袁鈺潔,周婧雯,殷 實(shí),楊柳青,秦文昌,李 鍵,2,3* （.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川成都 6004；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 6004；3.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 6004；4.西南民族大學(xué) 現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn),四川 成都 6004）

睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生的順利進(jìn)行是哺乳動(dòng)物維持種群繁衍的基本條件,其受到多種基因的調(diào)控[1]。miRNAs是長約22 nt的一類非編碼短鏈RNA,可以通過與m RNAs的3′UTR區(qū)域的堿基互補(bǔ),實(shí)現(xiàn)其基因調(diào)控的功能[2]。miRNA合成的步驟包括初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（primary miRNA）轉(zhuǎn)錄、前體miRNA（miRNA precursor）形成、前體miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、雙鏈miRNA產(chǎn)生和成熟等[2]。DICER是核糖核酸酶Ⅲ（ribonucleaseⅢ）家族的成員,在細(xì)胞質(zhì)將前體miRNA加工成22 nt左右的成熟miRNA[3]。有研究敲除了小鼠原始生殖細(xì)胞的Dicer基因,發(fā)現(xiàn)其原始生殖細(xì)胞和精原細(xì)胞增殖、分化受限,導(dǎo)致精子生成障礙[4],提示miRNA在生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。多個(gè)miRNA已被報(bào)道參與精子發(fā)生的調(diào)控,例如miR-20通過下調(diào)精原干細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3的表達(dá)促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞自我更新[5],miR-let-7家族成員可通過調(diào)節(jié)與促進(jìn)細(xì)胞增殖分化相關(guān)的IGF1信號(hào)通路促進(jìn)小鼠精原細(xì)胞分化[6],以保障有絲分裂的順利進(jìn)行。miR-34c通過抑制重要的轉(zhuǎn)錄激活因子ATF1的表達(dá)影響B(tài)CL-2/BAX基因表達(dá),促進(jìn)小鼠雄性生殖細(xì)胞凋亡[7]。由此看來,miRNA能夠通過調(diào)控精子發(fā)生過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)保障這一過程順利進(jìn)行。

迄今為止,已有多個(gè)研究分析了各物種不同發(fā)育階段睪丸組織miRNA的表達(dá)譜。YAN等[8]研究比較了性成熟前后小鼠睪丸的miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)19個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,其中miR-181a及miR-181b在成熟睪丸中的表達(dá)上調(diào),其靶基因RsbnⅠ被證實(shí)參與單倍體生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。何良軍[9]在研究哈薩克馬駒（5月齡）、周歲馬（1.5歲）和成年馬（3～8歲）的睪丸miRNA表達(dá)譜后,發(fā)現(xiàn)周歲馬和成年馬相比,miR-34b和miR-34c的表達(dá)量顯著升高,表明miR-34b和miR-34c可能促進(jìn)精子發(fā)生。白曼[10]構(gòu)建了小尾寒山羊睪丸不同發(fā)育階段（性成熟前（2月齡）、性成熟（6月齡）和體成熟（12月齡））miRNA表達(dá)譜,篩選出29個(gè)與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因（CA3、APOH、SYT6等）。

牦牛（Bos grunniens）是分布于青藏高原及周邊地區(qū)的特有牛種,能為牧民提供優(yōu)質(zhì)的肉、乳等產(chǎn)品。但牦牛生長速度緩慢、性成熟晚、繁育能力較低的特性,很大程度上阻礙了牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,針對牦牛精子發(fā)生過程中的分子機(jī)制進(jìn)行研究,對于提高牦牛的繁育能力,具有重要的研究和生產(chǎn)指導(dǎo)意義[11-12]。此前關(guān)于睪丸組織miRNA表達(dá)譜的研究主要集中在胚后發(fā)育階段,對于出生前后牦牛睪丸發(fā)育過程中的miRNA的種類、特征及其發(fā)揮的作用仍然不清楚。本研究利用RNA-Seq技術(shù)對胎兒期（4～5月齡）、犢牛期（1歲）和性成熟期（3歲）牦牛睪丸組織中的miRNA進(jìn)行高通量測序,并且對測序獲得的miRNA的結(jié)構(gòu)、功能和分布進(jìn)行分析,探討了miRNA對牦牛精子發(fā)生的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣本采集樣本采自四川省成都市青白江屠宰場,采樣器材均提前使用DEPC水浸泡處理。選擇健康的雄性牦牛,根據(jù)年齡將其分為3組:胎兒期（4～5月齡）、犢牛期（1歲）和性成熟期（3歲）,來自同一年齡組的2頭牦牛視為生物學(xué)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)頸部放血處死后,用DEPC水處理過的剪刀摘去雙側(cè)睪丸及其周邊組織（胎牛睪丸采用外科手術(shù)去勢的方法采?。?移除附睪、脂肪墊,將睪丸組織修剪為約1 cm×1 cm×0.5 cm的小塊后放入含有RNA laterTM的離心管中,立即投入液氮罐中,并在1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室—80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器及試劑分光光度計(jì)（NanoPhotometer-N60,Implen公司）；熒光定量儀（Qubit2.0,Life Technologies公司）；生物分析儀（Agilent 21,安捷倫公司）。RNA laterTM（AM7020,Invitrogen公司）；TRIzol（15596026,Invitrogen公 司）；miRNA First Strand cDNA Synthesis（Tailing Reaction）試劑盒（B532451,生工公司）；Real-time PCR Master（ROX）（Real-time PCR 2×mix）（04913914001,Roche公司）。

1.3Small RNA(sRNA)文庫構(gòu)建、質(zhì)檢與測序TRIzol法分別抽提6個(gè)睪丸組織的總RNA,采用NanoPhotometer-N60檢測RNA的純度（D260/D280及D260/D230的比值）和濃度,用Qubit2.0對RNA濃度進(jìn)行精確定量,通過Agilent 2100檢測RNA的完整性。合格后的樣品用Small RNA Sample Pre Kit分別構(gòu)建6個(gè)測序樣本的cDNA文庫,庫起始RNA為3μg的,首先在其3′和5′端加上測序接頭后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再用8%的聚丙烯酰胺凝膠純化PCR產(chǎn)物,篩選140～160 bp的DNA片段進(jìn)行膠回收,最后利用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行測序[13]。

1.4總RNA提取、miRNA反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR用TRIzol法分別提取牦牛不同發(fā)育階段睪丸組織的總RNA,一部分保存在—20℃,根據(jù)miRNA First Strand cDNA Synthesis（Tailing Reaction）試劑盒說明進(jìn)行加尾與反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系:2×miRNA RT Solution mix 10μL,miRNA RT Enzyme mix 2 μL,RNA模板2μL,RNase-free water 6μL。反應(yīng)條件:37℃60 min,85℃5 min,所得cDNA稀釋50倍后作為模板用于后續(xù)qPCR反應(yīng)。

參 照miRbase 21.0（http://www.mirbase.org/）中miRNA的成熟序列設(shè)計(jì)特異性引物,引物由上海生工合成,引物信息見表1。采用SYBY Green染料法對miRNA測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,以U6基因作為內(nèi)參,參照miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）說明進(jìn)行qPCR檢測,反應(yīng)體系:2×miRcute Plus miRNA Premix（with SYBR&ROX）10μL,上、下游引物各0.4μL,miRNA第1鏈cDNA 2μL,dd H2O 8μL。反應(yīng)條件:95℃15 min；94℃20 s,64℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。

表1 qPCR引物序列

1.5miRNA測序數(shù)據(jù)分析利用Illumina's Genome Analyzer處理原始數(shù)據(jù)（raw reads）。首先去除原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量reads,保留高質(zhì)量reads,去除以下情況的reads:含無法確定堿基信息量大于10%、被5′末端接頭污染、無3′末端接頭及熒光標(biāo)記以及含有poly A/T/C/G的,最終獲得過濾后的數(shù)據(jù)（clean reads）。將上述clean reads與miRbase 21.0（http://www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,按已知miRNAs＞r RNAs＞t RNAs＞sn RNAs＞snoRNAs＞重復(fù)序列＞基因區(qū)＞新miRNAs的順序?qū)γ恳粭lsRNA進(jìn)行唯一注釋。整合miREvo和miRDeep2等miRNA預(yù)測軟件進(jìn)行新miRNA的分析。通過GO分析對miRNA靶基因進(jìn)行功能預(yù)測。對各樣本中所有miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)后用TPM（transcript per million）進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理[14-16]（TPM＝reads（sRNA）/total reads×106）。

1.6數(shù)據(jù)分析利用DESeq R軟件（版本:1.8.3）對2個(gè)比較組合之間的（2個(gè)生物學(xué)重復(fù)為一組）的miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析,Benjamini-Hochberg法校驗(yàn)P值。采用One-way ANOVA（Tukey's multiple comparison test）對各年齡段間miRNA數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果以x±s x方式表示,用2—△△Ct法計(jì)算miRNA相對表達(dá)水平,SPASS19.0軟件進(jìn)行顯著性分析,P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同發(fā)育階段牦牛睪丸中不同長度RNA的分布和miRNA的比例分析利用高通量測序技術(shù),獲得了不同年齡階段牦牛睪丸組織的短鏈RNA文庫。通過數(shù)據(jù)過濾后,得到21 449 421±2 655 045條（±s,胎兒期）、18 448 417±731 001條（犢牛期）及17 594 901±1 126 590條（性成熟期）待分析數(shù)據(jù)（表2）。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

miRNA一般長22 nt左右,在3′端可有1～2個(gè)堿基的長度變化。在胎兒期文庫中,在22 nt的序列所占比例多達(dá)（59.95±4.09）%,明顯高于其他長度的比例。而犢牛期和成年期庫中22 nt的序列占比分別是（11.14±1.67）%和（8.75±3.21）%（圖1）。

圖1 不同發(fā)育階段牦牛睪丸中不同長度sRNA的分布

對所有sRNA與各類RNA的比對、注釋情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),胎兒期已知miRNA占已知小RNA總數(shù)的比例（67.45±2.78）%,顯著高于犢牛期（12.15±4.16）%與性成熟期（7.45±2.08）%（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同階段牦牛睪丸中miRNA數(shù)目占sRNA總數(shù)的比例

2.2測序miRNA表達(dá)驗(yàn)證為驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,隨機(jī)選擇表達(dá)趨勢不同的6條miRNA:btamiR-375,bta-miR-493,bta-miR-370,bta-miR-320a,bta-miR-449a,bta-miR-339b。進(jìn)行qPCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示6條miRNA在qPCR和測序數(shù)據(jù)中的表達(dá)趨勢均保持一致,表明測序結(jié)果真實(shí)可靠（圖3）。

圖3 miRNA測序數(shù)據(jù)驗(yàn)證

2.3牦牛睪丸組織中miRNA堿基偏好性分析不同發(fā)育階段牦牛睪丸中不同長度的miRNA首位堿基均表現(xiàn)為明顯的U（尿嘧啶）偏好性（圖4A）。對miRNA序列各個(gè)位點(diǎn)的堿基偏好性統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),除首位外,在第5,10,18,19,20,22位也表現(xiàn)出明顯的U偏好性。在第2,7,9,12,17位表現(xiàn)出C（胞嘧啶）偏好性,在第3,8,11,13,15,16位具有A（腺嘌呤）偏好性,在第4,6,14,21位具有G（鳥嘌呤）偏好性（圖4B）。

圖4 不同長度miRNA堿基偏好性分析

2.4不同階段牦牛睪丸中新miRNA預(yù)測與結(jié)構(gòu)分析不同發(fā)育階段牦牛睪丸中預(yù)測的新miRNA數(shù)目如表3所示,共計(jì)發(fā)現(xiàn)新miRNA成熟體77個(gè),新miRNA前體共80個(gè),其中N-TE-1（N-TE-2）中發(fā)現(xiàn)成熟體及前體最少,分別為39和41個(gè),M-TE-1中發(fā)現(xiàn)成熟體及前體較最多,分別為52及47個(gè)。

表3 新miRNA成熟體及前體數(shù)量統(tǒng)計(jì)

本研究發(fā)現(xiàn)的新miRNA首位堿基偏好性與已知miRNA有很大差異:在胎兒期,18～22 nt的miRNA首位堿基具有C偏好性；在性成熟期,19～21 nt的RNA首位堿基具有U偏好性,18 nt的miRNA首位堿基具有G偏好性,22 nt的miRNA具有C偏好性（圖5）。

圖5 不同階段牦牛睪丸新miRNA首位堿基偏好性示意圖

2.5miRNA差異表達(dá)分析通過比對3個(gè)比較組合間的差異表達(dá)miRNA發(fā)現(xiàn),胎兒期與犢牛期差異表達(dá)miRNA共224個(gè),犢牛期與性成熟期差異表達(dá)miRNA共36個(gè),胎兒期與性成熟期差異表達(dá)miRNA共239個(gè)（圖6）,在3個(gè)階段間均有差異表達(dá)的miRNA共13個(gè)（表4）。

表4 在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中均顯著差異表達(dá)的miRNA

圖6 不同發(fā)育時(shí)期牦牛睪丸中顯著差異表達(dá)miRNA的數(shù)目分布

2.6靶基因的GO分析對不同發(fā)育階段牦牛睪丸樣本之間所有顯著差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行GO富集分析,從生物過程（biological process）及其子條目上富集的基因個(gè)數(shù)的分布情況進(jìn)行分析,miRNA靶基因的數(shù)目在生物學(xué)過程排在前5位的分別是:代謝過程、胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾過程、磷代謝過程、含磷化合物代謝過程及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖7）。

圖7 GO功能富集分析

根據(jù)GO分析結(jié)果,在顯著差異表達(dá)的miRNA靶基因中篩選出與減數(shù)分裂、精子發(fā)生、精細(xì)胞發(fā)育與分化及精卵識(shí)別相關(guān)的靶基因共20個(gè)（表5）。

表5 與精子的發(fā)生或功能相關(guān)的靶基因及相關(guān)的顯著差異表達(dá)的miRNA

3 討論

miRNA是一類分布于生物機(jī)體內(nèi)的小分子非編碼RNA,廣泛參與各類生物學(xué)過程,在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡和代謝等過程具有調(diào)控作用的基因中,有30%以上直接受到miRNA的調(diào)控[17-18]。miRNA在睪丸發(fā)育與精子形成過程中發(fā)揮了重要作用,已有研究對不同發(fā)育階段小鼠、哈薩克馬和豬睪丸組織的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析[10-11,19],但這些研究主要集中在胚后發(fā)育階段,對參與胚胎期睪丸發(fā)育的miRNA及其種類及功能仍然了解不足。本研究對牦牛胚胎期（4～5月）及胚后（1歲,3歲）不同發(fā)育時(shí)期睪丸中的miRNA進(jìn)行測序,并對其結(jié)構(gòu)、功能和分布的特征進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步研究miRNA在牦牛睪丸發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制及揭示精子發(fā)生過程中的分子機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。

續(xù)表5

核苷酸序列的堿基組成對其理化特征有重要影響,因此分析miRNA的堿基偏好性有助于了解其生物功能。據(jù)報(bào)道,miRNA的5′端具有明顯的U的偏好性,這種偏好性與miRNA的形成以及其對靶基因的沉默機(jī)制有關(guān),與不同時(shí)期豬睪丸miRNA鑒定分析結(jié)果一致[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn),牦牛不同階段18～22 nt的miRNA具有U的首位堿基偏好性。對新miRNA而言,發(fā)現(xiàn)胎兒期18～22 nt和性成熟期22 nt的miRNA片段首位堿基具有C偏好性,這可能是由于新miRNA的形成或?qū)Π谢虻恼{(diào)控存在未知的機(jī)制。

能量代謝是維持個(gè)體各項(xiàng)生物學(xué)過程的基礎(chǔ)條件,精子的發(fā)生與成熟同樣離不開能量代謝[22-23]。對牦牛不同發(fā)育階段miRNA的靶基因進(jìn)行GO分析,結(jié)果顯示大量顯著差異表達(dá)的miRNA靶基因與細(xì)胞代謝相關(guān),涉及到細(xì)胞各類代謝所需的酶或酶的前體,例如精母細(xì)胞、精子細(xì)胞糖代謝所主需的乳酸脫氫酶（LDH）,生精細(xì)胞與精子進(jìn)行有氧呼吸的關(guān)鍵酶琥珀酸脫氫酶[22],以及在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)方面發(fā)揮重要作用的可溶性腺苷酸環(huán)化酶（s AC）[24]等。以上結(jié)果提示在牦牛睪丸發(fā)育過程中miRNA很可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程來維持精子發(fā)生的正常進(jìn)行。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,出生后胎兒期牦牛睪丸中miRNA數(shù)目占sRNA總數(shù)的比例（67.45±2.78）%遠(yuǎn)高于胚后發(fā)育階段的1歲（12.15±4.16）%、3歲（7.45±2.08）%。據(jù)報(bào)道,牛睪丸中的精原干細(xì)胞在胎兒期（4～5月齡）時(shí)含量豐富,個(gè)體出生后逐步分化為其他細(xì)胞而使自身數(shù)目顯著減少[25]。SOHLH2是本研究發(fā)現(xiàn)的與精子發(fā)生相關(guān)的miRNA靶基因之一,據(jù)報(bào)道其在精原細(xì)胞中與SOHLH1共表達(dá),通過調(diào)控Kit啟動(dòng)子的活性來控制精原細(xì)胞的分化[26-27]。在小鼠精原細(xì)胞到精母細(xì)胞中均可檢測到SOHLH2基因的mRNA[26-27],但在精原干細(xì)胞中該基因不表達(dá)[27-28]。此外,SOHL H2還被發(fā)現(xiàn)影響精母細(xì)胞減數(shù)分裂中相關(guān)基因的表達(dá)[29-30]。除此之外支持細(xì)胞的增殖分化也主要發(fā)生在胚胎期睪丸中,本研究預(yù)測的miRNA靶基因之一ID2所編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白（ID）抑制劑家族的成員,并參與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控。有研究表明,ID2可能參與支持細(xì)胞的分化和激素調(diào)節(jié)[31]。并且,ID2是一種精子發(fā)生調(diào)節(jié)劑,若將其表達(dá)水平人為上調(diào),則會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生過程中粗線期精原細(xì)胞發(fā)育被抑制[32]。據(jù)此推測胚胎期牦牛睪丸中miRNA數(shù)量較多可能是由于miRNA在該階段睪丸精原細(xì)胞及支持細(xì)胞的增殖分化中扮演了重要的角色。

此外,GO分析表明有多個(gè)顯著差異性表達(dá)miRNA的靶基因與精子發(fā)生有關(guān)。apoE基因編碼載脂蛋白E（apoE）與精子發(fā)生有關(guān),apoE在精子所需脂質(zhì)成分的轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用,也是性激素合成的核心脂蛋白。在針對敘利亞倉鼠睪丸組織中apoE的毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),經(jīng)過藥物處理后的倉鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)膽固醇的運(yùn)輸受阻,導(dǎo)致異常的性類固醇生物合成,從而導(dǎo)致倉鼠生精缺陷[33]。SYCE3與精原細(xì)胞的減數(shù)分裂相關(guān),SCHRAMM等[34]敲除小鼠Syce3基因,發(fā)現(xiàn)SYCE3丟失后減數(shù)分裂會(huì)正常啟動(dòng),卻會(huì)停滯于分裂期,無法完成分裂,所以SYCE3對于精子的生成至關(guān)重要。由此推測,miRNA在牦牛精子生成的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要的生理作用。

本研究對胚胎階段（4～5月齡胎牛）與胎后階段（1歲、3歲）牦牛睪丸組織中的miRNA進(jìn)行高通量測序與分析,結(jié)果表明牦牛睪丸發(fā)育過程中,胎兒期的miRNA占sRNA的比例顯著高于胚后階段（犢牛期與性成熟期）；新miRNA與已知miRNA相比可能存在未知加工機(jī)制；大量顯著差異表達(dá)的miRNA靶基因與細(xì)胞代謝相關(guān),部分miRNA的靶基因與精子發(fā)生或其功能密切相關(guān)。本研究為進(jìn)一步探索miRNA對牦牛睪丸發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),并對改善牦牛的繁殖性能具有一定的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。