郭 江,張克勤

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿腎病中心 400065)

膀胱尿路上皮癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，近15年增加了68.29%[1]。膀胱尿路上皮癌按病理類型可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(invasive bladder cancer，MIBC)。NMIBC易于復(fù)發(fā)，且部分復(fù)發(fā)患者易進(jìn)展為MIBC，MIBC患者5年生存率僅為50%～60%[2]。因此找到新的治療NMIBC的方法具有重要意義。近年來(lái)隨著芯片技術(shù)、生物信息學(xué)、基因工程等生物技術(shù)的快速發(fā)展，為腫瘤發(fā)病機(jī)制的闡明和對(duì)腫瘤的診治提供了新的思路[3]。本次實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)分析正常膀胱黏膜與復(fù)發(fā)性NMIBC差異表達(dá)基因，從中找到有價(jià)值的關(guān)鍵分子并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并探索靶分子在復(fù)發(fā)性NMIBC中的重要作用及臨床意義，為復(fù)發(fā)性NMIBC的診療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1生物信息學(xué)材料

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Centerfor Biotechnology Information,NCBI)公共數(shù)據(jù)平臺(tái)(Gene Expression Omnibus,GEO)下載基因芯片數(shù)據(jù)GSE13507(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgiacc=GSE13507)，該數(shù)據(jù)于2010年5月6日公開(kāi)，最后更新于2020年5月20日。

1.1.2臨床標(biāo)本和細(xì)胞株

收集2018年1月至2019年12月本院泌尿外科手術(shù)切除的復(fù)發(fā)性NMIBC及對(duì)應(yīng)癌旁組織13例，所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌，病例排除標(biāo)準(zhǔn)：治療前接受放療或介入治療的患者。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)2017-4-190)。人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株(T24、5637、J82、UM-UC-3),人膀胱尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1儲(chǔ)存于本院泌尿腎病中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1差異表達(dá)基因的篩選

使用GEO2R(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對(duì)GSE13507芯片中正常膀胱黏膜與復(fù)發(fā)性NMIBC數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，分析結(jié)果按差異表達(dá)倍數(shù)(logFC)及P值升序選取前250個(gè)(Top250)基因作為分析對(duì)象，對(duì)基因進(jìn)行基因本體(Go)分析和京都基因組百科全書(kegg)通路分析，涉及的生物學(xué)功能和信號(hào)通路使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(www.metascape.org)進(jìn)行注釋和可視化，Min overlap≥3且P≤0.01被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3關(guān)鍵基因篩選

在Top250基因中按P<0.05且|logFC|>2篩選獲得顯著差異表達(dá)基因并在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn)中做生存分析，獲得顯著降低膀胱癌患者生存率的基因，并選擇P值最小的基因作為關(guān)鍵基因，進(jìn)行下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)

用F-12K專用培養(yǎng)基培育SV-HUC-1細(xì)胞，T24、5637、J82、UM-UC-3細(xì)胞在含10%胎牛血清(美國(guó)Hyclone)的RPMI-1640(美國(guó)Hyclone)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.5免疫組織化學(xué)

采用標(biāo)準(zhǔn)免疫過(guò)氧化物酶染色法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。組織切片的陽(yáng)性染色率和染色強(qiáng)度由2名實(shí)驗(yàn)員依照免疫組織化學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立評(píng)估，按中位評(píng)分分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2.6shRNA轉(zhuǎn)染

shRNA干擾靶點(diǎn)如下： EFNB2-shRNA(敲低組),5′-CGA CAA CAA GTC CCT TTG TAA-3′;EFNB2-shRNA-control(對(duì)照組),5′-GTT CTC CGA ACG TGT CAC GTT-3′。按shRNA-mate(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)說(shuō)明書步驟轉(zhuǎn)染以上序列入T24細(xì)胞株。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

先用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后使用TaqManUniversal Master MixⅡ試劑盒在Bio-Rad系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。引物序列：EFNB2正向5′-TAT GCA GAA CTG CGA TTT CCA A-3′；反向5′-TGG GTA TAG TAC CAG TCC TTG TC-3′；GAPDH正向 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′；反向5′-TAG CAC AGC CTG GAT AGC AA-3′。每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用2-ΔΔct法分析數(shù)據(jù)結(jié)果，GAPDH作內(nèi)參，計(jì)算EFNB2 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.8蛋白免疫印跡(Western blot)

使用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，將提取的蛋白加入EP管中，煮沸10 min。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗EFNB2(1∶400)、Tubulin(1∶800)置4 ℃冰箱孵育24 h，隨后取出常溫下放置1 h，PBS洗滌3次，加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光液(重慶葆光生物科技有限公司)，置LI-COR曝光儀內(nèi)進(jìn)行曝光顯影，以Tublin為內(nèi)參，使用ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.2.9集落形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24細(xì)胞接種到6孔板(8×102/孔)，在含5% CO2、37 ℃的孵箱里培養(yǎng)11 d后，用結(jié)晶紫溶液對(duì)菌落進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，觀察細(xì)胞增殖情況。

1.2.10CCK-8實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24細(xì)胞接種于96孔板(2.5×103/孔)，每孔加入含有10 μL CCK-8試劑(重慶葆光生物科技有限公司)的完全培養(yǎng)基100 μL。在5% CO2、37 ℃孵箱中分別培養(yǎng)4、12、20、28、36 h后，在450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

1.2.11劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔板(2.5×103/孔)，轉(zhuǎn)染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control后培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)至約90%以上，用200 μL無(wú)菌吸管頭輕輕劃傷細(xì)胞形成創(chuàng)面，然后用PBS沖洗角質(zhì)形成細(xì)胞和碎片，并用無(wú)血清RPMI-1640替代完全培養(yǎng)基，在劃痕后0 h和24 h拍照，評(píng)估創(chuàng)面面積,創(chuàng)面面積大小反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

1.2.12Transwell細(xì)胞遷移及侵襲檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24細(xì)胞重懸稀釋至1.0×106/μL，接種到Transwel小室(美國(guó)BD Biosciences,FranklinLakes)上室，下室加入含20%血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，孵育48 h，收集遷移到下室的細(xì)胞并染色計(jì)數(shù)，評(píng)估遷移能力；根據(jù)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)步驟，在上室底涂上基質(zhì)膠(Matrigel，北京索萊寶科技有限公司)并加入轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集下室細(xì)胞并染色計(jì)數(shù)以評(píng)估其侵襲性。染色計(jì)數(shù)方法：先棉簽擦除上室細(xì)胞，再用無(wú)水甲醇固定15 min，結(jié)晶紫(北京索萊寶科技有限公司)染色20 min，最后每孔隨機(jī)抽取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

GSE13507芯片數(shù)據(jù)中有9個(gè)正常膀胱黏膜樣本，23個(gè)復(fù)發(fā)性NMIBC樣本，從差異表達(dá)基因Top250中篩選出前54個(gè)(Top54)顯著差異表達(dá)基因，包括14個(gè)上調(diào)基因和40個(gè)下調(diào)基因，見(jiàn)圖1、表1。

表1 Top54基因差異倍數(shù)及P值

續(xù)表1 Top54基因差異倍數(shù)及P值

續(xù)表1 Top54基因差異倍數(shù)及P值

2.2 差異表達(dá)基因Top250富集分析

富集分析顯示差異表達(dá)基因主要參與有絲分裂細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂DNA生物合成、染色質(zhì)結(jié)合蛋白泛素化的正調(diào)控等，上述細(xì)胞功能均與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，見(jiàn)圖2。

2.3 關(guān)鍵基因的篩選

顯著差異表達(dá)基因Top54在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)作生存分析獲得顯著降低膀胱癌患者生存率的基因(圖3)并按P值排序(表2)，選取P值最小基因 EFNB2為關(guān)鍵基因，進(jìn)行下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

表2 生存分析P值及基因功能

2.4 EFNB2在臨床樣本及膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了臨床樣本膀胱癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中EFNB2的表達(dá)，去驗(yàn)證其表達(dá)差異性。結(jié)果顯示膀胱癌組織中EFNB2的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，見(jiàn)圖4A。與臨床標(biāo)本中的結(jié)果一致，T24、5637、J82和UM-UC-3細(xì)胞系中EFNB2的表達(dá)顯著高于SV-HUC-1細(xì)胞，見(jiàn)圖4C。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，EFNB2在4種膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中表達(dá)也存在差異性，其中T24細(xì)胞系中EFNB2的表達(dá)最高，5637，J82次之，而UM-UC-3表達(dá)最低(T24>5637>J82> UM-UC-3)，見(jiàn)圖4B、C。因此，選取T24細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 敲低EFNB2對(duì)T24細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響

與對(duì)照組比較，敲低組細(xì)胞增殖速度顯著減慢，細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少，劃痕未覆蓋面積顯著增加，細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)顯著減少，見(jiàn)圖5。

3 討 論

膀胱尿路上皮癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤，其中NMIBC易復(fù)發(fā)、進(jìn)展，部分NMIBC易進(jìn)展為MIBC,導(dǎo)致病情迅速發(fā)展、惡化，患者預(yù)后較差，成為當(dāng)前我國(guó)腫瘤治療的難點(diǎn)。本研究通過(guò)揭示復(fù)發(fā)性NMIBC與正常膀胱黏膜之間的基因表達(dá)差異，篩選出關(guān)鍵基因并體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，尋找NMIBC新的治療靶點(diǎn)。

差異表達(dá)基因富集顯示其生物學(xué)行為與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。通過(guò)富集結(jié)果筆者推測(cè)EFNB2可能通過(guò)上述生物學(xué)過(guò)程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，研究顯示EFNB2可促進(jìn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和侵襲[4]，通過(guò)p53/p21和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5]。

Ephrins家族是受體酪氨酸激酶亞家族的配體，Ephrin通過(guò)與Eph受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能，其中EFNB2是最大的配體[6]。Ephrins不僅是配體，也是信號(hào)受體，除了Eph/Ephrin通路外，Ephrin還可以通過(guò)反向信號(hào)，不依賴Ephrin受體發(fā)揮生物學(xué)作用，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)Ephrin結(jié)構(gòu)域磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)通路激活時(shí)，就會(huì)發(fā)生反向信號(hào)傳遞[7-8]。Eph/Ephrin通路與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[9]，已有研究表明，Ephrins過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和血管生成[10]，EFNB2廣泛表達(dá)于腫瘤血管，通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞黏附于腫瘤部位，參與腫瘤血管生成[11]。已有多項(xiàng)研究顯示，EFMB2高表達(dá)的卵巢癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]、食管鱗狀細(xì)胞癌[14]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[15]等多種實(shí)體腫瘤預(yù)后較差。

本研究中，臨床人膀胱癌樣本免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示EFNB2在復(fù)發(fā)性NMIBC中表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，表明EFNB2可能參與了膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展。因此，筆者通過(guò)敲低EFNB2進(jìn)一步探討了EFNB2在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲中的作用及可能的機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)CCK-8、集落形成實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)EFNB2可抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖。此外，EFNB2的反向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)證明在結(jié)直腸癌中驅(qū)動(dòng)EMT，而EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[16-17]。本研究劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)顯示EFNB2敲低后，細(xì)胞遷移及侵襲能力較對(duì)照細(xì)胞顯著下降，這進(jìn)一步證實(shí)了EFNB2促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)篩選，臨床樣本免疫組織化學(xué)分析及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明：EFNB2是促進(jìn)NMIBC復(fù)發(fā)、進(jìn)展的關(guān)鍵基因，EFNB2可能與復(fù)發(fā)性NMIBC的病理發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)潛在的復(fù)發(fā)性NMIBC治療靶點(diǎn)。