徐艷梅，韓彬，郝麗娟，高燕霞

(河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011)

基因毒性雜質(zhì)又稱遺傳毒性雜質(zhì)，是指能夠?qū)NA產(chǎn)生直接或間接損害的化合物，而這種損害可能導(dǎo)致癌癥或基因突變[1-3]。即便是痕量基因毒性雜質(zhì)，也能夠嚴(yán)重危害人類健康，從而造成不可逆損傷[4]。因此，為保證用藥安全，嚴(yán)格控制藥品中基因毒性雜質(zhì)已成為重中之重。

藥物合成、生產(chǎn)及儲(chǔ)存過(guò)程中，都可能產(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)，質(zhì)量控制稍有不當(dāng)，就會(huì)對(duì)臨床應(yīng)用產(chǎn)生不良后果。在眾多基因毒性雜質(zhì)中，N-亞硝胺類化合物最常見(jiàn)，也是世界公認(rèn)的強(qiáng)致癌物質(zhì)[5-6]。沙坦類藥物在合成過(guò)程中涉及硝化、烷基化等反應(yīng)，可能引入N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)(圖1)。自纈沙坦檢出N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)后，沙坦類藥物中的基因毒性雜質(zhì)就受到藥品監(jiān)管部門及公眾的高度關(guān)注，藥品生產(chǎn)企業(yè)也更加注重沙坦類藥物中基因毒性雜質(zhì)的控制。N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法有很多，如高效液相色譜(HPLC)[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[9-11]、氣相色譜(gas chromatography，GC)[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS)[13-14]等。

A.厄貝沙坦；B.N-亞硝基乙基異丙胺；C.N-亞硝基二異丙胺；D.N-亞硝基二丁胺。

隨著LC-MS/MS技術(shù)的迅速發(fā)展，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)。筆者在本研究建立同時(shí)檢測(cè)厄貝沙坦原料藥中N-亞硝基乙基異丙胺(N-nitrosoethyl isopropylamine，NEIPA)、N-亞硝基二異丙胺(N-nitroso diisopropylamine，NDIPA)和N-亞硝基二丁胺(N-nitroso dibutylamine，NDBA)的LC-MS/MS方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，適用于厄貝沙坦原料藥中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)，可為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司，配置LC-20AT二元泵)；Triple Quad 6500質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；XS105型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 厄貝沙坦原料藥(購(gòu)于河北龍海藥業(yè)有限公司，批號(hào)：S20200201，S20200202，S20200203)；NEIPA對(duì)照品(批號(hào)：XH20-2477，含量：100%)、NDBA對(duì)照品(批號(hào)：XH20-2478，含量：100%)、NDIPA對(duì)照品(批號(hào)：XH20-2479，含量：100%)購(gòu)于HIC公司；甲醇和甲酸為L(zhǎng)C-MS級(jí)(Merck公司)；水由屈臣氏提供。

2 方法與結(jié)果

2.1LC-MS條件[15-16]

2.1.1LC條件 色譜柱為Agilent 120 PFP (100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)。采用梯度洗脫：0～3 min，90%B；3～5 min，90%→2%B；5～8 min，2%B；8～10 min，2%→90%B，最后以90%B平衡3 min；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃。

2.1.2MS條件 大氣壓化學(xué)電離(atmosphere pressure chemical ionization，APCI)源，采集模式為正離子，監(jiān)測(cè)模式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣流量35 mL·min-1。質(zhì)譜檢測(cè)條件見(jiàn)表1。

表1 3種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取NEIPA、NDIPA和NDBA對(duì)照品各25 mg，置25 mL量瓶，以20%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置同一量瓶，加溶劑稀釋制成每毫升含NEIPA、NDIPA和NDBA均為100 ng的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的配制 稱取厄貝沙坦原料藥100 mg，置10 mL量瓶，加甲醇2 mL振搖使溶解，水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3專屬性考察 取空白溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。在該色譜條件下，NEIPA、NDIPA和NDBA保留時(shí)間分別為4.95，6.31，8.90 min，各峰之間分離度符合檢測(cè)要求，并相互不影響測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2。

A.空白溶劑；B.供試品溶液；C.混合對(duì)照品溶液。

2.4檢出限及定量限考察 精密量取混合對(duì)照品溶液，加溶劑逐級(jí)稀釋成不同濃度溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比(S/N)=3為檢出限，以S/N=10為定量限。結(jié)果顯示，NEIPA、NDIPA和NDBA檢出限分別為0.033 7，0.023 4和0.061 1 ng·mL-1，定量限分別為0.201 3，0.070 1和0.101 4 ng·mL-1。

2.5線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液0.02，0.1，0.2，0.5，1，5，10 mL，分別置10 mL量瓶，加溶劑稀釋至刻度，作為線性溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NEIPA、NDIPA和NDBA在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 3種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣分析6次，記錄色譜圖。經(jīng)計(jì)算，NEIPA、NDIPA和NDBA的RSD分別為1.3%，1.4%，2.0%，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)配制供試品溶液，平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性考察 取供試品溶液和對(duì)照品溶液，室溫下分別放置0，1，2，3，6，12 h后，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取供試品100 mg，共9份，置10 mL量瓶，分別加甲醇2 mL振搖使溶解，分別精密加入系列對(duì)照品溶液0.8，1.0，1.2 mL各3份，溶劑定容至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。測(cè)得量與加入量比值即為回收率。結(jié)果見(jiàn)表3，經(jīng)計(jì)算得NEIPA、NDIPA和NDBA平均加樣回收率分別為95.13%，92.00%和93.96%。

表3 3種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10樣品測(cè)定 按“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液與供試品溶液配制方法制備待測(cè)液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果3批樣品(批號(hào)：S20200201，S20200202，S20200203)均未檢測(cè)到基因毒性雜質(zhì)NEIPA、NDIPA和NDBA。

3 討論

N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)濃度極低，因此為達(dá)到痕量分析測(cè)定要求，不僅需要克服靈敏度低、選擇性差的問(wèn)題，還需要排除溶劑基質(zhì)干擾大等因素影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、精密度、重復(fù)性、加樣回收率及穩(wěn)定性等進(jìn)行一系列的方法學(xué)考察，證明了所建方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠滿足痕量N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的定量檢測(cè)需求。

同時(shí)，本研究通過(guò)改變色譜分析條件，如流速、柱溫、流動(dòng)相B的初始比例等，對(duì)本方法耐用性進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，微調(diào)色譜分析條件后，3種基因毒性雜質(zhì)的峰面積基本一致，說(shuō)明3種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的測(cè)定量基本一致，表明本方法的色譜條件耐用性良好。

本研究建立的HPLC-MS/MS法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、重復(fù)性好，適用于厄貝沙坦原料藥中基因毒性雜質(zhì)NEIPA、NDIPA和NDBA同時(shí)測(cè)定，可為其質(zhì)量控制提供參考，并為臨床用藥安全提供保障。