毛形態(tài)差異 為進(jìn)一步獲得杜鵑葉片毛狀體的形態(tài)特征，不同杜鵑品種第1輪新葉、第2輪成熟葉與第3輪老葉進(jìn)行掃描電鏡觀察。由圖2可知，“胭脂蜜”新葉和成熟葉片上都可見清晰的直線發(fā)狀腺毛(圖2-A、圖2-B)，而老葉上毛狀體明顯減少；頭狀腺毛在新葉上尚未飽滿，直至成熟葉片上可見腺毛頂部逐漸充盈；老葉上部分腺毛呈現(xiàn)已釋放出內(nèi)含物后的凋萎狀態(tài)，而尚未釋放內(nèi)含物的腺毛則十分飽滿(圖2-C)。在電鏡相同放大倍率下“楊貴妃”葉片表皮毛較“胭脂蜜”的細(xì)(圖2-E)，其頭狀腺毛較大，尤其是腺毛頭部的分泌組織明顯大于“胭脂蜜”(圖2-H)?！皸钯F妃”的新葉、成熟葉與老葉上發(fā)狀表皮毛的覆蓋密度在電鏡下差異不明顯，但其頭狀腺毛在新葉、成熟葉上呈倒伏狀，充盈狀態(tài)的腺毛主要集中出現(xiàn)在老葉上(圖2-G)?！白销Q”的3輪葉片上都可見清晰的直線發(fā)狀表皮毛與頭狀腺毛(圖2-I、圖2-J、圖2-K)，但老葉上的表皮毛明顯少于新葉、成熟葉。頭狀腺毛狀態(tài)因葉片不同發(fā)育階段差異更為明顯；新葉上的頭狀腺體大部分開始充盈，至成熟葉片腺毛頭部組織已十分飽滿；而在老葉上的腺毛則大部分呈釋放內(nèi)含物后的折倒?fàn)顟B(tài)。“泰勒”葉片上以新葉上彎曲的發(fā)狀表皮毛最多，成熟葉片與老葉上發(fā)狀表皮毛明顯減少，取而代之的是管筒狀腺毛(圖2-M、圖2-N、圖2-O)。新葉上的腺毛頭部分泌組織有部分尚未發(fā)育成熟，有一部分已充盈；成熟葉片上，可見部分腺毛直立且分泌組織充盈飽滿，但有一部分已呈釋放狀態(tài)；老葉上的腺體頭部則已開始凋萎?！疤├铡钡南倜绕渌?個(gè)杜鵑品種的頭狀腺毛要長(圖2-P)，且分泌內(nèi)含物后雖頭部萎縮但直立不倒伏，可能因其內(nèi)部細(xì)胞組織構(gòu)成更為堅(jiān)挺。

2.1.3 不同品種杜鵑葉片表皮毛密度比較 在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不同品種杜鵑葉片表皮毛覆蓋密度各不相同，同一杜鵑品種的新葉、成熟葉、老葉，以及葉片上下表皮的毛狀體密度均存在差異?！疤├铡背墒烊~、老葉的正面表皮毛密度顯著高于其他3個(gè)品種；但其自身新葉、成熟葉與老葉之間差異不大?！皸钯F妃”新葉正面表皮毛密度最大，但隨著葉片的發(fā)育伸展，其老葉上的表皮毛密度明顯下降?！半僦邸薄白销Q”葉片正面表皮毛密度較為接近，皆為新葉上較大而在老葉上略有下降(圖3-a)。比較杜鵑葉片背面表皮毛密度，“泰勒”3輪葉背的表皮毛密度都顯著高于其他3個(gè)品種，而“胭脂蜜”葉背表皮毛密度最低。除“紫鶴”新葉上表皮毛密度明顯高于其成熟葉與老葉外，其他杜鵑品種新老葉片上的表皮毛密度無顯著差異，可能是在葉片發(fā)育生長過程中葉背有新的表皮毛生成(圖3-b)。綜合分析葉片正、背面表皮毛總數(shù)，4個(gè)品種杜鵑僅新葉的表皮毛密度差異達(dá)到顯著水平(圖3-c)。“泰勒”新老葉片之間差異不大，但都顯著高于其他杜鵑品種?！半僦邸钡?輪葉片之間表皮毛密度差異未達(dá)到顯著水平，而“楊貴妃”各輪葉片的表皮毛密度差異顯著；“紫鶴”新葉上的表皮毛密度顯著高于其成熟葉片與老葉，但其成熟葉與老葉之間差異不明顯。

2.2 杜鵑冠網(wǎng)蝽對(duì)不同品種杜鵑葉片的取食選擇

杜鵑葉片正面表皮毛密度大于葉背面，因此，首先驗(yàn)證杜鵑冠網(wǎng)蝽對(duì)杜鵑葉片正面與葉片背面的選擇取食偏好。以“紫鶴”為材料，接種2 h開始，超過50%的杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇了葉片背面取食，6 h后，85%的杜鵑冠網(wǎng)蝽停留在了葉片背面。由此可見，杜鵑冠網(wǎng)蝽偏向寄生于杜鵑的葉片背面(圖4-a)。其次進(jìn)一步比較杜鵑冠網(wǎng)蝽是否會(huì)因新老葉片及其表皮毛密度差異而產(chǎn)生取食偏好行為。試驗(yàn)結(jié)果顯示，1 h時(shí)約有50%的杜鵑冠網(wǎng)蝽尚游離在葉片之外，未進(jìn)行選擇；停留在新葉與老葉上的蟲數(shù)差異不大；2 h開始，約42%的杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇了老葉；之后越來越多的杜鵑冠網(wǎng)蝽在老葉上取食，直至24 h時(shí)，90%的杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇停留在老葉上。因此，杜鵑冠網(wǎng)蝽偏向于在老葉上取食(圖4-b)。

不同品種杜鵑葉片表皮毛形態(tài)與密度亦存在差異，因此將“胭脂蜜”“楊貴妃”“紫鶴”與“泰勒”的成熟葉片進(jìn)行兩兩比較，觀察杜鵑冠網(wǎng)蝽在2個(gè)不同杜鵑品種葉片之間的取食選擇。將杜鵑冠網(wǎng)蝽放在“泰勒”“紫鶴”葉片間，1 h時(shí)66%的杜鵑冠網(wǎng)蝽在2個(gè)品種葉片外游離，此后陸續(xù)有杜鵑冠網(wǎng)蝽分別爬至2個(gè)品種葉片上，至24 h時(shí)有61%的杜鵑冠網(wǎng)蝽停留在“紫鶴”葉片上取食(圖5-a)。當(dāng)為杜鵑冠網(wǎng)蝽提供“泰勒”與“胭脂蜜”的葉片時(shí)，2 h 時(shí)有51%的杜鵑冠網(wǎng)蝽停留在“胭脂蜜”葉片上；24 h時(shí)有70%的杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇取食“胭脂蜜”葉片(圖5-b)。而在“泰勒”與“楊貴妃”之間，1 h時(shí)有83%的杜鵑冠網(wǎng)蝽游離在葉片之外，2 h之后雖然開始陸續(xù)有杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇葉片進(jìn)行取食，但在這2個(gè)品種的葉片上停留的蟲數(shù)差異不大；24 h時(shí)分別有46%與43%的杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇“泰勒”與“楊貴妃”葉片取食(圖5-c)，杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食分布比較均衡。在“紫鶴”“胭脂蜜”之間，杜鵑冠網(wǎng)蝽偏向取食“紫鶴”葉片；在接種2 h時(shí)就有41%的杜鵑冠網(wǎng)蝽停留在“紫鶴”上，24 h時(shí)64%的杜鵑冠網(wǎng)蝽停留在“紫鶴”葉片上取食(圖5-d)。

3 討論與結(jié)論

一般認(rèn)為植物體表面覆蓋的毛狀體具有抵御生物脅迫的物理作用，可以阻礙昆蟲的自由移動(dòng)，在一定程度上對(duì)害蟲的取食造成阻礙[14-15]。杜鵑冠網(wǎng)蝽多選擇老葉背面寄生，應(yīng)與杜鵑葉片背面表皮毛密度小于正面且老葉表皮毛少于新葉相關(guān)。此外，表皮毛的形態(tài)特征也可以影響昆蟲的行動(dòng)，與抵御生物脅迫存在一定關(guān)系[16]，如西番蓮利用其鉤狀毛，使鉤住的純蛺蝶幼蟲因饑餓和失水而死，并且缺乏鉤毛的同屬植物上的純蛺蝶幼蟲的危害要嚴(yán)重得多[17]。本研究中“紫鶴”的新葉表皮毛因密集且細(xì)柔，能阻礙杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食與攀爬；“泰勒”葉片表皮毛不僅高度密集，且彎曲柔軟，長短不一，朝向不整齊，從而降低杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食選擇效率。

但也有學(xué)者提出，植物葉面表皮毛不僅可以形成穩(wěn)定的小氣候環(huán)境，還能輔助害蟲更加穩(wěn)固地攀爬在植物體上，幫助害蟲掩藏寄生不被其天敵發(fā)現(xiàn)捕食[18]，如小麥葉片上簡單直立生長的表皮毛對(duì)螨的棲居有利，且隨著表皮毛密度越高相應(yīng)著生螨的數(shù)量越多[19]。有研究表明，杜鵑冠網(wǎng)蝽在饑餓狀態(tài)下偏向于快速找到食物并附著取食，故杜鵑葉背毛狀體越多越利于杜鵑冠網(wǎng)蝽的快速附著取食[13]。本研究中也發(fā)現(xiàn)杜鵑葉片毛狀體覆蓋率較大的品種其抗蟲性并不可觀，如“紫鶴”，其成熟葉片背面表皮毛密度顯著高于“胭脂蜜”，但杜鵑冠網(wǎng)蝽偏向選擇在“紫鶴”葉背上取食，可能其葉背上的表皮毛更為直立粗壯，且頭狀腺毛數(shù)量相對(duì)較少，因此更有利于杜鵑冠網(wǎng)蝽的附著與取食；“楊貴妃”葉片表皮毛密度并不大，但毛狀體較細(xì)軟，不利于杜鵑冠網(wǎng)蝽的攀爬行動(dòng)，故而有相對(duì)較少的杜鵑冠網(wǎng)蝽選擇這個(gè)品種的葉片取食。在蟲害觀察中還發(fā)現(xiàn)，在毛狀體密度較高且粗壯的部位，如葉片背面的葉脈處，亦是杜鵑冠網(wǎng)蝽偏好取食寄生的位置。故推測(cè)杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食行為與杜鵑葉片表皮毛形態(tài)、質(zhì)地也存在相關(guān)性。

杜鵑葉片上還存在具分泌功能的腺毛組織。許多植物腺體的分泌物都具有幫助植物更好地適應(yīng)環(huán)境和防止食草動(dòng)物侵害的作用[20]。不同品種以及不同類型腺體的內(nèi)部儲(chǔ)藏物質(zhì)和生物學(xué)功能都不盡相同，因此不同類型的腺體在不同的有害環(huán)境中所發(fā)揮的作用是有很大差異的[4]。例如木本植物米團(tuán)花的腺毛中能夠合成和儲(chǔ)存二倍半萜化合物，對(duì)植食性昆蟲具有較強(qiáng)的拒食活性[21]；番茄的腺毛能夠合成多種黃酮類和萜類物質(zhì)，對(duì)鱗翅目或同翅目害蟲的生長有抑制作用[22-24]。在用熒光顯微鏡觀察試驗(yàn)中，通過腺毛所散發(fā)的不同的熒光顏色可初步推測(cè)其中的化學(xué)物質(zhì)的不同[25]。杜鵑葉片表皮毛在熒光下的顏色呈現(xiàn)暗紅、黃色或金黃色，不同品種葉片上的腺毛，以及不同發(fā)育階段葉片上的腺毛呈現(xiàn)出不同的顏色，而且不同顏色的腺體所占總數(shù)的比例也不同，這可能也與腺體內(nèi)含物的成分不同有關(guān)，因此可對(duì)其腺毛中的成分進(jìn)行提取和化學(xué)分析，挖掘與抗蟲相關(guān)的化合物，為進(jìn)一步釋清杜鵑的抗蟲機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

杜鵑葉片表皮毛對(duì)杜鵑冠網(wǎng)蝽寄生活動(dòng)的影響具有兩面性，葉片上密集的細(xì)柔表皮毛不利于杜鵑冠網(wǎng)蝽在葉片上的附著與爬行；而較為粗壯的表皮毛，能為杜鵑冠網(wǎng)蝽的取食活動(dòng)提供支撐與掩護(hù)。因而，杜鵑的抗蟲性與其葉片表皮毛的密度和形態(tài)都密切相關(guān)。同時(shí)，4個(gè)杜鵑品種葉片上附著有不同密度與形態(tài)的腺毛，是否能分泌有特殊功能的化學(xué)物質(zhì)從而影響杜鵑冠網(wǎng)蝽的寄生偏好性，還須進(jìn)一步研究驗(yàn)證。