章麗玲，劉瀏，鄭明秋，方文凱，劉達(dá)，唐宏武

（武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢 430072）

光學(xué)傳感和分析在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要作用，在眾多體外生物檢測(cè)方法中，發(fā)光生物檢測(cè)法因其方便的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、高靈敏度和快速響應(yīng)而成為目前主要的分析工具［1～4］.傳統(tǒng)的發(fā)光探針，如有機(jī)染料［5～7］、量子點(diǎn)［8］和金銀納米簇等［9～11］，存在背景噪聲高、紫外及可見光引起的樣品光損傷、光漂白閾值低和潛在的毒性等缺點(diǎn).基于鑭系離子獨(dú)特的化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，稀土上轉(zhuǎn)換納米材料（UCNPs）具有穩(wěn)定性高［12，13］、細(xì)胞毒性低和對(duì)生物樣本幾乎沒有光損傷等優(yōu)點(diǎn)［14～17］.此外，UCNPs的單波長(zhǎng)激發(fā)和多波長(zhǎng)發(fā)射有利于多通路生物分子的測(cè)定，可以避免其它熒光的干擾，這些特性使摻雜Ln3+的UCNPs有望成為新一代發(fā)光生物探針.

在過去的幾十年中，已開發(fā)了多種基于Ln3+摻雜的UCNPs的新型高效生物分子測(cè)定技術(shù)，這些生物傳感系統(tǒng)的檢測(cè)機(jī)制主要通過發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（LRET）過程實(shí)現(xiàn)［18］.在典型的上轉(zhuǎn)換-發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移過程中，Ln3+摻雜的UCNPs受到近紅外光激發(fā)時(shí)，會(huì)以非輻射的方式將能量轉(zhuǎn)移給鄰近的光譜匹配受體（通常在10 nm或更小范圍內(nèi)），導(dǎo)致UCNPs的發(fā)光猝滅［19］.這些受體通常是可與UCNPs在峰值波長(zhǎng)處發(fā)射匹配的吸收系數(shù)大的分子或納米材料，如熒光蛋白、有機(jī)染料、量子點(diǎn)、金納米顆?；蚣{米棒、二氧化錳納米片、石墨烯和石墨烯氧化物等［20～25］.自Wang等［26］在2005年首次報(bào)道上轉(zhuǎn)換-發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移過程以來，已經(jīng)開發(fā)了許多基于UC-LRET過程檢測(cè)生物分子的方法.

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）系統(tǒng)是一種細(xì)菌用于抵抗外來遺傳物質(zhì)入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，主要由Cas和CRISPR RNA（CrRNA）組成，該系統(tǒng)中Cas蛋白可以對(duì)入侵的外源DNA進(jìn)行特異性切割，從而達(dá)到免疫效果［27］.Cas12a作為CRISPR/Cas系統(tǒng)的重要成員，通過識(shí)別PAM短序列的5′T，可以對(duì)dsDNA進(jìn)行特異性切割（順式切割）；同時(shí)，Cas12a對(duì)ssDNA的切割（反式切割）活性也得到激發(fā)［28］，利用Cas12a的這種反式切割活性可實(shí)現(xiàn)對(duì)其它核酸分子的傳感檢測(cè).本文首先在常規(guī)核UCNPs（C-UCNPs）基礎(chǔ)上合成了核/殼/殼內(nèi)殼層發(fā)光結(jié)構(gòu)UCNPs（CSS-UCNPs），可提高LERT效率（Scheme 1）.隨后，利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對(duì)ssDNA的反式切割活性，基于AuNPs比色和UCNPs發(fā)光檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了對(duì)人乳頭瘤病毒DNA（HPV16 DNA）的雙信號(hào)靈敏檢測(cè).當(dāng)目標(biāo)物HPV16 DNA不存在時(shí)，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對(duì)Linker-ssDNA不發(fā)生切割，完整的Linker ssDNA可連接DNA-1/2-AuNPs，使二者發(fā)生團(tuán)聚，溶液變?yōu)樗{(lán)紫色；當(dāng)目標(biāo)物HPV16 DNA存在時(shí)，可激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的反式切割活性，切割Linker ssDNA，此時(shí)DNA-1/2-AuNPs由于無法發(fā)生連接，保持分散狀態(tài)，溶液呈紅色，通過比色法可初步完成定性檢測(cè)；團(tuán)聚程度不同的DNA-AuNPs在527 nm吸收強(qiáng)度不同，使其對(duì)UCNPs在542 nm發(fā)射峰的猝滅效果也不同，UCNPs的發(fā)光信號(hào)發(fā)生改變，通過聚乙烯亞胺（PEI）CSS-UNCPs發(fā)光信號(hào)的變化可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量檢測(cè)，比色法與熒光法雙信號(hào)檢測(cè)的結(jié)合有效提高了對(duì)目標(biāo)分析物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性.

Scheme 1 Schematic illustration of analysis procedure for dual signal detection of HPV16 DNA by CRISPR/Cas12a biosensor based on upconversion luminescent resonance energy transfer

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

YCl3·6H2O（純度99.99%）、YbCl3·6H2O（純度99.99%）、ErCl3·6H2O（純度99.99%）、十八烯（C18H36，純度95%）、油酸（C18H34O2，純度90%）（OA）、氟化銨（NH4F）、三水合氯化金（HAuCl4·3H2O）、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、二水合檸檬酸三鈉（Na?C?H?O?·2H?O）和聚乙烯亞胺（PEI，Mw=1800）均購(gòu)自阿拉丁試劑公司；LbCas12a購(gòu)自廣東博徠斯生物科技公司；其它分析純?cè)噭┚?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用超純水電阻率為18.25 MΩ·cm.所用DNA序列購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，具體序列信息見本文支持信息表S1.

FTIR5700型傅里葉紅外光譜分析儀（FTIR，美國(guó)Thermo公司）；XPert Pro型X射線衍射儀（XRD，荷蘭帕納科公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，日本Shimadzu公司）；F-4700型熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；JEM-2100 Plus型200 kV高分辨透射電子顯微鏡和JEM-2100 F型200 kV高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM，日本JOEL公司）；Zetasizer Nano ZEN3600型動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS，日本Malvern公司）；HC-2518R型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 上轉(zhuǎn)換納米材料的合成在文獻(xiàn)［29］報(bào)道的高溫共沉淀法的基礎(chǔ)上進(jìn)行部分改進(jìn)，通過介導(dǎo)殼層外延成長(zhǎng)法合成核/殼/殼內(nèi)殼層發(fā)光的上轉(zhuǎn)換納米材料（CSS-UCNPs）.

向100 mL三頸燒瓶中加入1 mmol YCl3·6H2O、15 mL十八烯和6 mL油酸，攪拌混合后，將體系抽真空40 min；隨后，在氬氣保護(hù)下升溫至160℃，加熱40 min，白色固體完全溶解，得到淡黃色透明均相溶液；冷卻至室溫，緩慢勻速加入含有4 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的6 mL甲醇溶液，劇烈攪拌后形成白色渾濁液.隨后，加熱升溫至110℃，反應(yīng)30 min以去除體系中的甲醇，抽真空30 min以去除殘存的甲醇和水分子，在氬氣保護(hù)下快速升溫至310℃，反應(yīng)1 h后，向上述溶液加入20 mL乙醇，以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，所得白色沉淀經(jīng)體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗滌3次后，再使用正己烷/乙醇混合溶液（體積比1∶3）洗滌3次，得到核UCNPs（命名為C1-UCNPs）并分散在4 mL三氯甲烷溶液中，置于4℃冰箱中用于后續(xù)合成.

向100 mL三頸燒瓶中加入n（Y）/n（Yb）/n（Er）=0.80/0.18/0.02的0.75 mmol稀土鹽混合物、11.5 mL十八烯和4.5 mL油酸，將混合體系抽真空40 min；隨后，在氬氣保護(hù)下升溫至到160℃，加熱40 min至白色固體完全溶解，得到淡黃色透明均相溶液；冷卻至室溫，注射加入C1-UCNPs核（core），加熱至110℃，反應(yīng)30 min以去除體系中的氯仿，降至室溫后勻速緩慢加入含有3 mmol NH4F和1.8 mmol NaOH的5 mL甲醇溶液，劇烈攪拌，形成白色渾濁液.后續(xù)步驟與之前相同，最后得到核/殼UCNPs（命名為CS-UCNPs）并分散在4 mL三氯甲烷中，置于4℃冰箱中用于后續(xù)合成.

向50 mL三頸燒瓶中加入0.25 mmol YCl3·6H2O、7.5 mL十八烯和3 mL油酸，將混合體系于室溫抽真空40 min；隨后，在氬氣保護(hù)下升溫至160℃，加熱30 min至白色固體完全溶解，得到淡黃色透明均相溶液；冷卻至室溫，注射加入CS-UCNPs（core-shell），加熱至110℃，反應(yīng)30 min以去除體系中的氯仿，降至室溫后緩慢勻速加入含有1 mmol NH4F和0.63 mmol NaOH的5 mL甲醇溶液，劇烈攪拌，形成白色渾濁液.后續(xù)步驟與之前相同，最后得到核/殼/殼UCNPs（CSS-UCNPs）并分散在4 mL三氯甲烷中，置于4℃冰箱中待用.

在文獻(xiàn)［29］報(bào)道的高溫共沉淀法的基礎(chǔ)上進(jìn)行部分改進(jìn)，合成核發(fā)光UCNPs（C-UCNPs）的核層.向100 mL三頸燒瓶中加入n（Y）/n（Yb）/n（Er）=0.80/0.18/0.02的0.75 mmol稀土鹽混合物、11.5 mL十八烯和4.5 mL油酸，其它合成具體步驟與之前相同.

1.2.2 配體交換法合成PEI修飾的UCNPs采用配體交換法對(duì)C-UCNPs和CSS-UCNPs進(jìn)行PEI修飾，合成了一系列PEI-UCNPs.首先，稱取300 mg PEI置于50 mL三口燒瓶中，加入20 mL一縮二乙二醇，常溫下攪拌至溶液均相澄清，抽真空30 min后，在氬氣保護(hù)下升溫至110°C；隨后，向體系內(nèi)注射加入4 mL UCNPs，反應(yīng)45 min以除去溶液中的氯仿；升溫至240°C并攪拌反應(yīng)5 h，加入20 mL無水乙醇使沉淀析出，用無水乙醇洗滌沉淀，以13000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)此操作4次，最后超聲分散至3 mL超純水中.

1.2.3 金納米顆粒（AuNPs）和DNA功能化金納米顆粒（DNA-AuNPs）的制備參照文獻(xiàn)［30］方法并稍作改進(jìn)，采用檸檬酸還原法制備13 nm AuNPs.取1.03 mL濃度為25.4 mmol/L的HAuCl4水溶液置于100 mL燒瓶中，加入23.97 mL超純水，水浴加熱至130℃，持續(xù)沸騰15 min，隨后加入2.5 mL檸檬酸鈉（38.8 mmol/L），溶液逐漸變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱15 min后攪拌，冷卻至室溫，所得溶液避光置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

采用經(jīng)典鹽化法制備DNA-AuNPs［31］.分別取120 μL DNA 1（20 μmol/L）和120 μL DNA 2（與TCEP在室溫孵育1 h）加入到800 μL AuNPs原液中，室溫下孵育24 h后，每隔20 min緩慢加入5 μL 2 mol/L NaCl溶液至NaCl終濃度為0.2 mol/L；室溫下孵育16 h后，用10 mmol/L的T-OAC緩沖液洗滌5次以除去剩余未反應(yīng)的DNA分子，最后分散至400 μL T-OAC緩沖液中，避光置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.4 HPV16 DNA的雙信號(hào)檢測(cè)HPV16 DNA的雙信號(hào)檢測(cè)分為比色檢測(cè)和熒光檢測(cè).取0.6 mL無酶離心管分別加入2 μL LbCas12a蛋白（1 μmol/L）、3 μL CrRNA（1 μmol/L）和43.5 μL NEB CutSmart Buffer 2.1緩沖溶液，充分混勻，置于30℃搖床上振蕩孵育30 min，分別加入1 μL不同濃度的目標(biāo)雙鏈DNA與1.5 μL Linker DNA（10 μmol/L），于30℃搖床上振蕩孵育2 h，再分別加入50 μL DNA 1-AuNPs和DNA 2-AuNPs，于30℃搖床上振蕩孵育30 min后，通過肉眼進(jìn)行比色；隨后分別加入20 μL預(yù)先制備的氨基功能化的CSS-UCNPs，于30℃搖床上振蕩孵育1 h后，用配有980 nm激光器的熒光儀測(cè)量上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的表征

Fig.1 Powder XRD patterns of C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs(B)

NaYF4基質(zhì)有2種常見晶型，一種為立方相（α），另一種為六方相（β）.據(jù)文獻(xiàn)［32］報(bào)道，六方相NaYF4的晶體結(jié)構(gòu)對(duì)稱性較低，而對(duì)稱性低的晶體場(chǎng)有利于發(fā)光離子的f-f躍遷，與立方相NaYF4相比，六方相NaYF4的發(fā)光效率可提高約1個(gè)數(shù)量級(jí).因此，為了獲得高發(fā)光效率的UCNPs，首先利用高溫共沉淀法合成了2種不同結(jié)構(gòu)的六方相UCNPs（C-UCNPs和CSS-UCNPs），然后對(duì)這些UCNPs進(jìn)行了XRD測(cè)試，用于確定基質(zhì)晶型結(jié)構(gòu).從粉末晶體衍射結(jié)果（圖1）可以看出，2種UCNPs晶型譜圖的晶體衍射峰與六方相NaYF4材料（JCPDs：28-1192）標(biāo)準(zhǔn)卡片的衍射峰完全一致，表明已合成純六方相基質(zhì)的2種UCNPs.

為了分析制備的C-UCNPs和CSS-UCNPs的形貌和尺寸，進(jìn)行了TEM表征.從圖2（A）和圖3（A）～（C）可以看出，2種UCNPs均呈均勻的圓棒形.由圖3（A）可知，CSS-UCNPs的核C1-UCNPs呈圓棒形，軸向粒徑約為29.10 nm，徑向粒徑約為21.75 nm［圖3（G）和（J）］；然后通過高溫共沉淀、介導(dǎo)殼層外延成長(zhǎng)法，以C1-UCNPs為種子，在其表面生長(zhǎng)一層發(fā)光殼層，制得CS-UCNPs.如圖3（B）所示，CSUCNPs呈圓棒形，軸向粒徑約為38.91 nm，徑向粒徑約為22.85 nm［圖3（H）和（K）］.與C1-UCNPs比較可知，發(fā)光殼層主要生長(zhǎng)在軸向，在軸向約生長(zhǎng)4.9 nm；最后通過同樣的方法，以CS-UCNPs為種子，在CS-UCNPs表面生長(zhǎng)一層惰性殼層，制得CSS-UCNPs.由圖3（C）可知，CSS-UCNPs呈圓棒形，軸向粒徑約為43.26 nm，徑向粒徑約為24.28 nm［圖3（I）和（L）］.與CS-UCNPs比較可知，惰性殼層也主要生長(zhǎng)在軸向，軸向和徑向生長(zhǎng)的差異性可能跟晶體的異向生長(zhǎng)有關(guān).HRTEM［圖2（B）和圖3（D）～（F）］表明，C-UCNPs，C1-UCNPs，CS-UCNPs和CSS-UCNPs具有較清晰的晶格條紋，晶面間距約為0.52 nm，與六方相NaYF4的（100）晶面參數(shù)一致.通過HRTEM和XRD分析，進(jìn)一步證明了合成的2種UCNPs均為六方晶相.

Fig.2 TEM(A)and HRTEM(B)images,axial(C)and radial(D)particle size statistics of C-UCNPs

為了獲得材料表面分子的官能團(tuán)或化學(xué)鍵等信息，對(duì)制備的UCNPs進(jìn)行了紅外光譜（FTIR）表征，驗(yàn)證了UCNPs表面油酸分子的存在.如圖4所示，在C-UCNPs和CSS-UCNPs的紅外光譜圖中均檢測(cè)到1557和1464 cm-1處的2個(gè)鄰近吸收峰，歸屬于羧酸根離子的對(duì)稱和反對(duì)稱振動(dòng)吸收峰.綜上，確定合成了油酸包覆的UCNPs.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證C-UCNPS和CSS-UCNPS的元素組成，進(jìn)行了能譜（EDS）表征.從C-UCNPS的EDS能譜圖［圖5（A）］可知，敏化劑Yb離子和激活劑Er離子均已摻雜到NaYF4基質(zhì)中，Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb的原子百分比分別為14.36%，70.91%，12.89%，0.12%和1.72%，從C-UCNPs的mapping元素圖（圖6）可知，Na，F(xiàn)，Y，Yb和Er元素均分布在C-UCNPs上.從CSS-UCNPS的EDS能譜圖［圖5（B）］可知，敏化劑Yb離子和激活劑Er離子均已摻雜到CS-UCNPs和CSS-UCNPs中，CS-UCNPs的Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb的原子百分比分別為13.48%，74.85%，10.64%，0.10%和0.92%，CSS-UCNPs的Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb的原子百分比分別為14.85%，70.97%，12.90%，0.41%和0.87%，從圖7的mapping元素圖中可看出，Na，F(xiàn)和Y元素均分布在C1-UCNPs上［圖7（A）］，Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb元素均分布在CS-UCNPs［圖7（B）］和CSS-UCNPs［圖7（C）］上.

Fig.3 TEM(A—C)and HRTEM(D—F)images of C1-UCNPs(A,D),CS-UCNPs(B，E)and CSS-UCNPs(C,F),axial particle size statistics(G—I)and radial particle size statistics(J—L)of C1-UCNPs(G,J),CS-UCNPs(H,K)and CSS-UCNPs(I,L)

Fig.4 FTIR spectra of C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs((B)

Fig.5 EDS spectra of C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs(B)

Fig.6 EDS element mappings of C-UCNPs

Fig.7 EDS element mappings of C1-UCNPs(A),CS-UCNPs(B)and CSS-UCNPs(C)

2.2 表面修飾PEI分子的UCNPs的表征

PEI分子中含有氨基基團(tuán)，帶正電.當(dāng)UCNPs表面修飾上PEI分子后表面配體和表面電勢(shì)會(huì)發(fā)生改變，因此利用FTIR和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分別對(duì)合成的UCNPs進(jìn)行表征，以判斷UCNPs表面是否修飾了親水性的PEI配體.未修飾PEI的UCNPs檢測(cè)到1562和1461 cm-1處的2個(gè)鄰近吸收峰［圖8（A）］，歸屬于羧酸根離子的對(duì)稱和反對(duì)稱振動(dòng)吸收峰；zeta電勢(shì)圖表明未修飾PEI的UCNPs帶負(fù)電［圖8（B）］，這是因?yàn)槲葱揎桺EI分子的UCNPs表面配體是油酸分子，含有羧基，帶負(fù)電；修飾PEI分子后，在1637 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰［圖8（A）］，歸屬于氨基的彎曲振動(dòng)，zeta電勢(shì)圖表明親水UCNPs明顯帶正電［圖8（B）］.結(jié)合上述分析可知，在UCNPs表面已修飾上了PEI分子.

Fig.8 FTIR spectra(A)and DLS zeta potential(B)of UCNPs

2.3 金納米顆粒(AuNPs)和DNA功能化金納米顆粒(DNA-AuNPs)的表征

采用文獻(xiàn)［30］報(bào)道的檸檬酸鈉還原法合成AuNPs，并通過TEM和紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行表征.如圖9（A）所示，制備的AuNPs尺寸較均一，分散性良好；粒子直徑約為12.9 nm［圖9（B）］；如圖9（C）所示，AuNPs在521 nm處吸收峰強(qiáng)度最大，證明已合成了13 nm的AuNPs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

Fig.9 TEM image of AuNPs(A),particle size statistics of AuNPs(B),UV-Vis absorption spectra of AuNPs with different concentrations(C),standard curve of AuNPs absorbance and concentration(D),UV-Vis absorption spectra of AuNPs and DNA-AuNPs(E)and zeta potential diagram of AuNPs and DNA-AuNPs(F)

采用鹽化法實(shí)現(xiàn)了巰基DNA與AuNPs的共價(jià)偶聯(lián)，在AuNPs和巰基DNA偶聯(lián)過程中，DNA和AuNPs的濃度比對(duì)偶聯(lián)效率有較大影響，因此需要通過建立吸光度值（A）與AuNPs濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得AuNPs的濃度.如圖9（D）所示，將521 nm處的吸光度A對(duì)一系列已知的AuNPs濃度進(jìn)行線性擬合，得到吸光度值A(chǔ)與AuNPs濃度的線性方程：A=0.2864cAuNPs-0.0841［圖9（B）］，通過代入該方程可計(jì)算出AuNPs的濃度；隨后控制ssDNA濃度，確保AuNPs與DNA的偶聯(lián)效率.參照文獻(xiàn)［33］報(bào)道的DNA和AuNPs濃度比并對(duì)其稍做調(diào)整制備了DNA-AuNPs，當(dāng)DNA修飾在AuNPs上后，AuNPs的紫外吸收峰出現(xiàn)紅移.此外，由于DNA分子含有磷酸基團(tuán)使其帶有負(fù)電，與AuNPs共價(jià)鍵連接后，AuNPs的電勢(shì)會(huì)進(jìn)一步降低.基于這些性質(zhì)，對(duì)DNA-AuNPs進(jìn)行了紫外-可見吸收光譜及DLS電勢(shì)測(cè)試.如圖9（E）所示，與DNA偶聯(lián)后AuNPs的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，由521 nm移動(dòng)到527 nm；DLS電勢(shì)測(cè)試結(jié)果表明，與AuNPs相比，DNA-AuNPs電勢(shì)明顯變負(fù)［圖9（F）］.以上結(jié)果均與預(yù)期一致，表明制備了DNAAuNPs.

2.4 可行性分析

由圖10（A）可知，AuNPs的UV-Vis吸收光譜與UCNPs在542 nm處的發(fā)射峰有較大重疊；由圖10（B）可知，PEI-UCNPs帶正電，AuNPs帶負(fù)電，二者可通過靜電作用吸附到一起.綜上可知，當(dāng)PEI-UCNPs作為能量供體，AuNPs作為能量受體時(shí)，兩者滿足發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移條件，AuNPs可以有效猝滅PEI-UCNPs在542 nm處的綠光發(fā)射.

Fig.10 UV-Vis absorption spectra of AuNPs and luminescence spectra of UCNPs(A)and zeta potential diagram of AuNPs and UCNPs(B)

2.5 兩種發(fā)光結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換納米材料的比較

UCNPs修飾PEI配體的過程中，由于UCNPs會(huì)與環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生能量交換產(chǎn)生表面猝滅效應(yīng)而引起上轉(zhuǎn)換納米材料發(fā)光強(qiáng)度的變化，且不同結(jié)構(gòu)的UCNPs發(fā)光強(qiáng)度變化情況有所不同，為此分別測(cè)定了2種不同結(jié)構(gòu)UCNPs修飾PEI配體前后的發(fā)光光譜.由圖11可知，CSS-UCNPs的發(fā)光強(qiáng)度變化最小，說明通過惰性殼層包覆的策略可以有效避免表面猝滅效應(yīng)的產(chǎn)生，提高抗外界環(huán)境干擾的能力.

Fig.11 Luminescence spectra of PEI modified C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs(B)

實(shí)驗(yàn)中探究了不同結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換納米材料與DNA-AuNPs之間的LRET效率.從圖12（A）和（B）的TEM照片可看出，DNA-AuNPs較為均勻地分布在PEI-UCNPs上，表明在靜電作用力下，DNA-AuNPs可吸附在PEI-UCNPs周圍，進(jìn)一步證明了本方法的可行性.從圖12（C）和（D）可知，2種PEI UCNPs的猝滅效率分別為57.9%和77.5%，PEI C-UCNPs的猝滅效率較低，這是因?yàn)榘l(fā)光裸核是一個(gè)幾十納米的實(shí)心發(fā)光圓棒體，實(shí)現(xiàn)大部分猝滅實(shí)心發(fā)光體的發(fā)光難度較大，而CSS-UCNPs為幾納米的發(fā)光層，因此PEI CSS-UCNPs猝滅程度比較高.綜上分析，最終選擇了PEI CSS-UCNPs.

Fig.12 TEM images(A,B)and LRET spectra(C,D)of PEI C-UCNPs,PEI CSS-UCNPs with DNA-AuNPs

2.6 雙信號(hào)檢測(cè)和特異性驗(yàn)證

Fig.13 Photograph of colorimetric(A)and luminescence spectra(B)of this biosensor in the presence of HPV16 dsDNA(a,a),HPV16 TS DNA(b,b),HPV16 NTS DNA(c,c)and HPV18 dsDNA(d,d)

CRISPR-Cas12a（Cpf1）蛋白是RNA引導(dǎo)的酶，作為細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組成部分可結(jié)合和切割DNA.CRISPR/Cas12a蛋白的切割活性有2種激活方式：第一種是在CrRNA的作用下可以特異性靶向識(shí)別包含原型間隔序列（PAM）的目標(biāo)雙鏈DNA（dsDNA），在順式切割序列特異性的目標(biāo)dsDNA之后，Cas12a蛋白對(duì)于單鏈DNA（ssDNA）的反式切割活性也被激活，可以無差別地切割其附近的任何ss DNA；第二種是在CrRNA的作用下可以特異性靶向識(shí)別不具有PAM序列的ssDNA，激活反式切割活性，非特異性切割任何非目標(biāo)ssDNA.本實(shí)驗(yàn)選擇第一種激活方式，使用含有PAM序列的HPV16 dsDNA，激活CRISPR/Cas12a的切割活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)Linker ssDNA的切割降解，從而通過體系顏色和光學(xué)信號(hào)的雙信號(hào)改變實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè).為了驗(yàn)證這一核心觀點(diǎn)，首先使用HPV16 dsDNA，HPV18 dsDNA，HPV16 TS ssDNA和HPV16 NTS ssDNA作為檢測(cè)物，驗(yàn)證CRISPR-Cas12a反式切割Linker ss DNA的活性.從圖13（A）中的顏色變化可以看出，CrRNA可特異性識(shí)別并結(jié)合HPV16 dsDNA和HPV16 TS ssDNA，進(jìn)而激活CRISPR/Cas12a對(duì)Linker ssDNA的切割活性，這與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)兩種激活方式相對(duì)應(yīng).由于Linker ssDNA斷裂，DNA-1/2-AuNPs無法發(fā)生連接，保持分散狀態(tài)，溶液呈現(xiàn)紅色；同時(shí)，CrRNA無法識(shí)別結(jié)合HPV18 dsDNA和HPV16 NTS ssDNA，不能激活CRISPR/Cas12a的切割活性，Linker ssDNA保持完整，DNA-1/2-AuNPs穩(wěn)定連接，使得AuNPs發(fā)生團(tuán)聚，溶液變?yōu)樗{(lán)紫色.加入PEI CSS-UCNPs與上述體系混勻孵育1 h后，采集上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)，從圖13（B）可知，團(tuán)聚程度不同的DNA-AuNPs對(duì)UCNPs在542 nm處的猝滅效果不同，分散狀態(tài)的AuNPs可明顯猝滅上轉(zhuǎn)換在542 nm處的發(fā)光.另外，相較于不具有PAM序列的ssDNA，具有PAM序列的dsDNA與CRISPR/Cas12a結(jié)合后激活的DNA切割活性更高，且dsDNA的NTS鏈有助于將Cas12a復(fù)合物穩(wěn)定在最佳構(gòu)象，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)ssDNA的反式切割［28］.因此最終選擇HPV16 dsDNA作為目標(biāo)物激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Linker ssDNA的切割降解，產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)的改變實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè).

Fig.14 Schematic diagram of colorimetric detection principle(A),photograph of colorimetric detection of different concentrations of HPV16 DNA(B),luminescence spectra of different concentrations of HPV16 DNA(C)and scatter diagram of luminescence with different concentrations of HPV16 DNA(D)The inset in(D)is the working curve between the logarithm of HPV16 DNA and normalized luminescence intensity.

由上述結(jié)果可知，HPV16 dsDNA可以激活CRISPR/Cas12a的切割活性進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Linker ssDNA的切割降解，Linker ssDNA的完整性會(huì)影響DNA-AuNPs間的團(tuán)聚狀態(tài)［圖14（A）］；通過檢測(cè)不同DNA-AuNPs間團(tuán)聚狀態(tài)下的PEI CSS-UCNPs的發(fā)光信號(hào)，可建立發(fā)光信號(hào)與不同HPV 16 dsDNA濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV16 DNA的檢測(cè).對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化（圖S1和圖S2，見本文支持信息）后，選擇100 nmol/L Linker DNA，30℃，T-OAC反應(yīng)緩沖液作為連接2種DNA-AuNPs的實(shí)驗(yàn)條件；選擇NEB CutSmart Buffer 2.1反應(yīng)緩沖溶液，Cas12a∶CrRNA濃度比為1∶1.5，反應(yīng)時(shí)間2 h，反應(yīng)溫度30℃作為激活CRISPR-Cas12a系統(tǒng)切割能力的實(shí)驗(yàn)條件.在上述反應(yīng)條件下，檢測(cè)了不同濃度的HPV16 dsDNA（0，0.5，1，1.5，2，3和4 nmol/L）.本文方法分為比色和上轉(zhuǎn)換雙信號(hào)檢測(cè)，首先可以通過觀察顏色初步判斷是否存在目標(biāo)物.手機(jī)拍照后，加入PEI CSS-UCNPs混勻孵育1 h，采集上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)進(jìn)行定量檢測(cè)，進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度.從圖14（B）中的顏色變化可以看出，當(dāng)HPV16 DNA的濃度從0向4 nmol/L逐漸增加時(shí)，溶液顏色發(fā)生明顯變化，由藍(lán)紫色逐漸向紫紅色過渡，直至最后變成紅色，初步完成目標(biāo)物的定性檢測(cè).隨后，為了對(duì)HPV16 DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，繪制了以上溶液的上轉(zhuǎn)換發(fā)光譜圖［圖14（C）］，并用UCNPs 542 nm處的發(fā)光強(qiáng)度和目標(biāo)物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［圖14（D）］，對(duì)其進(jìn)行線性擬合.如圖14（E）所示，HPV16 dsDNA濃度的對(duì)數(shù)值與上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度線性相關(guān)，檢測(cè)范圍為0.5～4 nmol/L，根據(jù)檢出限的定義3σ/k（σ為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為工作曲線的斜率），可計(jì)算得出發(fā)光法的檢出限為69.8 pmol/L.

為了驗(yàn)證該雙信號(hào)檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)物HPV16 DNA片段識(shí)別的特異性，選取了分別與目標(biāo)HPV16 DNA單堿基錯(cuò)配、雙堿基錯(cuò)配、三堿基錯(cuò)配的DNA序列、HPV18 DNA和空白對(duì)照，所有DNA序列的濃度均為4 nmol/L，按照上述流程對(duì)這幾種DNA序列進(jìn)行比色和發(fā)光檢測(cè).如圖15（A）所示，HPV16 DNA和單堿基錯(cuò)配分別呈現(xiàn)紅色和暗紅色，其余DNA片段均呈現(xiàn)藍(lán)紫色，表明特異性較好，通過肉眼可明顯區(qū)分目標(biāo)DNA和單堿基錯(cuò)配的目標(biāo)DNA，可完成初步定性檢測(cè)；隨后加入U(xiǎn)CNPs后采集發(fā)光信號(hào)繪制柱狀圖，如圖15（B）所示，HPV16 DNA的上轉(zhuǎn)換發(fā)光在542 nm處的發(fā)光強(qiáng)度最低，單堿基錯(cuò)配的次之，其它DNA片段的發(fā)光強(qiáng)度均比較高.綜合上述分析可知，建立的HPV16 DNA雙信號(hào)檢測(cè)方法具有良好的特異性，并且可以實(shí)現(xiàn)單堿基錯(cuò)配檢測(cè)，提高了DNA片段的容錯(cuò)率.

Fig.15 Photographs of colorimetric detection of different DNA molecules(A)and specificity investigation toward different DNA molecules(B)a.HPV16；b.MT1；c.MT2；d.MT3；e.HPV18；f.blank.

3 結(jié)論

通過多步高溫共沉淀法合成了C-UCNPs和CSS-UCNPs，并對(duì)這些UCNPs的晶型、形貌、表面配體和發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效率進(jìn)行了表征.結(jié)果表明，制備了表面猝滅效應(yīng)低、發(fā)光共振轉(zhuǎn)移效率較高的CSS-UCNPs.隨后，制備了形貌較為均勻的DNA功能化的AuNPs（DNA-AuNPs）.將氨基修飾的CSSUCNPs與CRISPR/Cas12a-AuNPs復(fù)合系統(tǒng)結(jié)合，基于AuNPs比色和上轉(zhuǎn)換發(fā)光雙信號(hào)靈敏檢測(cè)HPV16 DNA.通過肉眼觀察不同團(tuán)聚程度AuNPs的顏色變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的初步即時(shí)檢測(cè)；又利用UCNPs發(fā)光信號(hào)的輸出，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量檢測(cè)，檢出限為69.8 pmol/L，這說明雙信號(hào)檢測(cè)有效地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性.此外，該方法不僅特異性強(qiáng)，而且還能識(shí)別單堿基錯(cuò)配的HPV16 DNA，提高了DNA片段的容錯(cuò)率.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20220412.