宋園園 施偉領(lǐng) 章嘯君 楊 華 吳酬飛 肖英平*

(1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.浙江大飛龍動(dòng)物保健品有限公司，金華 321017；4.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所，金華 321017)

微生物群對(duì)宿主的健康至關(guān)重要[1]，對(duì)食物消化吸收、宿主營(yíng)養(yǎng)、腸道發(fā)育、免疫應(yīng)答、生理調(diào)節(jié)都具有顯著的影響[2-4]。腸道微生物可以幫助宿主分解難以消化吸收的成分以及保護(hù)宿主免受病原菌的入侵[5]。糞便微生物移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是指通過(guò)篩選供體、制備糞菌、科學(xué)選擇菌群移植途徑，向受體的腸道內(nèi)移植健康供體糞便的功能菌群，恢復(fù)和維持腸道菌群生態(tài)平衡[6]，是一種歷史悠久的微生物治療策略[7]。FMT技術(shù)通過(guò)移植腸道微生物，引起抗菌肽、有機(jī)酸等抗微生物物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而殺滅致病菌，達(dá)到治愈改良的效果。FMT干預(yù)改變腸道微生物組成結(jié)構(gòu)和多樣性，這種變化可調(diào)節(jié)腸道菌群的代謝產(chǎn)物，可改善腸道黏膜屏障功能；腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物均可影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育和分化，促進(jìn)免疫細(xì)胞和免疫因子等免疫物質(zhì)的生成[8]。

Yang等[9]對(duì)31例混合型便秘患者進(jìn)行為期1個(gè)月的生物反饋療法和生物反饋療法聯(lián)合FMT治療發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT聯(lián)合的治療效果更好，且患者糞便中普氏菌屬(Prevotella)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)相對(duì)豐度增加。另有外國(guó)學(xué)者研究報(bào)道，30名HIV感染者每周隨機(jī)接受糞菌膠囊8周后，患者腸道微生物多樣性明顯增加，且毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)相對(duì)豐度增加，從而調(diào)節(jié)感染者菌群失調(diào)[10]。FMT也應(yīng)用于維持動(dòng)物健康以及促進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)，隨著無(wú)抗飼料的推廣，F(xiàn)MT有望推動(dòng)畜牧行業(yè)向綠色健康養(yǎng)殖方向發(fā)展[11]。目前，F(xiàn)MT技術(shù)在豬養(yǎng)殖業(yè)方面的應(yīng)用主要是調(diào)節(jié)新生仔豬腸道菌群,優(yōu)化仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道健康水平[8]。其中在豬腸道微生物調(diào)控宿主生長(zhǎng)的代謝機(jī)理研究中，通常采用小鼠作為研究模型[12]探究跨物種腸道菌群移植對(duì)動(dòng)物腸道發(fā)育的影響。Wu等[13]將金華豬和長(zhǎng)白豬作為糞菌移植的供體，受體是經(jīng)廣譜抗生素處理過(guò)的小鼠，糞菌移植結(jié)果發(fā)現(xiàn)金華豬和長(zhǎng)白豬糞便微生物重建了小鼠空腸和結(jié)腸的腸道微生物。Yan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)FMT可以將瘦肉型長(zhǎng)白豬和脂肪型榮昌豬骨骼肌的纖維特征和脂質(zhì)代謝特征轉(zhuǎn)移到無(wú)菌小鼠身上。Diao等[15]將藏豬、約克郡豬和榮昌豬3種不同品種豬的糞便懸浮液灌胃于新生無(wú)菌小鼠，結(jié)果表明無(wú)菌小鼠重現(xiàn)了豬的表型，且表現(xiàn)出不同的腸道特征和形態(tài)。FMT群落演替是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、受遺傳控制的過(guò)程，受體腸道菌群演替的過(guò)程也是與宿主建立共生關(guān)系的過(guò)程，研究群落演替對(duì)預(yù)測(cè)FMT的效果及其對(duì)宿主健康和疾病的影響至關(guān)重要[16-17]，且對(duì)針對(duì)性的微生物群治療具有重要意義。但是目前大部分研究主要聚焦于動(dòng)物FMT后受體某1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群，對(duì)于移植過(guò)程中菌群的動(dòng)態(tài)變化依然未知，鮮見(jiàn)有關(guān)于小鼠FMT后菌群變化和規(guī)律的研究。本研究中選取金華豬和長(zhǎng)白豬2個(gè)不同代表性豬品種作為微生物的供體，其中金華豬是我國(guó)優(yōu)良豬種，生長(zhǎng)緩慢，體脂含量高，而長(zhǎng)白豬生長(zhǎng)速度快，瘦肉率高，是優(yōu)良外來(lái)品種[13]，分析金華豬和長(zhǎng)白豬FMT小鼠不同時(shí)間點(diǎn)菌群和代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)含量的演替規(guī)律，以及探析不同品種豬FMT小鼠的腸道菌群差異。通過(guò)跟蹤受體小鼠腸道菌群組成隨移植時(shí)間的演替變化，為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物腸道微生物的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為跨物種的FMT奠定理論基礎(chǔ)，也為FMT過(guò)程中受體腸道微生物結(jié)構(gòu)的演替提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬供體糞便及糞便微生物菌懸液的制備

豬供體糞便同前期的研究[18]，具體為：選取飼養(yǎng)于同一環(huán)境中的10頭金華豬和10頭長(zhǎng)白豬，每個(gè)品種公、母豬數(shù)量各占1/2，飼喂標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)玉米-大豆型飼糧，飼糧中無(wú)添加抗生素。在240日齡時(shí)收集豬的新鮮糞便，根據(jù)品種進(jìn)行等量混合，生成“代表性”糞便樣本。豬糞便微生物菌懸液的制備:取1 g糞便加入4 mL無(wú)菌生理鹽水即稀釋5倍用于制作糞便微生物接種物。

1.2 小鼠抗生素處理與糞菌移植處理

選取24只4周齡無(wú)特定病原菌(SPF)C57BL/6J小鼠(斯貝福生物技術(shù)有限公司，北京)，在無(wú)菌隔離包內(nèi)飼養(yǎng)，恒溫23 ℃，相對(duì)濕度為63%，晝夜12 h循環(huán)光照，飼糧為無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠糧，自由飲水和采食。試驗(yàn)處理同前期的研究[18]：向飲用水中添加1 g/L氨芐西林、1 g/L硫酸新霉素、0.5 g/L萬(wàn)古霉素和1 g/L甲硝唑抗生素混合物，小鼠口服28 d以去除腸道內(nèi)共生細(xì)菌；將抗生素處理過(guò)的小鼠隨機(jī)分成2組(每組12只，雌雄各占1/2)，一組灌胃金華豬的糞便微生物菌懸液,另外一組灌胃長(zhǎng)白豬糞便微生物菌懸液，灌胃劑量每天每只小鼠為0.2 mL，連續(xù)灌胃7 d，分別在灌胃第1、2、4和7天及在停止灌胃后的第7、14、21和28天收集小鼠的新鮮糞便，用于后續(xù)提DNA和測(cè)序。

1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增

定量稱(chēng)取0.1 g小鼠糞便，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)試劑盒從小鼠糞便中提取基因組DNA，用正向引物338F和反向引物806R通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，引物序列338F為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R為5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

1.4 Illumina HiSeq測(cè)序和生物信息學(xué)分析

使用Illumina HiSeq對(duì)PCR擴(kuò)增的V3～V4區(qū)測(cè)序。隨后測(cè)序數(shù)據(jù)用QIIME進(jìn)行分析。操作分類(lèi)單元(OTU)以97%的同一閾值進(jìn)行組裝，將全部OTU的代表性序列與RDP和Sliva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比和物種注釋。計(jì)算Goods coverage以估計(jì)樣本占總物種的百分比，構(gòu)建了在門(mén)和屬水平上顯示物種分布的柱狀圖。用QIIME軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)與β多樣性指數(shù)，并用R software作圖，主坐標(biāo)分析(PCoA)利用加權(quán)UniFrac法進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)菌相對(duì)豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)分析

參照Xu等[19]的引物序列對(duì)小鼠糞樣中細(xì)菌總數(shù)的相對(duì)豐度進(jìn)行RT-PCR分析，引物為5’-CGGYCCAGACTCCTACGGG-3’和5’-TTACCGCGGCTGCTGGCA-3’。RT-PCR使用SYBR Green PCR Master Mix在ABI 7900 HT快速檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行。PCR反應(yīng)混合物包括：5.0 μL SYBR Green qPCR mix，正向和反向引物各0.5 μL，4.0 μL ddH2O。根據(jù)不同濃度細(xì)菌總DNA，添加不同體積模板量保證體系中總細(xì)菌DNA的量一致。RT-PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性程序95 ℃，2 min；擴(kuò)增定量程序?yàn)?5 ℃，15 s；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)，熔解曲線(xiàn)程序?yàn)?0～95 ℃，20 min，每秒增加0.1 ℃持續(xù)檢測(cè)熒光[20]。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。將測(cè)得的Ct值聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到小鼠糞便樣品中相應(yīng)的DNA拷貝數(shù)，采用2-△△Ct對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行整理分析。

1.6 糞便SCFAs含量的測(cè)定

稱(chēng)取小鼠0.1 g左右糞便樣本溶于1 mL去離子水中，渦旋使其混勻，9 850×g離心10 min，取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，隨后加入200 μL丁烯酸，濾膜(0.22 μm)過(guò)濾。得到的溶液利用氣相色譜(GC)分析儀測(cè)定SCFAs含量。色譜條件：汽化室溫度180 ℃，毛細(xì)管色譜柱(TnertCAPFFAP)柱溫110 ℃；載氣是氮?dú)猓瑝毫?0 kPa，燃燒氣氫氣壓力為50 kPa，氧氣壓力為50 kPa，氫火焰離子化檢測(cè)儀(FID)溫度180 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 受體小鼠糞便細(xì)菌總數(shù)

通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，受體小鼠單位質(zhì)量糞便中細(xì)菌總數(shù)在移植過(guò)程中逐漸增多(圖1)，而停止移植后細(xì)菌總數(shù)變化較小且基本保持穩(wěn)定。

A：金華豬糞便微生物移植小鼠 mice with Jinhua pig fecal microbiota transplantation；B：長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠 mice with Landrace pig fecal microbiota transplantation。G1、G2、G4、G7表示移植過(guò)程中的第1、2、4和7天，PG7、PG14、PG21、PG28表示停止移植后的第7、14、21和28天。下同。G1, G2, G4, G7 represent the days 1, 2, 4 and 7 over the time of transplantation, PG7, PG14, PG21, PG28 represent the days 7, 14, 21, 28 after the transplantation. The same as below.圖1 豬糞便微生物移植小鼠糞便細(xì)菌總數(shù)變化Fig.1 Changes of total bacteria number in fecal samples of mice with pig fecal microbiota transplantation

2.2 受體小鼠糞便菌群結(jié)構(gòu)變化

對(duì)受體小鼠糞便樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析，從16個(gè)受體小鼠的糞便樣品中共產(chǎn)生1 018 351條有效序列，平均為63 647條(37 063～77 619條)。有效序列根據(jù)97%相似性水平上進(jìn)一步分為2 945個(gè)OTUs，每個(gè)樣品的平均OTUs數(shù)量為184個(gè)(95～236個(gè))。樣品的覆蓋度指數(shù)均在0.999～1.000，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能反映受體小鼠糞便菌群多樣性組成。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行α多樣性分析(表1)，從豬到小鼠的糞便移植過(guò)程中，受體小鼠糞便樣品的Shannon指數(shù)隨移植時(shí)間變化逐漸升高，表明隨著移植時(shí)間的增加，小鼠糞便菌群的相對(duì)豐度和多樣性逐漸增加。

FMT不僅增加了受體小鼠腸道微生物的相對(duì)豐度和多樣性，且移植過(guò)程中小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生動(dòng)態(tài)演替變化。在豬到小鼠的糞便移植過(guò)程中，在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)的相對(duì)豐度隨著糞便移植時(shí)間的增加而逐漸降低，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)的相對(duì)豐度逐漸增加。此外，與金華豬糞便微生物移植小鼠相比，在停止糞便移植后長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠糞便中擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較高，而金華豬糞便微生物移植小鼠則厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度較高(圖2-A和圖2-B)?？梢?jiàn)，受體小鼠腸道微生物相對(duì)豐度在一定程度上受供體豬的影響。在屬水平上，大多數(shù)樣品中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、葡萄球菌屬(Staphylocaccus)和阿克曼氏菌屬(Akkermansia)的相對(duì)豐度占比較大，占全部序列的1/2以上(圖2-C和圖2-D)。

選取受體小鼠糞便中相對(duì)豐度最高的35個(gè)屬進(jìn)行熱點(diǎn)圖(圖3)分析發(fā)現(xiàn)，受體小鼠糞便中擬桿菌屬、阿克曼氏菌屬和副擬桿菌屬的相對(duì)豐度隨著糞便移植時(shí)間的增加逐漸升高，而乳酸桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、大腸桿菌屬(Escherichia)相對(duì)豐度逐漸降低，直至停止移植后保持穩(wěn)定。

表1 豬糞便微生物移植小鼠糞便樣品的α多樣性Table 1 Alpha diversity of fecal samples of mice with pig fecal microbiota transplantation

為了進(jìn)一步分析受體小鼠腸道菌群的動(dòng)態(tài)演替規(guī)律，進(jìn)行PCoA發(fā)現(xiàn)(圖4)，小鼠灌胃階段與停止灌胃后的階段出現(xiàn)分離，表明2個(gè)階段小鼠菌群結(jié)構(gòu)存在差異；且不同品種豬糞便微生物移植小鼠的腸道微生物演替趨勢(shì)相同。

2.3 受體小鼠糞便SCFAs含量變化

對(duì)受體小鼠糞便樣本的短鏈脂肪酸SCFAs含量進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量均隨移植時(shí)間的增加逐漸升高。在停止移植后，受體小鼠糞便樣品中的SCFAs含量變化較小(圖5)。

3 討 論

腸道微生物對(duì)人和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、生長(zhǎng)代謝、免疫應(yīng)答均具有重要調(diào)控作用[21]。FMT指將生理狀態(tài)良好的人或動(dòng)物糞便中功能性菌群移植到受體腸道內(nèi),調(diào)控胃腸道菌群平衡以提高免疫功能、維持機(jī)體健康水平、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[22]。Geng等[23]將金華豬的糞便微生物移植于“杜×長(zhǎng)×大”雜交新生仔豬14 d后，發(fā)現(xiàn)受體仔豬結(jié)腸擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度降低，而厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度增加，降低脂多糖誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。Yan等[14]將約克夏豬和榮昌豬糞菌移植至小鼠體內(nèi)5周后分析發(fā)現(xiàn)，受體小鼠在菌群和脂肪生成特征上與各自供體豬相似，結(jié)果顯示腸道微生物群在改變宿主的代謝和脂肪形成中起著重要作用。然而這些研究主要是聚焦于菌群移植后某一時(shí)間點(diǎn)菌群結(jié)構(gòu)的變化，以及通過(guò)受體小鼠表型來(lái)探究腸道微生物與宿主代謝和表型的關(guān)聯(lián)，從不同時(shí)間點(diǎn)分析FMT過(guò)程菌群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)演替變化研究甚少。陳雪等[24]給杜長(zhǎng)大新生仔豬連續(xù)5 d口服母源糞菌液，收集仔豬1、3、5、7、10、14、18和22日齡糞便，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMT在一定程度上增加了仔豬腸道微生物的多樣性，但口服糞菌液并不能持久影響仔豬腸道微生物定植，在仔豬22日齡左右，腸道菌群會(huì)逐漸和母豬腸道菌群趨于一致。也有研究結(jié)果表明，將人微生物移植到無(wú)菌小鼠腸道后菌群結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生劇烈變化，之后逐漸達(dá)到穩(wěn)定，穩(wěn)定后小鼠腸道中的微生物群落中只有部分細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特征與人類(lèi)供體相似[25]。Li等[26]通過(guò)FMT將人類(lèi)糞便樣本移植到無(wú)菌小鼠體內(nèi)，使用小鼠模型來(lái)復(fù)制人類(lèi)腸道微生物相關(guān)表型，研究發(fā)現(xiàn)FMT后大于1/3的人腸道微生物在種和屬水平上都產(chǎn)生了明顯持久的改變，說(shuō)明腸道棲息地塑造了菌群結(jié)構(gòu)變化[23]。多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察FMT受體菌群結(jié)構(gòu)變化對(duì)解決FMT是否能成功、菌群植入持久性等基本問(wèn)題十分重要。

A:金華豬糞便微生物移植小鼠糞便中相對(duì)豐度最高的6個(gè)門(mén) top 6 phyla in the fecal samples of mice with Jinhua pig fecal microbiota transplantation；B:長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠糞便中相對(duì)豐度最高的6個(gè)門(mén) top 6 phyla in the fecal samples of mice with Landrace pig fecal microbiota transplantation；C：金華豬糞便微生物移植小鼠糞便中相對(duì)豐度最高的15個(gè)屬 top 15 genera in the fecal samples of mice with Jinhua pig fecal microbiota transplantation；D：長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠糞便中相對(duì)豐度最高的15個(gè)屬 top 15 genera in the fecal samples of mice with Landrace pig fecal microbiota transplantation。Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門(mén)；Actinobacteria：放線(xiàn)菌門(mén)；Fusobacteria：梭桿菌門(mén)；Verrucomicrobia：疣微菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Coprococcus：糞球菌屬；[Eubacterium]：優(yōu)桿菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)細(xì)菌屬；Clostridium：梭菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；Akkermansia：阿克曼氏菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Escherichia：大腸桿菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Sutterella：薩特氏菌屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬；Robinsoniella：嗜硒微生物；Others：其他。圖2 豬糞便微生物移植小鼠糞便菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes of microbial community structure in fecal samples of mice with pig fecal microbiota transplantation

A：金華豬糞便微生物移植小鼠 mice with Jinhua pig fecal microbiota transplantation；B：長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠 mice with Landrace pig fecal microbiota transplantation。Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Escherichia：大腸桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Blautia：布勞特氏菌；Akkermansia：阿克曼氏菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；[Eubacterium]：優(yōu)桿菌屬；Sutterella：薩特氏菌屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；[Ruminococcus]：瘤胃球菌屬；Clostridium：梭菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)細(xì)菌屬；Brevundimonas：短波單胞菌；Comamonas：叢毛單胞菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；f_Erysipelotrichaceae_g_Clostridium：韋榮球菌科-梭狀芽孢桿菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；f_Lachnospiraceae_g_Clostridium：毛螺菌科-梭狀芽孢桿菌屬；Rummeliibacillus：魯梅利桿菌屬；Citrobacter：檸檬酸菌屬；Phascolarctobacterium：法氏桿菌屬；Macrococcus：巨型球菌屬；Vagococcus：漫游球菌屬；Coprobacillus：糞芽孢菌屬；Myroides：類(lèi)香菌屬；Kocuria：考克氏菌屬；Aerococcus：氣球菌屬；Corynebacterium：棒狀桿菌屬；Brevibacterium：短桿菌屬；Sphingobacterium：鞘氨醇桿菌屬；Bacillus：桿菌屬；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Wautersiella：嗜硒微生物；Robinsoniella：羅賓遜貝屬。圖3 豬糞便移植微生物小鼠糞便中相對(duì)豐度最高的35個(gè)屬Fig.3 Top 35 genera in fecal samples of mice with pig fecal microbiota transplantation

A：金華豬糞便微生物移植小鼠 mice with Jinhua pig fecal microbiota transplantation；B：長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠 mice with Landrace pig fecal microbiota transplantation。圖4 微生物群落組成主坐標(biāo)分析Fig.4 PCoA of microbial community composition

A：金華豬糞便微生物移植小鼠 mice with Jinhua pig fecal microbiota transplantation；B：長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠 mice with Landrace pig fecal microbiota transplantation。圖5 糞便移植微生物小鼠糞便中SCFAs含量變化Fig.5 Changes of SCFAs content in fecal samples of mice with pig fecal microbiota transplantation

本研究中選取金華豬和長(zhǎng)白豬2個(gè)不同代表性豬品種的糞便微生物移植到經(jīng)廣譜抗生素處理過(guò)的小鼠體內(nèi)，金華豬和長(zhǎng)白豬糞便供體的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均是厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和螺旋菌門(mén)；在屬水平上，金華豬糞便中相對(duì)豐度最高的前5個(gè)屬分別為梭菌屬、密螺旋體屬(Treponema)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、乳酸桿菌屬和CF231，長(zhǎng)白豬糞便中相對(duì)豐度最高的前5個(gè)屬分別為乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬、蘇黎世桿菌屬和希瓦氏菌屬(Shewanella)[18]。經(jīng)過(guò)廣譜抗生素處理過(guò)的小鼠腸道中微生物的豐富度和多樣性明顯減少，且FMT前受體小鼠之間的糞便微生物群結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異[27]。FMT過(guò)程中小鼠腸道中厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度隨著移植時(shí)間的增加而逐漸降低，擬桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸增加。在屬水平上，受體小鼠腸道中擬桿菌屬、阿克曼氏菌屬和副擬桿菌屬的相對(duì)豐度隨著移植時(shí)間的增加逐漸升高，而乳酸桿菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌屬相對(duì)豐度逐漸降低。值得注意的是，不同品種豬FMT小鼠菌群有差異，與金華豬受體小鼠相比，在停止FMT后長(zhǎng)白豬受體小鼠糞便中擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較高，而金華豬受體小鼠則厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度較高，在屬水平上，金華豬受體小鼠糞便中乳酸桿菌屬相對(duì)豐度較高，長(zhǎng)白豬受體小鼠擬桿菌屬、副擬桿菌屬和阿克曼氏菌屬相對(duì)豐度較高。受體小鼠糞便樣品的Shannon指數(shù)隨移植時(shí)間變化逐漸升高，表明隨著移植時(shí)間的增加，小鼠糞便菌群的相對(duì)豐度和多樣性逐漸增加。受體小鼠糞便細(xì)菌總數(shù)也隨著移植時(shí)間的增加而逐漸增加，停止移植后變化較小。這與前人多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察菌群變化規(guī)律一致，給杜長(zhǎng)大新生仔豬口服灌喂母源糞菌液3 mL，持續(xù)5 d，并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集仔豬糞樣，結(jié)果表明FMT能在一定程度上增加仔豬腸道微生物的多樣性[24]。

本試驗(yàn)中，受體小鼠糞便中6種SCFAs的含量隨移植時(shí)間的增加逐漸升高，停止移植后SCFAs含量變化較小，與細(xì)菌總數(shù)的變化規(guī)律相一致，說(shuō)明菌群代謝產(chǎn)生SCFAs與菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。張卓[22]試驗(yàn)選取新生“長(zhǎng)×榮”二雜仔豬口服灌喂1 mL健康成年“杜×長(zhǎng)×大”雜交豬的糞便菌懸液，連續(xù)灌喂5 d，結(jié)果顯示仔豬結(jié)腸中SCFAs的含量均有上升趨勢(shì)，其中丙酸、異丁酸、異戊酸的含量顯著增加。本研究報(bào)道了豬FMT小鼠過(guò)程中菌群及其代謝的動(dòng)態(tài)變化，在FMT結(jié)束的第28天，受體小鼠糞便中菌群結(jié)構(gòu)從門(mén)到屬的水平上已發(fā)生了顯著的改變，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察FMT小鼠腸道菌群變化，為探究FMT受體腸道微生物結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為外源微生物定植小鼠腸道的研究提供了補(bǔ)充資源。

4 結(jié) 論

① 在豬FMT小鼠過(guò)程中，隨著移植時(shí)間的增加，受體小鼠糞便中細(xì)菌總數(shù)、菌群的相對(duì)豐度和多樣性逐漸增多，在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸降低，擬桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)相對(duì)豐度逐漸增加；在屬水平上，擬桿菌屬、阿克曼氏菌屬和副擬桿菌屬的相對(duì)豐度逐漸變大，而乳酸桿菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌屬相對(duì)豐度逐漸降低，在停止移植后基本保持穩(wěn)定。

② 停止FMT后，長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠糞便中擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較高，而金華豬糞便微生物移植小鼠厚壁菌門(mén)高，在屬水平上，金華豬糞便微生物移植小鼠乳酸桿菌屬相對(duì)豐度較高，長(zhǎng)白豬糞便微生物移植小鼠擬桿菌屬、副擬桿菌屬和阿克曼氏菌屬相對(duì)豐度較高。

③ FMT期間受體小鼠糞便中SCFAs的含量隨移植時(shí)間增加逐漸升高，在停止移植后SCFAs含量變化較小。