林施聘,賴(lài)文韜,姜中其 （浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058）

近年來(lái),越來(lái)越多的病原菌對(duì)一種或多種抗生素產(chǎn)生耐藥性,甚至出現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素的糞腸球菌等耐藥菌株的出現(xiàn)成為危害公共健康的緣由之一。據(jù)報(bào)道,預(yù)計(jì)到2050年,耐藥菌的感染將超過(guò)癌癥和心臟病,成為主要的病死原因[1]。此外,新抗菌藥物的研發(fā)受到時(shí)間、成本等方面的限制。因此,臨床獸醫(yī)能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)患病動(dòng)物做出診斷并開(kāi)具處方對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)療有重大的意義。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)方法（antibiotic susceptibility testing,AST）依靠表型來(lái)確定待檢菌對(duì)抗菌藥物的敏感情況,比如擴(kuò)散法、稀釋法、E-test法,這些方法雖然準(zhǔn)確、成本低、易操作,但是從預(yù)培養(yǎng)到分離純化病原微生物,再到檢測(cè)對(duì)藥物的敏感性,整個(gè)過(guò)程長(zhǎng)達(dá)48～72 h。因此,臨床獸醫(yī)常放棄傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)而根據(jù)可疑的病原菌結(jié)合當(dāng)?shù)氐牧餍胁W(xué)選擇經(jīng)驗(yàn)療法以快速治療患者。為解決這一現(xiàn)實(shí)問(wèn)題,科學(xué)家們致力于開(kāi)發(fā)快速藥敏試驗(yàn)檢測(cè)技術(shù),以避免亂用、濫用抗生素。

通常情況下,藥敏試驗(yàn)分為基因型AST和表型AST。基因型AST包括聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、下一代測(cè)序等,其優(yōu)勢(shì)主要包括兩方面:一是可在短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)；二是有些方法可直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需繁瑣的預(yù)處理。但也存在著一些問(wèn)題,除了成本高、不能提供最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）外,基因型AST還容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。新興的表型AST包括微流體技術(shù)、拉曼光譜、表面等離子體共振等,主要基于在給定的物理化學(xué)環(huán)境中將細(xì)菌的生長(zhǎng)、形態(tài)等生理參數(shù)的變化轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的信號(hào)。而在抗菌藥物的作用下細(xì)胞產(chǎn)生的生理變化要比細(xì)胞抑制更快（1 hvs1～2 d）[2],因此新興的表型AST比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法快速,但是其成本、可操作性、準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步的驗(yàn)證與考量。

1 傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法

1.1擴(kuò)散法擴(kuò)散法主要包括紙片法、牛津杯法和打孔法,具有低成本、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn),其中紙片法運(yùn)用最廣。紙片法的原理是將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有待檢菌的瓊脂平板上,由于藥物會(huì)在瓊脂平板上進(jìn)行擴(kuò)散并且隨著距離的增加濃度會(huì)逐漸降低,最終根據(jù)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抑菌圈的直徑大小判斷待檢菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[3]。但是,擴(kuò)散法的試驗(yàn)結(jié)果受多種因素的影響,如培養(yǎng)基的厚度、抗生素含量等,加上試驗(yàn)中用到的試劑和耗材如培養(yǎng)基、藥敏紙片等來(lái)源渠道各異,因此須實(shí)施質(zhì)控監(jiān)測(cè),即在平行條件下將質(zhì)控菌株與待檢菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈在預(yù)測(cè)值之內(nèi)時(shí),待檢菌的試驗(yàn)結(jié)果才可信[4]。

1.2稀釋法稀釋法是監(jiān)測(cè)待檢菌在含一系列二倍稀釋抗菌藥物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況,其優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)等。稀釋法可分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。瓊脂稀釋法利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。將待檢菌接種在含有抗菌藥物的瓊脂平板上并過(guò)夜培養(yǎng)后,未有細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度即為MIC。肉湯稀釋法可分為微量肉湯稀釋和宏觀肉湯稀釋,其操作原理與瓊脂稀釋法相似,但換成了液體培養(yǎng)基[5]。

1.3E-test法與含有均等抗菌藥物濃度的藥敏紙片不同,E-test法所用到的非滲透性測(cè)試條的一端至另一端包被著濃度逐漸增高的抗菌藥物。將檢測(cè)條貼于瓊脂平板表面時(shí),藥物經(jīng)擴(kuò)散會(huì)形成一個(gè)連續(xù)變化的濃度梯度,待檢菌經(jīng)培養(yǎng)后最終在平板上會(huì)形成抑菌圈,在抑菌圈與測(cè)試條的交界處所對(duì)應(yīng)的抗菌藥物濃度即為該藥物對(duì)待檢菌的MIC[6]。E-test法與紙片法相似,具有定量的優(yōu)點(diǎn),并且MIC的判別與稀釋法相比更加直觀,但是其成本較高。

1.4藥敏自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)目前主要有3種被廣泛采用的藥敏自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng),分別為德國(guó)西門(mén)子的MicroScan Walk Away系統(tǒng)、法國(guó)梅里埃的VITEK系統(tǒng)和美國(guó)BD公司的Phoenix系列自動(dòng)化儀器,均基于微量肉湯稀釋法的原理設(shè)計(jì)。MicroScan Walk Away系統(tǒng)通過(guò)分光光度法檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況。VITEK系統(tǒng)可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況,將生長(zhǎng)速率與藥物濃度作線性回歸分析后判定MIC。Phoenix系統(tǒng)將刃天青作為氧化還原指示劑,通過(guò)檢測(cè)還原態(tài)刃天青的熒光強(qiáng)度來(lái)判定細(xì)菌生長(zhǎng)狀況[3]。這3種自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是儀器體積龐大、不便攜、昂貴、使用成本高,但優(yōu)勢(shì)在于嚴(yán)格遵循臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）和歐洲委員會(huì)的抗菌藥敏試驗(yàn)（EUCAST）指南。

2 新興藥敏試驗(yàn)技術(shù)

2.1基因型AST自1988年首次報(bào)道了使用熱穩(wěn)定聚合酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法以來(lái)[7],PCR技術(shù)發(fā)展迅速,包括普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR技術(shù)根據(jù)DNA熱變性原理,通過(guò)控制溫度對(duì)特定區(qū)域的序列進(jìn)行擴(kuò)增。普通PCR技術(shù)可檢測(cè)待檢菌的耐藥基因,但由于耐藥基因的出現(xiàn)不總與耐藥表型一致,且樣品基質(zhì)中所含的化合物可能會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng),容易導(dǎo)致假陰性或者假陽(yáng)性的結(jié)果[8]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可準(zhǔn)確定量樣本中特殊核酸的拷貝數(shù)來(lái)測(cè)量細(xì)菌生長(zhǎng)量,而不依賴(lài)于細(xì)菌耐藥機(jī)制。LAMP利用4個(gè)引物和6個(gè)識(shí)別（退火）位點(diǎn)在60 min內(nèi)產(chǎn)生高水平的擴(kuò)增子。與僅使用2個(gè)引物的標(biāo)準(zhǔn)PCR相比,LAMP具有更高的特異性[9]。微陣列可將多個(gè)探針固定在固體或液體介質(zhì)上,因此可以同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌基因組中與耐藥基因相關(guān)的多個(gè)突變位點(diǎn)[10],其在分枝桿菌的鑒定及耐藥基因的檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)尤為明顯[11]。PCR技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏、快速,甚至可以直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),但也有局限性,包括難以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞,不能提供MIC,并且核酸擴(kuò)增的陽(yáng)性結(jié)果并不能證明有生命體的存在[12]。而下一代測(cè)序可通過(guò)對(duì)全基因組的測(cè)序來(lái)比較等位基因或分析單核苷酸多態(tài)性,從而預(yù)測(cè)細(xì)菌的耐藥性[13]。

2.2基于光學(xué)的表型AST

2.2.1ATP生物發(fā)光測(cè)定法 ATP生物發(fā)光測(cè)定法的原理是基于螢光素酶利用ATP將熒光素氧化為腺苷酰氧化螢光素,最終形成的光強(qiáng)度與樣品中的ATP成一定比例,從而檢測(cè)細(xì)菌密度[14]。由于樣本中存在游離的非細(xì)菌ATP,體細(xì)胞中所含的ATP等干擾因素的存在,該方法無(wú)法準(zhǔn)確地進(jìn)行定量檢測(cè)。IVANCIC等[15]在檢測(cè)臨床尿液樣本中的細(xì)菌載量時(shí),先用體細(xì)胞提取劑來(lái)選擇性地裂解宿主細(xì)胞以釋放ATP,再用ATP酶來(lái)裂解宿主細(xì)胞的ATP以及游離的非細(xì)菌ATP,以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性,最終發(fā)現(xiàn)該方法可準(zhǔn)確估計(jì)臨床尿液樣本中的細(xì)菌密度。

2.2.2拉曼光譜 拉曼光譜是一種非侵入性、無(wú)標(biāo)記的可檢測(cè)分子振動(dòng)的技術(shù),它由存在于待檢菌培養(yǎng)液中的所有生物分子相對(duì)應(yīng)的條帶組成,這些條帶代表著分子的物理化學(xué)特征。對(duì)拉曼光譜進(jìn)行必要的校準(zhǔn)后,觀察添加抗生素前后所形成的拉曼光譜的區(qū)別,其中峰位置的側(cè)移反映了細(xì)菌表型的生物生化或生物物理變化,而峰高的變化則反映了該峰代表的生物分子豐度的變化[16]。但是,拉曼光譜的靈敏度較低,可通過(guò)金屬納米粒子利用表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced raman scattering,SERS）來(lái)解決這一問(wèn)題。LIU等[17]展示了一種高靈敏度的SERS基板,即Ag納米粒子嵌入的陽(yáng)極氧化鋁納米通道,其利用這一技術(shù)來(lái)研究分別在苯唑西林和亞胺培南作用下的甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌和野生型大腸桿菌的拉曼光譜,結(jié)果顯示,敏感菌的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜在波數(shù)為730 cm—1處的峰值在2 h內(nèi)有明顯的下降,同時(shí)可以確定MIC。雖然SERS提高了拉曼光譜的靈敏度,但是其需要底物,且細(xì)菌通常被可能干擾細(xì)菌拉曼信號(hào)的不同底物包圍,導(dǎo)致信號(hào)的實(shí)際變化太大。HONG等[18]開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)在單細(xì)胞水平上的拉曼散射成像技術(shù),其利用正常葡萄糖和葡萄糖-d7培養(yǎng)基培養(yǎng)糞腸球菌并將細(xì)菌沉積在瓊脂糖凝膠墊上,用CARS顯微鏡在C-D振動(dòng)區(qū)域?qū)渭?xì)胞進(jìn)行成像,結(jié)果顯示在添加萬(wàn)古霉素后,敏感菌株和耐藥菌株在0.5 h內(nèi)就表現(xiàn)出了不同的反應(yīng)。

2.2.3表面等離子體共振 當(dāng)光以一定的入射角與金屬表層中的電子耦合時(shí),電子會(huì)被激發(fā)而平行于金屬表面移動(dòng)以形成表面等離子體,能達(dá)到最大激發(fā)效率的入射角稱(chēng)為表面等離子體共振（surface plasmon resonance,SPR）角,而未耦合的部分則形成反射光。然而,耦合條件受到了與金屬表面相鄰材料折射率的影響。在SPR生物傳感器中,將探針結(jié)合在金屬表面,當(dāng)目標(biāo)分子與探針結(jié)合時(shí),傳感器的折射率發(fā)生變化,通過(guò)監(jiān)測(cè)反射光或者SPR角的變化來(lái)檢測(cè)目標(biāo)分子與探針的相互作用[19]。將列陣技術(shù)與SPR成像（surface plasmon resonance imaging,SPRI）技術(shù)結(jié)合還可以進(jìn)行高通量篩選。在SPRI技術(shù)中,入射角保持恒定,通過(guò)CCD攝像機(jī)監(jiān)測(cè)反射光的強(qiáng)度變化來(lái)反映傳感器的折射率變化。其中,CCD攝像機(jī)可以檢測(cè)整個(gè)列陣的圖像,從而提供每個(gè)列陣點(diǎn)的反射光信息[20]。然而,SPR傳感器常用到的棱鏡會(huì)限制成像系統(tǒng)的數(shù)值孔徑及放大倍數(shù),從而影響了空間分辨率。并且,樣本和攝像機(jī)之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)在棱鏡的影響下導(dǎo)致獲取的圖像發(fā)生改變,而物鏡型SPR則可以解決這一問(wèn)題。物鏡型SPRI在掃描入射角時(shí),樣品和成像系統(tǒng)是固定的,并且可以通過(guò)使用高數(shù)值孔徑和高倍率成像系統(tǒng)可保證成像光學(xué)的分辨率受到衍射限制,從而避免圖像失真[21]。SYAL等[22]開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)等離子體成像和跟蹤技術(shù),可以在2 h內(nèi)檢測(cè)多黏菌素B對(duì)大腸桿菌O157:H7和尿路致病性大腸桿菌的MIC。該技術(shù)利用680 nm超級(jí)發(fā)光二極管來(lái)激發(fā)SPR圖像,通過(guò)使用高數(shù)值孔徑物鏡（NA 1.49）和倒置顯微鏡對(duì)47 nm厚的金傳感器芯片進(jìn)行對(duì)比成像,并基于變化的等離子體圖像對(duì)比度揭示細(xì)菌的納米運(yùn)動(dòng)。結(jié)果顯示,抗生素的作用能顯著減慢敏感菌細(xì)胞的納米級(jí)運(yùn)動(dòng)。

2.3基于電學(xué)的表型AST

2.3.1基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）分析樣品時(shí),需要將樣品混合或包被于酸性基質(zhì)中,當(dāng)基質(zhì)結(jié)晶時(shí),包埋于基質(zhì)中的樣品發(fā)生共結(jié)晶,經(jīng)激光束投射后電荷從基質(zhì)轉(zhuǎn)移至樣品中,引起新電離粒子的解吸,接著在固定電場(chǎng)作用下由于質(zhì)荷比的不同而相互分離,并用飛行時(shí)間分析儀測(cè)量離子穿過(guò)電場(chǎng)所需的時(shí)間來(lái)確定質(zhì)荷比,最終生成肽質(zhì)量指紋的特征圖譜[23]。利用MALDI-TOF MS可通過(guò)不同的角度來(lái)分析待檢菌的藥物敏感性。首先,通過(guò)特征峰來(lái)分析細(xì)菌的敏感性,但是其局限性在于,只有當(dāng)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)包含各屬/種/亞種的菌株的肽質(zhì)量指紋圖譜時(shí),才能鑒定分離株。其次,利用抗生素發(fā)生的變化（水解,脫羧,乙?；﹣?lái)確定其是否產(chǎn)生作用。例如,β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可通過(guò)水解而失活,加水使原始抗生素質(zhì)量增加18 k Da,而脫羧作用使相對(duì)分子質(zhì)量減少44 k Da。兩者合計(jì),與抗生素的原始質(zhì)量相比損失26 k Da。但是當(dāng)細(xì)菌通過(guò)除了酶以外的其他途徑獲得耐藥性時(shí),該方法無(wú)效[24]。再者,SPARBIER等[25]描述一種基于MALDI-TOF MS的非常通用的測(cè)定細(xì)菌的藥物敏感性的方法,即用含同位素標(biāo)記的氨基酸的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌,其耐藥性可從在含有同位素標(biāo)記的氨基酸和抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌所產(chǎn)生的光譜推斷,如果細(xì)菌具有耐藥性,其質(zhì)荷比m/z會(huì)變高。理論上,該方法基于細(xì)菌生長(zhǎng),因此不受制于任何耐藥機(jī)制。

2.3.2介 電 電 泳 介 電 電 泳（dielectrophoresis,DEP）是一種無(wú)標(biāo)記、低成本的診斷技術(shù)。在該技術(shù)中,帶電或中性粒子的極化是由交流電或直流電產(chǎn)生的電場(chǎng)引起的,當(dāng)粒子和周?chē)橘|(zhì)具有不同的極化率時(shí),會(huì)在電場(chǎng)中發(fā)生不同方向的運(yùn)動(dòng)。因此,可通過(guò)改變電場(chǎng)大小等因素來(lái)操縱粒子的運(yùn)動(dòng)。不同的細(xì)胞類(lèi)型,處于成熟或增殖各個(gè)階段的細(xì)胞以及患病的細(xì)胞的極化率均不同,所以可通過(guò)研究它們的介電電泳行為來(lái)區(qū)分細(xì)胞的狀態(tài)[26]。當(dāng)使用交流電時(shí),常通過(guò)提高頻率（大于100 Hz）來(lái)消除電滲透和電泳同時(shí)減少電化學(xué)反應(yīng),如氣體的產(chǎn)生；而直流電介電電泳是近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的技術(shù),通過(guò)使用絕緣體列陣來(lái)形成空間的不均勻性后施加電場(chǎng),由于電極可以不與樣本直接接觸,該技術(shù)可以減少樣本受到積垢、電解的影響,同時(shí)由于無(wú)需金屬控件,設(shè)備制作更簡(jiǎn)單[27]。細(xì)菌經(jīng)過(guò)電場(chǎng)的分選后可進(jìn)一步觀察細(xì)菌在抗生素作用下發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化。SU等[28]開(kāi)發(fā)了一種四電極陣列,其形成的非均勻電場(chǎng)是由函數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生的。敏感菌經(jīng)藥物處理后比周?chē)慕橘|(zhì)的極化率高,被吸引到電場(chǎng)的強(qiáng)區(qū)域。相反,如果用無(wú)活性藥物或無(wú)藥物處理的細(xì)胞的極化能力不及周?chē)橘|(zhì),則被排斥到電場(chǎng)的弱區(qū)域。通過(guò)光學(xué)顯微鏡,結(jié)合CCD照相機(jī)和監(jiān)視器屏幕,觀察到細(xì)胞伸長(zhǎng)、膨脹、裂解等。

2.3.3電化學(xué)傳感器 電化學(xué)傳感器由于其便攜性、獨(dú)立性和低成本而成為強(qiáng)大的分析工具,通常是基于細(xì)菌與相應(yīng)受體結(jié)合后引起電信號(hào)的變化來(lái)研究細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。根據(jù)如何測(cè)量電信號(hào)的變化可將該傳感器分為以下5類(lèi):（1）阻抗生物傳感器。通過(guò)對(duì)工作電極施加電勢(shì)脈沖來(lái)獲取電流響應(yīng),從而檢測(cè)工作電極-電解質(zhì)界面的電容變化[29]。（2）安培/伏安生物傳感器。多數(shù)利用細(xì)菌與化學(xué)物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)來(lái)檢測(cè)電流的變化,從而反映細(xì)菌的生長(zhǎng)情況[30]。（3）電勢(shì)生物傳感器。主要檢測(cè)離子選擇電極的電荷的積累,該電極的電勢(shì)可選擇性地響應(yīng)給定離子的濃度[31]。（4）場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器。主要由源極、漏極、柵極組成,連接源極和漏極的半導(dǎo)體材料修飾生物識(shí)別分子,當(dāng)其識(shí)別靶標(biāo)分子后,改變了半導(dǎo)體材料的電導(dǎo),而柵極施加的柵壓可放大輸出的電流變化[32]。（5）電導(dǎo)生物傳感器。將能夠識(shí)別、結(jié)合靶標(biāo)分子的介質(zhì)（如納米線）連接2個(gè)電極,通過(guò)監(jiān)測(cè)介質(zhì)的電導(dǎo)率變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的選擇性檢測(cè)[33]。

2.4基于機(jī)械學(xué)的表型AST

2.4.1異步磁珠旋轉(zhuǎn)傳感器 異步磁珠旋轉(zhuǎn)（asynchronous magnetic bead rotation,AMBR）傳感器是一項(xiàng)無(wú)標(biāo)簽、能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的技術(shù)。放置在外部旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)內(nèi)的磁珠具有一定的旋轉(zhuǎn)頻率,而這種頻率受到磁珠（即形狀和體積）的變化或環(huán)境（即黏度）的影響?；谂ぞ氐拇胖閭鞲衅骺杀O(jiān)測(cè)由單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)引起的阻力變化。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞附著到飾有特異性抗體的磁珠上,磁珠復(fù)合物的有效體積會(huì)增加,然后在顯微鏡上對(duì)細(xì)菌的伸長(zhǎng)和分裂進(jìn)行觀察和測(cè)量,并量化傳感器磁珠的旋轉(zhuǎn)周期的變化。SINN等[34]將單個(gè)AMBR生物傳感器限制在納米級(jí)大小的油包水（w/o）液滴內(nèi),來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的增長(zhǎng)。該系統(tǒng)的高靈敏度使得異質(zhì)性研究以及單細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究成為可能。同一小組利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)了AMBR黏度計(jì),當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí),細(xì)菌濃度以及分泌的多糖會(huì)影響溶液黏度,最終改變珠子的旋轉(zhuǎn)頻率[35]。雖然AMBR傳感器已經(jīng)顯著減少AST測(cè)量時(shí)間,但仍需復(fù)雜的驅(qū)動(dòng)磁場(chǎng)來(lái)確定每個(gè)磁珠的旋轉(zhuǎn)周期。CHUNG等[36]開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)將光擴(kuò)散法和基于磁珠的免疫分析相結(jié)合的技術(shù)來(lái)量化粒子的布朗運(yùn)動(dòng)。當(dāng)活細(xì)菌特異性附著在顆粒上時(shí),光擴(kuò)散率會(huì)上升；當(dāng)經(jīng)過(guò)抗生素作用的敏感菌附著在顆粒上時(shí),光擴(kuò)散率會(huì)下降。該方法的靈敏度高,只需少量樣品就可同時(shí)測(cè)定多種病原體。隨后,CHUNG等[37]為同時(shí)檢測(cè)多種病原體的藥物敏感性?xún)?yōu)化了該項(xiàng)技術(shù)。通過(guò)不同的病原體特異性抗體功能化的熒光色顆粒與病原體結(jié)合,使用ImageJ將多色粒子圖像分開(kāi),從而產(chǎn)生每種熒光色的圖像集。然后,通過(guò)互相關(guān)算法分析分割后的圖像集,以評(píng)估其相應(yīng)的擴(kuò)散率值。相對(duì)擴(kuò)散率值是通過(guò)將抗原抗體特異性結(jié)合的粒子的擴(kuò)散率除以參考粒子的擴(kuò)散率而獲得的,從而消除了因不同環(huán)境因素或背景噪聲引起的測(cè)量差異。

2.4.2納米機(jī)械生物傳感器 納米機(jī)械生物傳感器具有微米甚至納米尺寸的運(yùn)動(dòng)部件,通常是懸臂形的。由于生物分子的大小與傳感器的尺寸（主要是厚度）相當(dāng),因此傳感器對(duì)吸附的生物分子的機(jī)械特性高度敏感。當(dāng)細(xì)胞特異性吸附于懸臂時(shí),質(zhì)量、表面應(yīng)力、有效楊氏模量、黏彈性等參數(shù)會(huì)發(fā)生改變,導(dǎo)致傳感器發(fā)生偏轉(zhuǎn)或共振頻率的變化,通過(guò)光學(xué)、電學(xué)技術(shù)可以至少以0.1 nm Hz—1/2的靈敏度檢測(cè)到傳感器的機(jī)械變化[38]。其中,最常用到的是光杠桿技術(shù),其原理是檢測(cè)經(jīng)傳感器表面反射的激光束的偏轉(zhuǎn)。STUPAR等[39]通過(guò)將納米機(jī)械生物傳感器與快速獲取血液培養(yǎng)物中的細(xì)菌沉淀的方法相結(jié)合,可直接對(duì)血液樣品進(jìn)行藥敏試驗(yàn),其利用氯化銨離心技術(shù)在1 h內(nèi)對(duì)來(lái)自陽(yáng)性血液培養(yǎng)物的細(xì)菌進(jìn)行濃縮,當(dāng)附著的細(xì)菌具有代謝活性時(shí),可通過(guò)光學(xué)杠桿方法來(lái)檢測(cè)傳感器的振蕩,并在3 h內(nèi)檢測(cè)出大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星等藥物的敏感性。而電學(xué)技術(shù)中最常用到的壓阻檢測(cè),該技術(shù)需要將壓阻元件與傳感器一體化,利用惠斯登電橋測(cè)量由分子吸附在壓阻元件后引起的電阻變化。NUMFOM等[40]將PCR技術(shù)應(yīng)用于壓阻式納米機(jī)械生物傳感器,當(dāng)霍亂弧菌的ctx A基因與壓阻材料上的ssDNA探針結(jié)合時(shí),可引起壓阻材料的電阻變化從而檢測(cè)傳感器的彎曲度。該傳感器可在3.25 pg或14 nmol/L的DNA模板中檢測(cè)出ctx A基因,比傳統(tǒng)PCR的靈敏度高10倍。原子力顯微鏡是連接著微懸臂的顯微鏡,可以對(duì)懸臂表面的細(xì)胞進(jìn)行掃描以獲取其形態(tài)、生長(zhǎng)情況等信息。原子力顯微鏡有許多優(yōu)點(diǎn),首先它具有非常高的分辨率,可以識(shí)別細(xì)菌的納米結(jié)構(gòu)；其次,它可用來(lái)探索微生物的納米力學(xué)特性,同時(shí)探測(cè)外部刺激引起的形態(tài)和機(jī)械變化；另外,AFM還可以任何環(huán)境條件下使用,包括液體、真空在內(nèi)[41]。但是,納米機(jī)械生物傳感器仍存在著局限性。例如,懸臂的尺寸會(huì)影響捕獲細(xì)菌的數(shù)量；在液體環(huán)境中測(cè)量共振頻率的靈敏度會(huì)由于液體阻尼的存在而受到懸臂的低質(zhì)量（Q-因子）的限制。而微通道諧振器可以很好地解決這一問(wèn)題。由于液體在懸臂內(nèi),后者可在真空環(huán)境下發(fā)生共振,使得分辨率變得更高。但由于微通道諧振器缺乏檢測(cè)選擇性,ETAYASH等[42]將其和紅外光譜結(jié)合,在微懸臂中嵌入一個(gè)微通道,通過(guò)獲取包括細(xì)菌的吸附質(zhì)量、表面應(yīng)力、紅外光譜在內(nèi)的3個(gè)信號(hào)來(lái)提高該檢測(cè)系統(tǒng)的選擇性。首先,細(xì)菌的吸附會(huì)改變懸臂的質(zhì)量,導(dǎo)致懸臂共振頻率發(fā)生變化。然后,吸附引起的表面應(yīng)力會(huì)使懸臂彎曲。另外,由于非輻射衰減,當(dāng)紅外輻射照射懸臂時(shí),被吸附的細(xì)菌吸收特定的紅外波長(zhǎng),懸臂發(fā)生額外的偏轉(zhuǎn)。

2.5其他

2.5.1流式細(xì)胞術(shù) 種群的異質(zhì)性以及細(xì)胞間的相互作用的存在影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,而流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估,其正好解決這一問(wèn)題。流式細(xì)胞儀能檢測(cè)細(xì)胞個(gè)數(shù)和生理特性,包括膜電位、膜完整性、DNA含量、酶活性等,并且每秒能夠分析成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞[43]。通過(guò)選擇不同的熒光探針和不同角度的光散射來(lái)進(jìn)行細(xì)胞分選,其中光散射反映細(xì)胞大小和結(jié)構(gòu),而熒光則反映DNA或特定蛋白質(zhì)的含量、酶活性、膜電位[44]。

2.5.2微流體技術(shù) 微流體技術(shù)可將細(xì)胞限制在微米級(jí)甚至是納米級(jí)的設(shè)備中,因此,可以高度控制細(xì)胞的微環(huán)境。微流體技術(shù)的發(fā)展歸功于一種易于使用的制造技術(shù),即軟光刻技術(shù),它可制造不同形狀的彈性體聚合物的微器件,而目前最常用的就是聚二甲基硅氧烷[45]。微流體技術(shù)有非常多的優(yōu)點(diǎn):可根據(jù)試驗(yàn)需求為單細(xì)胞制造不同的微生物環(huán)境；在物理上實(shí)現(xiàn)隔離,但允許化學(xué)交流；使目標(biāo)分子容易達(dá)到可檢測(cè)水平；微流體系統(tǒng)的較大的表面積與體積比有助于細(xì)菌的快速生長(zhǎng)[46]。由于很多細(xì)菌具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力,因此還可以利用微流體將其捕獲在液滴,微腔,通道中,進(jìn)而用直接和間接的方法對(duì)單個(gè)細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)[47]。目前,利用微流體技術(shù)開(kāi)發(fā)了多種具有特定功能的設(shè)備,比如濃度梯度生成器,高通量篩選平臺(tái),微腔陣列等。濃度梯度生成器通常是由一系列的通道和腔室組成,層流的液體在通道中隨著流動(dòng)發(fā)生擴(kuò)散混合,最終在腔室形成線性濃度梯度的化學(xué)物質(zhì)。因此將濃度梯度生成器應(yīng)用于藥敏試驗(yàn),不僅減少了人力,而且能觀察細(xì)菌對(duì)線性濃度梯度的抗生素的反應(yīng)[48]。為了在短時(shí)間內(nèi)確定細(xì)菌在使用抗菌藥物后是否能繼續(xù)分裂,CHOI等[49]開(kāi)發(fā)了一種單細(xì)胞形態(tài)分析（SCMA）技術(shù),首先將細(xì)菌和瓊脂糖混合后注入微流體通道內(nèi)然后通過(guò)凝膠固化將細(xì)菌固定,接著抗菌藥物擴(kuò)散至瓊脂中,并對(duì)細(xì)菌的形態(tài)變化進(jìn)行延時(shí)成像,最終觀察到細(xì)菌發(fā)生分裂、絲狀形成、腫脹、絲狀形成與分裂、腫脹形成與分裂等5種形態(tài)變化。BROUZES等[50]提出一種基于液滴的微流體技術(shù),可將單個(gè)細(xì)胞和藥物封裝在不混溶的獨(dú)立水性微滴（體積為1～104p L）中,為了進(jìn)行高通量篩選,他們還對(duì)每一種藥物編碼了光學(xué)標(biāo)簽,將藥物與細(xì)胞混合后,經(jīng)過(guò)染色可檢測(cè)液滴的熒光,進(jìn)而識(shí)別液滴中的藥物。他們還利用自己開(kāi)發(fā)的液滴存活力測(cè)定法對(duì)液滴內(nèi)細(xì)胞活力和生長(zhǎng)進(jìn)行定量評(píng)分。這種基于液滴的技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括:液滴的微小體積使試劑快速有效混合；高通量地對(duì)液滴進(jìn)行數(shù)字處理；特別適用于處理可用性有限的細(xì)胞,例如干細(xì)胞或患者的原代細(xì)胞。在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中,糖的代謝產(chǎn)物有機(jī)酸的增加會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基p H值發(fā)生變化。針對(duì)該現(xiàn)象,TANG等[51]開(kāi)發(fā)了一種微流體p H傳感器,他們將對(duì)p H敏感的殼聚糖水凝膠涂覆在多孔硅芯片上,該芯片用作微流體通道的基底。當(dāng)p H發(fā)生變化時(shí),殼聚糖水凝膠發(fā)生溶脹,導(dǎo)致有效光學(xué)厚度發(fā)生變化,因此可通過(guò)傅立葉變換反射光譜法實(shí)時(shí)觀察微通道中p H的變化。該傳感器的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)將細(xì)菌細(xì)胞限制在納升大小的通道中,可以快速積累代謝產(chǎn)物,還能獲得完整的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。微流體技術(shù)在研究一些特殊細(xì)菌的試驗(yàn)中也顯示良好的發(fā)展前景。眾所周知,生物膜中的細(xì)菌比浮游細(xì)菌對(duì)抗生素的抵抗力要高得多。而微流體系統(tǒng)不僅能促進(jìn)生物膜的形成,而且能研究生物膜形成的機(jī)制以及抗生素對(duì)消除生物膜的影響[52]。

2.5.3等溫微量熱法 等溫微量熱法（isothermal microcalorimetry,IMC）是將微生物置于安瓿瓶中,通過(guò)測(cè)量其生長(zhǎng)代謝引起的熱量變化來(lái)研究抗菌藥物對(duì)待檢菌的影響。該方法的優(yōu)點(diǎn)主要有以下幾方面:第一,每個(gè)活細(xì)胞平均產(chǎn)生1～3 p W的熱量,而等溫微量熱儀可測(cè)量低至1μW的熱流,因此只需少量樣品就可完成檢測(cè)；第二,密封的安瓿瓶可提高微生物安全性,減少交叉污染；第三,IMC具有非破壞性的特點(diǎn),經(jīng)IMC測(cè)量后的未受干擾的樣本可進(jìn)行二次評(píng)估；第四,IMC還可以對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的熱流變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),經(jīng)驗(yàn)證,隨時(shí)間推移累積的熱量與細(xì)菌含量的升高相關(guān)[53]。眾所周知,MIC并不能區(qū)分抗生素具有抑菌性還是殺菌性,而IMC不僅能夠提供MIC結(jié)果,而且還能通過(guò)定量測(cè)量抗生素對(duì)細(xì)菌滯后階段以及生長(zhǎng)速率的影響來(lái)確定抗生素的性質(zhì)。具體而言,延長(zhǎng)的滯后階段表明抗生素具有殺菌活性,這是由于即使一部分細(xì)胞被殺死,其最大生長(zhǎng)速率也不受影響或受到的影響較小；而抑菌劑會(huì)干擾細(xì)胞過(guò)程,導(dǎo)致最大生長(zhǎng)速率下降而對(duì)滯后期持續(xù)時(shí)間的影響很小[54]。但是,由于安瓿瓶?jī)?nèi)的氣體無(wú)法流通,同時(shí)不同細(xì)菌和抗生素、初始的細(xì)菌濃度等因素導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間的不確定性,使得瓶?jī)?nèi)的環(huán)境存在差異,從而影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

3 展望

近年來(lái),快速藥敏試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展為控制耐藥性帶來(lái)了希望。但是,許多技術(shù)雖然加快了臨床病原微生物對(duì)藥物敏感性的檢測(cè)速度,但仍要求在檢測(cè)之前從臨床樣品中分離純化出病原微生物。因此,加快藥敏試驗(yàn)的整個(gè)進(jìn)程甚至實(shí)現(xiàn)直接用臨床樣本進(jìn)行藥敏試驗(yàn)將成為最終要解決的難題。譬如,血液的成分比尿液的要復(fù)雜得多,如何在實(shí)現(xiàn)直接對(duì)臨床血液陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏檢測(cè)的過(guò)程中降低其背景值的問(wèn)題也需要建立標(biāo)準(zhǔn)。在縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)必須要與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比以驗(yàn)證準(zhǔn)確性,美國(guó)FDA規(guī)定,嚴(yán)重錯(cuò)誤率（誤鑒定為敏感菌株）必須＜1.5%,主要錯(cuò)誤率（誤鑒定為耐藥菌株）必須＜3.0%。上述新興藥敏試驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)雖然縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng),但是與“金標(biāo)準(zhǔn)”藥敏試驗(yàn)方法相比,仍需要對(duì)其成本效益、準(zhǔn)確性、實(shí)用性做出進(jìn)一步的評(píng)估。