金小虎,石學穎,孫良振,林敬軼,劉 雪,郭海濤,王婧然,王漠然,岳順利,周佳勃 （東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030）

動物胚胎工程所需卵母細胞多來自于屠宰場廢棄卵巢中的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）。COCs再經(jīng)過體外成熟（in vitromaturation,IVM）可得到大量廉價可用卵母細胞。優(yōu)質(zhì)的卵母細胞是體外受精、克隆動物、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)成功與否的重要保證[1]。因此,改進體外成熟技術(shù),提高卵母細胞體外成熟質(zhì)量越來越受到人們的重視。動物運輸、氣候異常導致高溫往往使動物遭受熱應(yīng)激。有報道顯示,豬卵母細胞在生發(fā)泡破裂（GVBD）至4細胞（4-cell）之間的發(fā)育階段對熱應(yīng)激具有高度敏感性[2]。熱應(yīng)激還會誘發(fā)氧化應(yīng)激[3],造成線粒體功能紊亂[4],從而產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）,而過量的活性氧會進一步導致卵母細胞體外成熟利率以及胚胎發(fā)育率的下降。

Sirtuins蛋白家族成員Sirt3定位于線粒體基質(zhì)中,可以直接通過去乙?；饔眉せ畛趸锲缁?（SOD2）調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)[5],在卵母細胞和植入前胚胎中發(fā)揮保護作用[6]。和厚樸酚（3′,5-二-（2-丙烯基）-1,1′-聯(lián)苯-2,2′-二醇）是一種天然木脂素,目前已被廣泛用于治療各種疾病[7]。和厚樸酚可以提高過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）水平和活性,提高線粒體的活性,保護線粒體在氧化應(yīng)激下的功能[8]。而PGC-1α可以調(diào)節(jié)Sirt3活性,Sirt3介導PGC-1α對細胞內(nèi)活性氧生成和線粒體生物發(fā)生的影響[9]。

因此,本試驗以卵巢體外熱應(yīng)激模型為基礎(chǔ),研究和厚樸酚對豬熱應(yīng)激后卵母細胞體外成熟和后續(xù)發(fā)育中的作用,為Sirt3及其控制的抗氧化防御體系在相關(guān)病理及生理機制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑所使用的生化試劑與藥品如無特殊說明均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2主要液體的配制體外成熟液是TCM199培養(yǎng)液基礎(chǔ)中添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、1 mmol/LL-谷氨酰胺、0.57 mmol/LL-半胱氨酸、0.01 IU/L PMSG、0.01 IU/L hCG、75 mg/L青霉素、50 mg/L硫酸鏈霉素、10%豬卵泡液。根據(jù)參考文獻[8]的方法,先將和厚樸酚用DMSO配制成10 mmol/L的濃儲液,—20℃保存,在試驗時根據(jù)需要用體外成熟液稀釋成10μmol/L的工作液。

1.3卵巢的獲取與熱應(yīng)激處理將獲取自屠宰場的新鮮豬卵巢放入37℃含青霉素100 mg/L、鏈霉素50 mg/L生理鹽水的保溫桶中,1 h之內(nèi)帶回實驗室,使用經(jīng)過預(yù)熱并添加青霉素與鏈霉素的生理鹽水沖洗。根據(jù)參考文獻[10]的方法將部分卵巢放入溫度為41.5℃的培養(yǎng)箱中進行1 h的熱應(yīng)激處理。

1.4卵母細胞的收集與培養(yǎng)用20 m L注射器抽取直徑3～6 mm卵泡中COCs。抽取結(jié)束后卵泡液轉(zhuǎn)入離心管中,37℃溫箱中靜置10 min后棄上清,重復2次后收集沉降的沉淀COCs,在TLHepes-PVA液中挑選胞質(zhì)均勻的COCs,隨后按照30枚COCs一組加入到預(yù)先過夜平衡的成熟液微滴（150μL）中,在38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。

1.5活性氧水平檢測卵母細胞中的活性氧水平檢測是根據(jù)參考文獻[11]的方法,使用活性氧檢測試劑盒（Beyotime,Cat＃S0033）檢測。取適量的檢測液用培養(yǎng)液或DPBS按照1∶1 000的比例稀釋使其終濃度達到10μmol/L,將去卵丘卵母細胞加入此工作液中孵育30 min,孵育完畢后用DPBS充分洗凈并進行圖像采集。

1.6線粒體膜電位檢測取適量JC-1（Beyotime,Cat＃C2006）使用培養(yǎng)液按照1∶200的比例稀釋后制成培養(yǎng)微滴覆蓋石蠟油,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進行平衡。平衡結(jié)束后將去卵丘卵母細胞加入到含有JC-1的培養(yǎng)微滴中,在培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后立即使用熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計紅色和綠色熒光的卵母細胞的比例。

1.7Sirt3、SOD2免疫熒光染色根據(jù)參考文獻[12]的方法將卵放入4%多聚甲醛中固定30 min,固定完畢后用杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗3次,使用1%Triton-X100對卵母細胞進行通透處理30 min,處理結(jié)束后繼續(xù)用DPBS清洗3遍,使用3%BSA進行封閉處理,封閉時間為1 h,隨后將卵母細胞在一抗（Sirt3抗體,貨號bs6105R或者SOD2抗體,貨號AF4360）中4℃孵育過夜,使用DPBS清洗3次,二抗孵育2 h,DPBS清洗3次后將使用Hoechst33342對染色體進行染色10 min,用DPBS將卵母細胞充分洗凈后將其小心加入到已滴加至載玻片上的防熒光淬滅劑液滴中,封片后使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察與拍照。

1.8豬卵母細胞孤雌激活將成熟卵母細胞加入到含有5μmol/L離子霉素的PBS操作液中激活5 min,隨后將卵母細胞放入用含2 mol/L 6-二甲氨基嘌呤的PZM-3培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h。激活完畢后,將胚胎轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)先平衡的PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng),并統(tǒng)計發(fā)育情況。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism7軟件進行分析,顯著性統(tǒng)計使用軟件中的ANOVA模塊進行單因素方差分析。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤（x±s x） 表示。所有試驗除特殊說明外至少重復3次。

2 結(jié)果

2.1和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞成熟率的影響在經(jīng)過44 h的體外成熟后,熱應(yīng)激組卵母細胞體外成熟率要明顯低于對照組（P＜0.01）；在熱應(yīng)激＋和厚樸酚組的卵母細胞成熟率顯著高于熱應(yīng)激組卵母細胞成熟率（P＜0.05）（圖1）。結(jié)果表明,和厚樸酚可以提高熱應(yīng)激卵母細胞的成熟率。

圖1 和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞成熟率的影響

2.2和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞中Sirt3蛋白的影響通過免疫熒光染色證實在正常卵母細胞中Sirt3分布于GV期卵母細胞的胞質(zhì)中,但在生發(fā)泡周圍有較為明顯的聚集；在卵母細胞成熟過程中Sirt3水平在細胞質(zhì)中增加；而經(jīng)歷熱應(yīng)激后,Sirt3熒光強度出現(xiàn)了減弱,并貫穿體外成熟的整個過程；熱應(yīng)激＋厚樸酚組的成熟卵母細胞中Sirt3的熒光強度增強并接近于對照組（圖2）。

圖2 和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞中Sirt3的影響

2.3和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞中SOD2的乙?；潭鹊挠绊懯褂肧OD2乙?；贵w檢測和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞SOD2的乙?；潭鹊挠绊?。結(jié)果顯示,經(jīng)過熱應(yīng)激后GV期的豬卵母細胞中SOD2的乙?；潭纫哂趯φ战M（P＜0.05）,熱應(yīng)激組卵母細胞在MⅠ期、MⅡ期的乙?；潭确謩e高于對照組（P＜0.05,P＜0.01）；在熱應(yīng)激＋和厚樸酚組,卵母細胞SOD2的乙?；潭瘸尸F(xiàn)降低趨勢,與熱應(yīng)激組相比差異顯著（P＜0.05）（圖3）。

圖3 和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞中SOD2的影響

2.4和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞中的ROS水平的影響對卵母細胞中的ROS水平進行檢測后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MⅡ期,熱應(yīng)激組卵母細胞的平均熒光強度要顯著強于對照組（P＜0.01）,而和厚樸酚的加入使得熱應(yīng)激卵母細胞的ROS水平顯著降低（P＜0.05）（圖4）。

圖4 和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞（MⅡ期）中ROS水平的影響

2.5和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞線粒體膜電位的影響使用JC-1熒光探針對豬卵母細胞的線粒體膜電位進行測定。通過紅∶綠熒光JC-1染色法測定的卵母細胞線粒體活性發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激卵母細胞紅∶綠比值顯著低于對照組（P＜0.01）；添加和厚樸酚后,卵母細胞線粒體膜電位相較于熱應(yīng)激組顯著升高（P＜0.05）,表明和厚樸酚對于提高熱應(yīng)激卵母細胞線粒體膜電位保護線粒體功能具有積極的作用（圖5）。

圖5 和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞（MⅡ期）線粒體膜電位的影響

2.6和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞的體外發(fā)育能力的影響熱應(yīng)激組卵母細胞經(jīng)孤雌激活后胚胎發(fā)育能力相比對照組降低極顯著（P＜0.01）,熱應(yīng)激＋和厚樸酚組胚胎的體外發(fā)育能力與熱應(yīng)激組相比顯著提高（P＜0.05）（圖6）。結(jié)果表明,和厚樸酚對于熱應(yīng)激卵母細胞的體外發(fā)育能力有提高作用。

圖6 和厚樸酚對熱應(yīng)激卵母細胞孤雌激活胚胎體外發(fā)育能力的影響

3 討論

夏季高溫、動物運輸往往使動物遭受熱應(yīng)激,會導致動物生殖能力下降。熱應(yīng)激后機體的氧化應(yīng)激也會提高,從而造成生殖細胞的氧化損傷,最終降低細胞的發(fā)育能力[11]。

健康細胞的線粒體會嚴格地控制細胞呼吸過程中ROS的生成。如果細胞ROS升高會影響到線粒體正常的生理功能[13]。在糖尿病模型小鼠卵母細胞中線粒體的功能性障礙就是由ROS水平升高所導致[14]。有研究發(fā)現(xiàn),在豬的成纖維細胞中ROS含量過高可引起線粒體膜電位的下降[15]。本試驗結(jié)果表明,熱應(yīng)激后的豬卵母細胞的ROS含量顯著升高、線粒體膜電位顯著下降。而在成熟液中添加和厚樸酚,熱應(yīng)激卵母細胞的線粒體膜電位與熱應(yīng)激組相比顯著升高。這種現(xiàn)象與在中國倉鼠卵巢細胞[16]以及大鼠心肌細胞中[17]的研究中添加和厚樸酚保護線粒體膜功能的結(jié)果是相一致。

錳超氧化物歧化酶2（SOD2）屬于金屬過氧化物歧化酶家族成員。SOD2廣泛存在于線粒體。其表達以及活性的降低將導致對線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS的清除作用降低,從而導致線粒體DNA的過氧化損傷[18]。SOD2蛋白序列第122位的賴氨酸殘基以及該殘基周圍一段由13個氨基酸組成的特殊的序列,在哺乳動物進化中具有保守性[5],通過檢測該殘基的乙?；潭瓤梢耘袛郤OD2的活性高低。Sirt3定位于哺乳動物線粒體基質(zhì)中,具有NAD＋依賴的去乙?；富钚訹19]。據(jù)報道,Sirt3能夠特異性的調(diào)節(jié)SOD2的活性,是調(diào)節(jié)線粒體ROS穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子[14]。

卵母細胞健康發(fā)育依賴于氧化劑和抗氧化劑所維持的穩(wěn)定狀態(tài)[20]。LIU等[14]發(fā)現(xiàn),過表達Sirt3可以顯著降低糖尿病模型小鼠的卵母細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。本試驗結(jié)果表明,熱應(yīng)激后卵母細胞的Sirt3蛋白的表達量下降和SOD2乙酰化水平上升,而添加了和厚樸酚卻可以提高Sirt3蛋白的表達量和降低SOD2的乙?；健?jù)報道,和厚樸酚是Sirt3的激活劑具有很強的抗氧化性能[8],它可以逆轉(zhuǎn)小鼠的心肌肥厚[21]。另一項研究結(jié)果表明,和厚樸酚可以有效激活t-BHP損傷的肝細胞中的Sirt3,同時降低SOD2的乙?；潭?進而提高SOD2的活性,使肝細胞免受氧化損傷[8]。在試驗結(jié)果表明,熱應(yīng)激豬卵母細胞的體外成熟率和發(fā)育率顯著下降,而添加和厚樸酚可以減輕熱應(yīng)激對卵母細胞造成的損害,表明和厚樸酚可能是通過激活卵母細胞中的Sirt3蛋白,促進SOD2發(fā)生去乙?；?提高抗氧化酶活性,清除過量的ROS,增強了卵母細胞線粒體功能,進而提高熱應(yīng)激卵母細胞的成熟率和囊胚率。

綜上所述,向成熟液中添加和厚樸酚可以改善卵細胞體外成熟質(zhì)量,維持體外成熟卵母細胞的成熟效率并提高體外發(fā)育率,這些結(jié)果可以為優(yōu)化細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)提供理論參考。