秦該照，唐明華，賴亞琳，袁黎明

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,昆明 650500）

構(gòu)成生命體的DNA、氨基酸、糖和蛋白質(zhì)等均具有手性，手性在自然界中無(wú)處不在［1，2］.長(zhǎng)期以來(lái)，藥學(xué)一直都是手性分離的熱點(diǎn)［3］；手性藥物的每一種對(duì)映體通常會(huì)表現(xiàn)出顯著不同的藥理、代謝、治療或毒理學(xué)作用，對(duì)于許多外消旋藥物來(lái)說(shuō)，只有一種對(duì)映體具有所需的生物活性，而另一種對(duì)映體可能顯示出不同的作用，甚至表現(xiàn)出副作用［4，5］.因此，對(duì)映體的分離具有重要研究?jī)r(jià)值，而色譜技術(shù)是一種分離對(duì)映體的有效方法.在過(guò)去的幾十年里，色譜技術(shù)［如高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和毛細(xì)管電泳（CE）］被廣泛應(yīng)用于對(duì)映體分離中［6～9］.CE（如毛細(xì)管區(qū)電泳、膠束電動(dòng)色譜和毛細(xì)管電色譜）由于其靈敏度較高、分離效率高及成本低的分離優(yōu)點(diǎn)等［10～18］，成為傳統(tǒng)色譜技術(shù)的有力替代方法.然而，由于所形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)不同，使得毛細(xì)管電泳過(guò)程中產(chǎn)生了不同電滲流，最終導(dǎo)致電泳遷移率也不同.

CE是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，其原理就是分析物在電場(chǎng)中通過(guò)產(chǎn)生不同的電滲流從而產(chǎn)生不同的遷移速度進(jìn)行的分離.如今，隨著高效液相色譜分離手性藥物的興起，CE也被作為一種色譜分離技術(shù)用于手性藥物拆分.CE的分離效率與固定相的選擇性相結(jié)合，在最佳條件下，分析物沿著填充在由電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的毛細(xì)管中的手性固定相遷移.即，由于CE能改進(jìn)峰形且電解質(zhì)消耗量低，以及手性固定相選用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，使其在手性化合物的分離分析中具有廣闊前景［19，20］.

金屬有機(jī)籠（MOCs）由多個(gè)氧化還原活性金屬陽(yáng)離子中心與配位連接的光活性配體構(gòu)成，因其特有的形狀和空腔及適當(dāng)?shù)募{米尺寸等特點(diǎn)而得到開發(fā)應(yīng)用［20，21］，為發(fā)展色譜分離技術(shù)的手性固定相奠定了基礎(chǔ).作為一種離散類超分子復(fù)合物，它們通常極易溶于有機(jī)溶劑中，并且在分子識(shí)別、分離、離子交換、氣體吸附、有機(jī)和光催化及藥物傳遞等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值［22，23］.近年來(lái)，手性MOCs研究已成為超分子化學(xué)和材料科學(xué)中最有吸引力的課題之一［24］.但是，手性MOCs作為固定相應(yīng)用于毛細(xì)管電泳中的研究鮮見報(bào)道.

本文制備了一種手性MOC［Cu12（LPA）12（H2O）12］，每個(gè)手性MOC-PA籠分子由12個(gè)配體分子和12個(gè)水分子構(gòu)成，籠分子中包含204個(gè)烷基，由它們裝飾著球形籠的整個(gè)外表面.每個(gè)MOC-PA手性籠分子內(nèi)含6個(gè)雙金屬槳輪Cu-Cu結(jié)構(gòu)，且每個(gè)Cu—Cu鍵的兩端各連有1個(gè)水分子，1個(gè)指向多面體的內(nèi)部腔，另1個(gè)與其呈180°指向相反方向.在手性MOC-PA作為一種新型的立體選擇性固定相應(yīng)用于毛細(xì)管電泳之前，該材料已經(jīng)被應(yīng)用于氣相色譜中且對(duì)手性藥物有較好的拆分效果，并且在大多數(shù)有機(jī)溶劑中都有較好的懸浮性.本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)涂覆法，將［Cu12（LPA）12（H2O）12］懸浮在無(wú)水乙醇中，然后進(jìn)行超聲，將懸浮液涂覆在已粗糙化過(guò)的石英毛細(xì)管中，通過(guò)毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分離.研究結(jié)果表明，該材料對(duì)手性藥物具有良好的拆分效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1，4，5 ，8-萘四羧二酐、乙酸、三水合硝酸銅和硫脲，分析純，上?；S；L-苯丙氨酸，分析純，山東化工廠；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和異丙醇（IPA），分析純，天津化工廠；1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻，分析純，比利時(shí)Acros Organics化工廠；硝基苯酚，分析純，上海Aladdin化工廠；生物緩沖劑三羥基氨基甲烷（Tris），分析純，北京化工廠.

所有手性藥物的分離均在CL 1020+CL 101型高效毛細(xì)管電泳儀（CE）上進(jìn)行，配備的紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為190～700 nm，北京華陽(yáng)利民儀器有限公司；D8 Advance型X粉末衍射儀（PXRD），德國(guó)Bruker公司；Spectrum100型傅里葉變換紅外光譜儀（FIIR），美國(guó)PerkinElmer公司；AV ANCEⅢHD400型核磁共振波譜儀（NMR），德國(guó)Bruker公司；Noav NanoSEM450型掃描電子顯微鏡（SEM），美國(guó)FEI公司；SDT650型熱重分析儀（TGA），上海云譜儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 配體H2LPA的合成參照文獻(xiàn)［25］方法合成配體H2LPA，步驟如Scheme 1所示，將3.0 g（11.2 mmol）1，4，5，8-萘四羧二酐和4.797 g（23.5 mmol）L-苯丙氨酸充分溶解在80 mL乙酸中，所得混合溶液在120℃下回流36 h，反應(yīng)結(jié)束后，加入200 mL超純水，得到棕色沉淀，過(guò)濾，用一定量的超純水洗滌濾餅，于80℃下真空干燥，得到淡黃色固體H2LPA.

Scheme 1 Synthesis step of ligand H2LPA

1.2.2 手性金屬有機(jī)籠MOC-PA的合成如Scheme 2所示，采取一鍋合成法，將28.1 mg配體H2LPA（0.05 mmol）和12.1 mg三水合硝酸銅分別溶于2 mL DMF和1 mL IPA中，再將它們混合在高壓反應(yīng)釜中，密閉條件下加熱至90℃，反應(yīng)48 h，然后冷卻至室溫，依次用乙醇和高純水洗滌3次，于85℃真空干燥箱中干燥，得到綠色MOC-PA晶體.

Scheme 2 Synthesis step of chiral MOC-PA

1.2.3 手性金屬有機(jī)籠MOC-PA毛細(xì)管色譜柱的制備石英毛細(xì)管柱的粗糙化處理：首先用1 mol/L氫氧化鈉沖洗石英毛血管柱1.5 h，再用高純水沖洗至中性，而后用1 mol/L的鹽酸沖洗1.5 h，再用高純水沖至中性，最后用氮?dú)鈱⒚?xì)管柱于120℃下吹干，備用.

稱取一定量研磨后的MOC-PA固體懸浮在無(wú)水乙醇中，濃度為3 mg/mL，超聲10～20 min.將懸浮液用氮?dú)饩徛卮等氪植诨蟮拿?xì)管柱中，待充滿整個(gè)毛細(xì)管柱后，再將氮?dú)獾臍饬髡{(diào)小，持續(xù)吹3 h，直至溶液吹干并繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行老化，以2℃/min的升溫速度在GC中程序升溫至120℃，保持120 min.

1.2.4 毛細(xì)管色譜柱的實(shí)驗(yàn)條件采用Tris-H3PO4緩沖體系，電滲流標(biāo)記物為硫脲.截取一段手性MOC-PA開管毛細(xì)管色譜柱（60 cm×75 μm），在距末端10 cm處開窗，色譜柱的有效分離長(zhǎng)度為50 cm.初次使用該色譜柱前，用高純水、緩沖溶液依次沖洗毛細(xì)管色譜柱直至基線穩(wěn)定.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm，進(jìn)樣時(shí)間為5～6 s.

2 結(jié)果與討論

2.1 手性MOC-PA晶體的表征

2.1.1 X射線粉末衍射和紅外光譜采用X射線粉末衍射儀對(duì)手性MOC-PA進(jìn)行了表征，探究其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示.其在2θ=5°～10°處的特征衍射峰與文獻(xiàn)［25］報(bào)道基本一致，表明已合成手性MOC-PA.

為了進(jìn)一步證明已合成手性MOC-PA，對(duì)其進(jìn)行了紅外光譜表征，選用KBr壓片法分別對(duì)H2LPA和手性MOC-PA進(jìn)行測(cè)試.如圖2所示，配體H2LPA在766和691 cm-1處的強(qiáng)峰表明有苯上的C—H鍵的彎曲振動(dòng)；1582和1445 cm-1處的強(qiáng)峰與苯的骨架振動(dòng)相對(duì)應(yīng)；1716和1662 cm-1處的峰分別是由叔酰胺和羧酸的C=O鍵伸縮振動(dòng)引起.在手性MOC-PA的譜圖中，H2LPA配體中C=O鍵對(duì)應(yīng)的峰分別移至1654，1407和1335 cm-1，這可能是由于形成的雙金屬槳輪Cu—Cu鍵與水分子的相互作用.該結(jié)果與文獻(xiàn)［26］報(bào)道基本一致.

Fig.1 XRD patterns of chiral MOC-PA crystal powder(a)and the reported one(b)

Fig.2 IR spectra of H2LPA(a)and chiral MOC-PA(b)

2.1.2 熱重分析進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)試時(shí)，毛細(xì)管色譜柱內(nèi)部?jī)啥藭?huì)有高達(dá)幾千伏甚至幾萬(wàn)伏的電壓，電流通過(guò)管壁時(shí)會(huì)與緩沖溶液產(chǎn)生大量的焦耳熱.因此，毛細(xì)管電泳的手性固定相必須要有一定的熱穩(wěn)定性.為了考察手性MOC-PA的熱穩(wěn)定性，對(duì)其進(jìn)行了熱重分析.以10℃/min的速率將MOC-PA材料從25℃升溫到800℃，從其熱重曲線圖（圖3）可以看出，手性材料MOC-PA在350℃以前具有一定的熱穩(wěn)定性，從約350℃開始失重，并在450℃時(shí)達(dá)到最大分解，因此在色譜柱中產(chǎn)生的焦耳熱對(duì)其沒(méi)有太大的影響.

Fig.4 SEM image of chiral MOC-PA

2.1.3 SEM表征 圖4為MOC-PA的SEM照片，可見該材料由片狀四邊形結(jié)構(gòu)堆疊而成，納米片厚度約為20 nm，長(zhǎng)為50～700 nm，寬為60～800 nm.

Fig.5 SEM images of capillary column uncoated(A)and coated(B)chiral MOC-PA

手性MOC-PA固定相是否均勻地涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一，因此，對(duì)涂覆好的毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行了SEM分析，并與未涂覆的毛細(xì)管柱進(jìn)行對(duì)比.由圖5可見，內(nèi)壁涂覆了一層均勻的手性MOC-PA材料的涂覆柱的毛細(xì)管內(nèi)壁不光滑，而未涂覆的毛細(xì)管柱內(nèi)壁則較光滑.

2.2 手性MOC-PA色譜柱的電滲流

為了測(cè)試手性MOC-PA色譜柱的手性識(shí)別能力，對(duì)其進(jìn)行了性能探究.首先采用緩沖體系為pH=7.5，濃度為100 mmol/L的流動(dòng)相探究了電壓與產(chǎn)生的電流之間的關(guān)系，將電壓由6 kV逐步增加到22 kV，以得到的電壓和電流繪制線性圖，發(fā)現(xiàn)二者呈線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算R=0.999，說(shuō)明產(chǎn)生的電流隨著電壓的增加而增大.

另外，對(duì)于毛細(xì)管電泳，除了考察電壓與電流的關(guān)系，其手性識(shí)別能力與產(chǎn)生的電滲流也有重要關(guān)系.電滲流的大小與手性固定相是否涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁密切相關(guān)，因此需要測(cè)試未涂覆毛細(xì)管柱與已涂覆的毛細(xì)管在不同的pH值下所產(chǎn)生電滲流的大小.選用硫脲作為電滲流標(biāo)記物，如圖6所示，在pH=3.5～8.5范圍內(nèi)，分別多次測(cè)量空柱與涂覆柱的電滲流，并在曲線中添加相應(yīng)的誤差棒.圖中未涂覆柱產(chǎn)生的電滲流略大于涂覆柱，是因?yàn)楣枇u基的解離程度不同，未涂覆的毛細(xì)管柱由于內(nèi)壁沒(méi)有涂覆物，導(dǎo)致硅羥基解離程度大于涂覆柱，產(chǎn)生的電滲流大于涂覆柱產(chǎn)生的電滲流，表明手性MOC-PA已涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁.

Fig.6 Variation of column electroosmotic flow of chiral MOC-PA chiral column with pH(A)and error bar(B)

2.3 手性MOC-PA色譜柱對(duì)位置異構(gòu)體的拆分

首先通過(guò)拆分位置異構(gòu)體對(duì)手性MOC-PA色譜柱進(jìn)行性能測(cè)試.以電壓為15 kV，pH=7.5，100 mmol/L的Tris-H3PO4緩沖液作為拆分條件，成功拆分了硝基苯酚，說(shuō)明該手性固定相與硝基苯酚存在相互作用，由于硝基苯酚的分子結(jié)構(gòu)和大小不同，導(dǎo)致與固定相接觸產(chǎn)生的作用力不同，最終使得硝基苯酚達(dá)到基線分離.由表1可知，硝基苯酚得到不同程度的分離，硝基苯酚間位和對(duì)位的分離度為2.65，間位和鄰位的分離度為9.03，說(shuō)明手性MOC-PA色譜柱具備良好的分離性能.

Table 1 Resolution of enantiomers on chiral MOC-PA column

2.4 手性MOC-PA色譜柱對(duì)手性藥物的拆分

以100 mmol/L Tris-H3PO4緩沖溶液作為流動(dòng)相，4種手性藥物1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻在手性MOC-PA色譜柱上得到了一定程度的分離，表明該材料具有良好的手性識(shí)別能力.實(shí)驗(yàn)中手性MOC-PA作為手性固定相，它是一種具有四面體結(jié)構(gòu)的有機(jī)籠狀多孔材料，每個(gè)有機(jī)籠分子都有手性.電泳分離時(shí)，手性藥物與有機(jī)籠分子之間可能存在立體構(gòu)型匹配作用、偶極-偶極作用、π-π鍵和氫鍵等作用，當(dāng)手性藥物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管色譜柱內(nèi)壁時(shí)，在諸多作用下手性藥物得到了一定程度的分離.然而，由于手性藥物分離的過(guò)程是一個(gè)十分復(fù)雜的問(wèn)題，很難完全闡明手性分離的機(jī)理.表2列出了4種手性藥物的遷移時(shí)間（tR）、理論塔板數(shù)（N）、分離因子（α）和分離度（Rs）.4種手性藥物的分離條件為15 kV，100 mmol/L，pH=7.5，拆分譜圖如圖7所示.

Table 2 Resolution of chiral drugs on chiral MOC-PA column

Fig.7 Separation spectrograms of chiral drugs on chiral MOC-PA column（A）1，2-Diphenylethylene glycol；（B）Zopiclone；（C）4-methyldiphenylmethanol；（D）Anise.

2.4.1 分離電壓對(duì)手性藥物的拆分影響選用濃度為100 mmol/L，pH=7.5的Tris-H3PO4緩沖體系，通過(guò)改變分離電壓分別探究了分離1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物的最佳電壓值，結(jié)果如表3所示.

Table 3 Resolution of chiral compounds at different separation voltages

由表3數(shù)據(jù)可知，1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物的最佳分離電壓均為15 kV.由于工作電壓的增加，手性色譜柱內(nèi)的電滲流也隨之增大.當(dāng)電壓從13 kV增加到15 kV，1，2-二苯基乙二醇的分離度從1.35增加至1.39，佐匹克隆的分離度從3.20增加至4.92，4-甲基二苯基甲醇的分離度從1.74增加至1.83，茴香偶姻的分離度從2.00增加至2.10，可見分離度隨著電壓的增加而增大.隨著電壓由15 kV增加到17 kV時(shí)，1，2-二苯基乙二醇的分離度從1.39降至1.14，佐匹克隆的分離度從4.92降至3.57，4-甲基二苯基甲醇的分離度從1.83降至1.78，茴香偶姻的分離度也從2.10降至1.52.從出峰時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)看，分離電壓不僅影響手性藥物的分離效率和分離度的大小，而且影響出峰時(shí)間，電壓越大，出峰時(shí)間越短，表明電壓對(duì)毛細(xì)管電泳的分離效果具有重要影響.

2.4.2 緩沖溶液濃度對(duì)手性藥物的拆分影響為了探究緩沖溶液的濃度對(duì)手性藥物的拆分影響，選用pH=7.5，電壓為15 kV和不同濃度的Tris-H3PO4緩沖溶液體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

如表4所示，緩沖溶液濃度不同時(shí)，對(duì)手性藥物的分離度也不同.當(dāng)濃度為50 mmol/L時(shí)，茴香偶姻沒(méi)有得到分離；當(dāng)濃度從50 mmol/L升高到100 mmol/L時(shí)，1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分離度隨之增加.但將緩沖溶液濃度從100 mmol/L升高到150 mmol/L時(shí)，分離的手性物拆分效果卻有所降低.由此得出100 mmol/L是分離4種手性藥物的最佳緩沖液濃度，其分離度分別為1.39，4.92，1.83和2.10.從出峰時(shí)間來(lái)看，濃度越高，出峰時(shí)間變得越長(zhǎng).緩沖溶液黏度會(huì)隨著濃度的增加而增大，導(dǎo)致電滲流減小，分離度和分離因子得以提高.但濃度過(guò)高時(shí)，反而會(huì)降低手性藥物的分離度和分離因子.

Table 4 Resolution of chiral drugs in different buffer solutions

2.4.3 緩沖溶液pH值對(duì)手性藥物拆分的影響緩沖溶液pH值對(duì)毛細(xì)管的表面特性影響較大，在pH=4～6時(shí)，Si—OH基團(tuán)的電離非常敏感，也影響毛細(xì)管中電滲流的大小.pH值越高，Si—OH基團(tuán)的電離度越大，甚至趨于飽和，電滲流也隨之變大；pH值降低時(shí)，電離受到抑制，電滲流也會(huì)降低，甚至趨近于零.由此可知，pH值影響著電滲流和出峰時(shí)間，出峰時(shí)間隨著pH值的升高而減小，不同pH值對(duì)手性藥物的拆分程度也不同.在濃度為100 mmol/L，電壓為15 kV的不同pH值的Tris-H3PO4緩沖體系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，篩選最佳的溶液pH值.圖8為4種手性藥物在不同pH值下的拆分譜圖.可見，當(dāng)pH值從6.5增至8.5時(shí)，佐匹克隆的分離度降低；當(dāng)pH值從6.5增至7.5時(shí)，1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分離度都增大；再將pH值增至8.5時(shí)，茴香偶姻的分離度降低，1，2-二苯基乙二醇和4-甲基二苯基甲醇無(wú)法被拆分.結(jié)果表明，在pH=6.5時(shí)，佐匹克隆的分離度最高；在pH=7.5時(shí)，1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分離度最高.

Fig.8 Electrochromatograms of chiral compounds at different pH values on chiral MOC-PA column（A）1，2-Diphenylethylene glycol；（B）Zopiclone；（C）4-methyldiphenylmethanol；（D）Anise.

2.5 手性MOC-PA毛細(xì)管色譜柱的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

以佐匹克隆為測(cè)試物，選用電壓為15 kV，pH=6.5的100 mmol/L的緩沖溶液，考察了手性MOC-PA毛細(xì)管柱的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性.結(jié)果表明，連續(xù)5次進(jìn)樣，佐匹克隆保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.3%.分別制備了3根毛細(xì)管柱R1，R2和R3，在同樣的色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算出其保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.4%.以上結(jié)果說(shuō)明手性MOC-PA柱有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

采用一鍋法分別合成了配體H2LPA和手性MOC-PA，利用手性MOC-PA制備了手性毛細(xì)管電泳柱，考察了其對(duì)手性藥物的拆分能力.結(jié)果表明，該柱對(duì)1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物和位置異構(gòu)體硝基苯酚具有一定的拆分能力.通過(guò)探索1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物的最佳分離條件，得出1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的最佳分離條件為15 kV，100 mmol/L，pH=7.5；佐匹克隆最佳分離條件為15 kV，100 mmol/L，pH=6.5.它們的分離度（Rs）分別為1.39，11.82，1.83和2.10.綜上所述，手性MOC-PA是一種極具潛力的毛細(xì)管電泳手性固定相，在手性分離領(lǐng)域有較好的發(fā)展前景.