周?，B，杜佳鑫，杜向標(biāo)，白巖

（1.浙江省龍泉市城區(qū)林業(yè)工作站，浙江 龍泉 323700；2.浙江省龍泉市劍池街道辦事處，浙江 龍泉 323700；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 食品與健康學(xué)院，浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

白術(shù)Atractylodes macrocephala屬菊科Compositae 蒼術(shù)屬Atractylodes多年生草本植物[1]，以根莖入藥，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等。現(xiàn)代研究表明，白術(shù)含有蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇、白術(shù)內(nèi)酯等主要成分[2]，具有調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老、抗炎、抑菌、擴(kuò)張血管、降血糖等藥理作用[5]。其中，產(chǎn)于浙江臨安於潛的白術(shù)被稱為於術(shù)A.macrocephala‘Yuzhu’，亦名于術(shù)，品質(zhì)優(yōu)異，藥效顯著，為道地藥材。

重金屬Cd 直接影響植物的生理生化和生長(zhǎng)發(fā)育，具有明顯的劑量效應(yīng)。當(dāng)Cd2+超過(guò)一定濃度后，對(duì)葉綠素有破壞作用，并促進(jìn)抗壞血酸分解，使游離脯氨酸積累，抑制硝酸還原酶活性[6]。進(jìn)入植物體的Cd2+常會(huì)改變細(xì)胞膜透性[7]，對(duì)葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等亞顯微結(jié)構(gòu)都有一定程度的破壞作用[8]，并且競(jìng)爭(zhēng)性地取代某些酶活性中心的金屬元素而影響酶的正?；钚?，從而引起植物光合作用、呼吸作用、氮素代謝、核酸代謝等一系列生理過(guò)程的紊亂[9]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)重金屬如何危害蔬菜糧食作物的研究較多，有關(guān)重金屬Cd 如何影響中草藥的研究很少，因而本研究可以豐富Cd2+脅迫中草藥的相關(guān)研究?jī)?nèi)容。臨安地處江南，酸雨較多，促進(jìn)當(dāng)?shù)丶t壤中的Cd2+釋放；同時(shí)，於術(shù)以種子進(jìn)行繁殖，并且沒有休眠習(xí)性，發(fā)芽較容易，因而容易受到土壤和水體中的Cd2+污染，影響其發(fā)芽和生理指標(biāo)，進(jìn)而影響其藥材的品質(zhì)和質(zhì)量。本研究設(shè)置Cd2+不同濃度梯度，考察其對(duì)於術(shù)種子萌發(fā)及其生理指標(biāo)的影響，以期為於術(shù)安全生產(chǎn)以及藥材質(zhì)量安全控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本研究所用於術(shù)種子來(lái)源于浙江臨安童家村於術(shù)種植基地。試驗(yàn)所用材料CdCl2、KNO3、NaNO2、Na2HPO4·12H2O、對(duì)羥基苯磺酸、冰乙酸、鹽酸、H2O2、三氯乙酸、無(wú)水醋酸鈉、蒽酮、考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白、葡萄糖、0.4% TTC、鄰甲氧基苯酚、乙酸乙酯、濃H2SO4、保險(xiǎn)粉、無(wú)水乙醇、甲萘胺均購(gòu)自浙江華東醫(yī)藥有限公司，除甲萘胺為化學(xué)純，其余均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用儀器有紫外分光光計(jì)（上海恒平752 型）、電子天平（北京賽多利斯XPR204S/AC 型）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅DHG-9053A 型）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（黃石恒豐SKP-02B 型）、臺(tái)式低速離心機(jī)（瑞沃德M-F24 型）、電子恒溫水浴鍋（北京光明HH-8 型）、游標(biāo)卡尺（霍夫曼TESA-CALIP67）。

1.2 試驗(yàn)方法

用去離子水將CdCl2配制成100 mg·L-1的母液，然后依次稀釋成0.1、1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0 mg·L-1（以Cd2+計(jì)）溶液。將大小均勻一致、籽粒飽滿、無(wú)病蟲害的於術(shù)種子消毒后，等量分成8 份，其中7 份種子分別用配置好的7 種濃度Cd2+溶液浸種（加試液用量約為種子量的3 倍），1 份以清水浸種（0 mg·L-1）為對(duì)照，共計(jì)8 個(gè)處理。浸種10 h 后，在培養(yǎng)皿內(nèi)放兩層濾紙，用相應(yīng)濃度的Cd2+溶液充分潤(rùn)濕，將種子平鋪于濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿放置50 粒於術(shù)種子，加蓋后，室溫下催芽并每天向培養(yǎng)皿中加入相應(yīng)濃度的溶液，使濾紙保持濕潤(rùn)。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)培養(yǎng)皿，即3 次重復(fù)，取平均值作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

浸種后催芽3 d，當(dāng)於術(shù)種子種胚突破種皮時(shí)調(diào)查發(fā)芽勢(shì)，以萌動(dòng)種子數(shù)量占處理種子總數(shù)量的百分率表示。浸種6 d 后，當(dāng)胚根與種子等長(zhǎng)或胚芽長(zhǎng)到種子長(zhǎng)度的一半時(shí)，調(diào)查發(fā)芽率，以發(fā)芽種子占處理種子的百分率表示。出芽3～ 5 d 時(shí)，隨機(jī)取出已發(fā)芽於術(shù)種子50 粒，測(cè)量根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。采用TTC 比色法、磺胺比色法、蒽酮比色法、考馬斯亮藍(lán)G250法分別測(cè)定根的活力、硝酸還原酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量[8]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 22.0 和Origin 軟件進(jìn)行方差分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd 2+濃度對(duì)於術(shù)種子萌發(fā)的影響

Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子萌發(fā)的影響見圖1。由圖1 可知，於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。對(duì)照於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為55.12%和65.01%。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率隨之升高。當(dāng)Cd2+濃度為10.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均升至最大值，分別為66.91%和77.53%，分別比對(duì)照提高了20.12%和19.27%。當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增大時(shí)，於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率隨之下降，當(dāng)Cd2+濃度增大至100.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率降至最低，分別為41.81%和49.19%，分別比對(duì)照降低了24.14%和24.33%，抑制效果顯著。

圖1 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子萌發(fā)的影響Figure 1 Effect of different concentration of Cd2+ on seed germination of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.2 Cd 2+濃度對(duì)於術(shù)種子芽長(zhǎng)和幼根的影響

Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子芽長(zhǎng)和幼根的影響見圖2。由圖可知，於術(shù)種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)均隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。對(duì)照於術(shù)種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)分別為0.75 cm 和3.25 cm。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術(shù)種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)隨之升高，當(dāng)Cd2+濃度為10.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)升至最大值，分別為1.35 cm 和4.66 cm，分別比對(duì)照提高了79.73%和35.44%。當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增大時(shí)，於術(shù)種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)隨之下降，當(dāng)Cd2+濃度增大至100.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)降至最低值，分別為0.52 cm 和2.48 cm，分別比對(duì)照降低了31.08%和23.42%，與各處理均差異顯著（P＜0.05）。

圖2 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)的影響Figure 2 Effect of different concentration of Cd2+ on length of bud and root of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.3 Cd 2+濃度對(duì)於術(shù)種子根系活力的影響

Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子根系活力的影響見圖3。由圖3 可知，於術(shù)種子的根系活力隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。對(duì)照於術(shù)的根系活力為36.01 μg·根-1·h-1。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術(shù)種子的根系活力隨之升高，當(dāng)Cd2+濃度為10.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的根系活力最強(qiáng)，為84.62 μg·根-1·h-1，比對(duì)照提高了2.35倍。當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增大時(shí)，於術(shù)種子的根系活力開始下降。當(dāng)Cd2+濃度增大至100.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)的根系活力降至最低值，為28.41 μg·根-1·h-1，比對(duì)照下降了21.14%。

圖3 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子根系活力的影響Figure 3 Effect of different concentration of Cd2+ on root activity of A.macrocephala cv.Yuzhu

2.4 Cd 2+濃度對(duì)於術(shù)種子硝酸還原酶含量、可溶性總糖含量、可溶性蛋白含量的影響

2.4.1 對(duì)硝酸還原酶含量的影響 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子硝酸還原酶含量的影響見圖4。由圖4 可知，於術(shù)種子的硝酸還原酶含量隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。對(duì)照於術(shù)種子的硝酸還原酶含量為1.48 μg·g-1·h-1。此后，隨著Cd2+濃度的增加，於術(shù)種子的硝酸還原酶含量也隨之升高，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到10.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的硝酸還原酶含量達(dá)到最大值，為3.12 μg·g-1·h-1，比對(duì)照提高了2.11 倍，與對(duì)照和其他處理間均差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增大時(shí)，於術(shù)種子的硝酸還原酶含量開始下降。當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到100.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的硝酸還原酶含量達(dá)到最小值，為1.21 μg·g-1·h-1，比對(duì)照下降了17.92%。

圖4 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子硝酸還原酶的影響Figure 4 Effect of different concentration of Cd2+ on nitrate reductase of A.macrocephala ‘Yuzhu’ seed

2.4.2 對(duì)可溶性糖含量的影響 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子可溶性糖含量的影響見圖5。由圖5 可知，於術(shù)種子中的可溶性糖含量隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。對(duì)照於術(shù)種子的可溶性糖含量為11.82 μg·g-1。此后，隨著Cd2+濃度的增大，於術(shù)種子的可溶性糖含量也隨之升高，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到10.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的可溶性糖含量達(dá)到最大值，為16.56 μg·g-1，比對(duì)照提高了40.09%。當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增大時(shí)，於術(shù)種子的可溶性糖含量開始下降。當(dāng)Cd2+濃度濃度達(dá)到100.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的可溶性糖含量達(dá)到最小值，為7.82 μg·g-1，比對(duì)照下降了33.89%。

圖5 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子可溶性糖含量的影響Figure 5 Effect of different concentration of Cd2+ on soluble sugar content of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.4.3 對(duì)可溶性蛋白含量的影響 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子可溶性蛋白含量的影響見圖6。由圖6 可知，於術(shù)種子的可溶性蛋白含量隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。對(duì)照於術(shù)種子的可溶性蛋白含量為16.67 μg·g-1。此后隨著Cd2+濃度的增大，於術(shù)種子的可溶性蛋白含量也隨之升高，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到10.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子的可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，為33.58 μg·g-1，比對(duì)照提高了2.01 倍。當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增大時(shí)，於術(shù)種子的可溶性蛋白含量開始下降。當(dāng)濃度達(dá)到100.0 mg·L-1時(shí)，於術(shù)種子可溶性蛋白含量降至最小值，為13.69 μg·g-1，比對(duì)照下降了17.87%。

圖6 Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子可溶性蛋白含量的影響Figure 6 Effect of different concentration of Cd2+ on soluble protein content of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.5 Cd 2+濃度對(duì)於術(shù)種子影響的相關(guān)性分析

Cd2+濃度與於術(shù)種子萌發(fā)及生化指標(biāo)的相關(guān)性如表1。由表1 可知，Cd2+濃度與所有於術(shù)種子發(fā)芽和生長(zhǎng)指標(biāo)之間均存在負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在-0.873 78～ -0.447 61 之間；發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、幼根長(zhǎng)、根系活力、硝酸還原酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量之間均為正相關(guān)，其中根長(zhǎng)和發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、可溶性糖含量之間呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)，與芽長(zhǎng)顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表1 Cd2+濃度與於術(shù)種子萌發(fā)及各生理指標(biāo)的相關(guān)性Table 1 Correlation analysis of Cd2+ concentration with seed germination and physiological traits of A.macrocephala ‘Yuzhu’

3 討論與結(jié)論

Cd 是一種生物非必需的重金屬元素，由于具有高毒性且在水體中較為穩(wěn)定，是主要的重金屬污染物之一。本研究結(jié)果表明Cd2+對(duì)於術(shù)種子萌發(fā)及其生理指標(biāo)的影響具有明顯的劑量效應(yīng)，即低濃度Cd2+（≤10.0 mg·L-1，下同）對(duì)於術(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)、芽和幼根長(zhǎng)度、根活力、硝酸還原酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量具有一定的促進(jìn)作用，而高濃度Cd2+（20～100 mg·L-1）則對(duì)其具有較為顯著的抑制作用。這與白嵩[10]以水稻Oryza sativa、張玲[11]和江虎生[12]等以小麥Triticum aestivum、付世景[13]以板藍(lán)根Isatis tinctoria為試驗(yàn)材料的研究結(jié)果基本一致，均表現(xiàn)出了“低促高抑”的規(guī)律。

硝酸還原酶[14-15]是一種氧化還原酶，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜外，在硝酸鹽還原途徑中是限速因子，可通過(guò)NADH 和NADPH 其中之一或兩者(雙功能) 提供兩個(gè)電子催化反應(yīng)，催化硝酸離子還原成亞硝酸離子的反應(yīng)，植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要生理生化指標(biāo)?？扇苄蕴荹15-16]主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等，是參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)，也在遭遇到逆境脅迫時(shí)起到滲透調(diào)節(jié)作用，并在維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面起到重要作用。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，是一個(gè)重要的生理生化指標(biāo)，可以指征植物體總代謝水平和活躍度。皮爾森（Pearson）分析結(jié)果說(shuō)明，隨著Cd2+濃度的增加，以上幾個(gè)生長(zhǎng)和代謝指標(biāo)受到的抑制均越來(lái)越顯著，同時(shí)和於術(shù)種子的發(fā)芽能力呈高度正相關(guān)。

Cd 作為環(huán)境污染中最為危險(xiǎn)的因子之一，常常存在于水體、土壤或肥料中，通過(guò)進(jìn)入植物體內(nèi)并不斷積累，尤其是富集魚根部較多，可以進(jìn)一步引發(fā)人類的多種疾病。但是應(yīng)該注意的是，盡管多項(xiàng)研究顯示低濃度Cd2+可以提升多種植物種子的發(fā)芽狀況和早期生長(zhǎng)指標(biāo)，但是伴隨植物的生長(zhǎng)及富集，植物就會(huì)出現(xiàn)各種毒害的癥狀，從而影響正常額生長(zhǎng)發(fā)育，并將影響產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)成為有毒的農(nóng)產(chǎn)品及原藥材。

本研究結(jié)果揭示了Cd2+濃度對(duì)於術(shù)種子的發(fā)芽影響具有“低促高抑”的規(guī)律，探討種子萌發(fā)期間對(duì)Cd2+濃度的反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)可為於術(shù)安全生產(chǎn)以及於術(shù)藥材質(zhì)量安全控制提供科學(xué)依據(jù)。相關(guān)Cd2+濃度影響於術(shù)的根莖膨大及品質(zhì)形成的研究，將在下一步研究中揭示，并為於術(shù)藥材質(zhì)量安全控制提供參考。