樊嘉琦 周學章

(寧夏大學生命科學學院，銀川 750000)

乳脂和乳蛋白是衡量乳制品品質(zhì)的關(guān)鍵營養(yǎng)成分，其中乳脂在牛奶中含量為3%～5%，牛奶乳脂中97%的成分可被人體吸收，牛奶中乳蛋白的含量影響牛奶的營養(yǎng)價值[1]。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)是乳腺組織中吸收營養(yǎng)物質(zhì)、執(zhí)行泌乳功能、與外界直接接觸、高度分化的免疫細胞，也是合成和分泌乳脂、乳糖、乳蛋白等營養(yǎng)成分的主要場所[2-3]。牛乳中各種成分會在一定范圍內(nèi)波動，其中乳脂含量是牛乳中最容易產(chǎn)生浮動的指標，奶牛品種、年齡、胎次、泌乳時間等均可影響乳脂的分泌[4-5]。當奶牛乳腺炎發(fā)生時，由于乳腺組織的損傷，會導(dǎo)致牛奶中營養(yǎng)成分的降低及產(chǎn)量的下降，在BMECs炎癥模型中，乳脂、乳蛋白表達量減少[6-7]。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可引起機體及細胞的免疫反應(yīng)。有研究表明，LPS可引起乳腺組織劇烈的炎癥反應(yīng)，目前LPS刺激BMECs是體外研究奶牛乳腺炎模型的主要方法[6,8]。奶牛乳腺炎的發(fā)生會降低乳脂及乳蛋白的合成，影響牛奶的品質(zhì)及產(chǎn)量，增加奶牛淘汰率，因此，尋找緩解BMECs細胞炎癥、保證乳品質(zhì)的持續(xù)發(fā)展的藥物十分重要。如今發(fā)現(xiàn)多種中藥及中藥提取物可以提升奶牛的泌乳性能，并緩解乳腺炎的發(fā)生[1,9-10]。黃芪甲苷(astragalus-Ⅳ，AS-Ⅳ)是中藥黃芪的一種提取物，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌的功能和增強機體免疫的作用[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可以抑制LPS刺激的BMECs中炎癥因子的表達，并激活細胞中β-酪蛋白的分泌[12]?；诖搜芯勘尘?，本試驗以LPS為炎癥誘導(dǎo)劑，研究AS-Ⅳ干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BMECs中乳脂及乳蛋白合成的影響，為AS-Ⅳ在緩解乳腺炎中的進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞

BMECs由寧夏大學生命科學學院王東老師惠贈，將培養(yǎng)8～15代的BMECs用于試驗研究。

1.2 試驗儀器及試劑

倒置顯微鏡(日本奧利巴斯公司)；細胞計數(shù)儀、酶標儀、熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。AS-Ⅳ(北京某科技有限公司)；黃芪甲苷-5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯復(fù)合物(ASIV-CDFA，相對分子質(zhì)量1 228.43)(南京固與生物有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(以色列Biological Industeies公司)；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同人公司)；氟化硼二吡咯衍生物(美國GLPBIO公司)；脂質(zhì)過氧化物(LPO)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抗體(bs-1992R)、抗磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抗體(bs-5331R)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(ab8227)(英國Abcam公司)。

1.3 BMECs細胞生物學活性檢測

BMECs以1×104個/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗設(shè)計不同濃度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0 μg/mL)的AS-Ⅳ，與細胞共孵育1、3、6 h，并同時設(shè)立對照孔(對照組，不含藥物，含細胞及培養(yǎng)基)和空白孔(空白組，不含細胞和藥物，只含培養(yǎng)基)，每組設(shè)置6個重復(fù)。棄去培養(yǎng)基，每孔添加含10% CCK-8的培養(yǎng)液，避光孵育3 h，于450 nm處測定吸光度值，并計算細胞存活率，計算公式如下：

細胞存活率(%)=[(樣品組-空白組)/(對照組-空白組)]×100。

1.4 BMECs中乳蛋白及乳脂相關(guān)基因表達影響

BMECs以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗分為8組(每組3個重復(fù))，分別為對照組(C組)、LPS刺激組(LPS組，0.5 μg/mL LPS刺激24 h)以及6個AS-Ⅳ干預(yù)組，即在0.5 μg/mL LPS刺激24 h后，加入不同濃度的AS-Ⅳ繼續(xù)培養(yǎng)，6個AS-Ⅳ干預(yù)組分別為100 μg/mL AS-Ⅳ刺激1 h組(LPS+100 AS-Ⅳ 1 h組)、100 μg/mL AS-Ⅳ刺激3 h組(LPS+100 AS-Ⅳ 3 h組)、100 μg/mL AS-Ⅳ刺激6 h組(LPS+100 AS-Ⅳ 6 h組)、25 μg/mL AS-Ⅳ刺激6 h組(LPS+25 AS-Ⅳ 6 h組)、50 μg/mL AS-Ⅳ刺激6 h組(LPS+50 AS-Ⅳ 6 h組)、100 μg/mL AS-Ⅳ刺激6 h組(LPS+100 AS-Ⅳ 6 h組)。使用Trizol法提取細胞總RNA，并使用分光光度計檢測RNA的純度及濃度。按照HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書步驟進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線為單峰，β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。引物設(shè)計參考文獻[13-14]，具體見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.5 BMECs中MDA、LPO含量的測定

BMECs以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗分組同1.4，每組設(shè)置3個重復(fù)。收集各組中細胞培養(yǎng)液，按照MDA和LPO測定試劑盒說明書進行檢測。

1.6 BMECs中脂滴的分泌

BMECs以2×105個/孔的密度接種在放有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h細胞完全貼壁。試驗分組同1.4。使用4%的多聚甲醛固定細胞20 min，PBS清洗3次，加入BODIPY495/503染料染色15 min，PBS清洗3次，用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光倒置顯微鏡觀察細胞，使用Image J軟件檢測細胞中平均熒光強度。

1.7 BMECs中mTOR蛋白表達的測定

BMECs以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗分組同1.4。使用全蛋白提取試劑盒裂解細胞并收集細胞全蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，并調(diào)整蛋白含量一致。在含5%濃縮膠、7.5%分離膠的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中進行蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜封閉在0.5%的脫脂奶粉中，封閉1 h。4 ℃孵育一抗12 h，TBST緩沖液清洗3次。室溫孵育辣根過氧化物酶標記二抗2 h，TBST清洗3次。使用增強型化學學發(fā)光顯色液(ECL)曝光和拍照。使用Image J軟件對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、β-肌動蛋白的蛋白表達進行灰度分析。

1.8 BMECs對ASIV-CFDA攝取量的檢測

為檢測BMECs可否吸收AS-Ⅳ，將使用熒光倒置顯微鏡觀察ASIV-CDFA在BMECs中的位置，并使用流式細胞術(shù)分析ASIV-CDFA在BMECs中的吸收狀況與藥物刺激時間及濃度的相關(guān)性。

BMECs以2×105個/孔的密度接種在放有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h細胞完全貼壁。ASIV-CDFA以100 μg/mL刺激BMECs 1 h，PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定20 min。用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光倒置顯微鏡觀察ASIV-CDFA在BMECs中的位置。

使用流式細胞術(shù)分析ASIV-CDFA在BMECs中的吸收狀況。BMECs以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h細胞完全貼壁。0.5 μg/mL LPS刺激BMECs 24 h，加入不同濃度(25、50、100 μg/mL)的ASIV-CDFA，與細胞共孵育1、3、6 h，PBS清洗2次，胰酶消化細胞，PBS清洗細胞后將細胞重懸至Hanks液中，使用流式細胞儀檢測細胞攝取的熒光強度。

1.9 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)均以平均值和標準差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度及不同時間AS-Ⅳ對BMECs細胞活性的影響

如圖1所示，AS-Ⅳ對細胞的毒性作用會隨著刺激濃度的提高和刺激時間的延長而增加。在濃度為100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激BMECs 1、3、6 h時，細胞存活率分別為100%、96%、92%，25%、50%、100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激BMECs 6 h時，細胞存活率分別為96%、95%、92%，在此時間及濃度下細胞存活率在90%以上，將選取以上濃度及時間作為后續(xù)試驗條件。

圖1 AS-Ⅳ對BMECs細胞活性的影響Fig.1 Effects of AS-Ⅳ on BMECs cell activity

2.2 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs乳蛋白相關(guān)基因表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，LPS刺激BMECs會顯著抑制細胞中β-酪蛋白(CSN2)及αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因相對表達量(P<0.05)；與LPS組相比，各AS-Ⅳ組細胞中CSN2基因相對表達量均顯著升高(P<0.05)，但AS-Ⅳ對炎癥細胞中CSN1S1基因相對表達量無激活作用，100 μg/mL AS-Ⅳ刺激細胞1 h會顯著抑制炎癥細胞中CSN1S1基因相對表達量(P<0.05)。

2.3 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs乳脂合成相關(guān)基因表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，LPS顯著抑制脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)、脂肪酸合成酶(FASN)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)基因相對表達量(P<0.05)。與LPS組相比，各個濃度的AS-Ⅳ可以顯著提高FABP3基因相對表達量(P<0.05)，100 μg/mL AS-Ⅳ刺激炎癥細胞1 h顯著升高FASN、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂蛋白酯酶(LPL)基因相對表達量(P<0.05)，25 μg/mL AS-Ⅳ刺激細胞6 h顯著提高過氧化酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因相對表達量(P<0.05)，50 μg/mL AS-Ⅳ刺激細胞6 h顯著提高LPL基因相對表達量(P<0.05)。

2.4 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs脂質(zhì)相關(guān)因子含量的影響

如圖4所示，與對照組相比，LPS顯著提高細胞上清液中LPO和MDA含量(P<0.05)；與LPS組相比，各AS-Ⅳ組均可顯著降低炎癥細胞中MDA含量(P<0.05)，25、50、100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞6 h顯著降低炎癥細胞中LPO含量(P<0.05)。

CSN2：β-酪蛋白 β-casein；CSN1S1：αS1酪蛋白 αs1-casein。C：對照組；LPS：0.5 μg/mL LPS刺激組；LPS+100 AS-Ⅳ 1 h：0.5 μg/mL LPS刺激24 h+100 μg/mL AS-Ⅳ刺激1 h；LPS+100 AS-Ⅳ 3 h：0.5 μg/mL LPS刺激24 h+100 μg/mL AS-Ⅳ刺激3 h；LPS+100 AS-Ⅳ 6 h：0.5 μg/mL LPS刺激24 h+100 μg/mL AS-Ⅳ刺激6 h；LPS+25 AS-Ⅳ 6 h：0.5 μg/mL LPS刺激24 h+25 μg/mL刺激AS-Ⅳ 6 h；LPS+50 AS-Ⅳ 6 h：0.5 μg/mL LPS刺激24 h+50 μg/mL AS-Ⅳ刺激6 h。數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。C: control group; LPS: 0.5 μg/mL LPS stimulation group; LPS+100 AS-Ⅳ 1 h: 0.5 μg/mL LPS for 24 h+100 μg/mL AS-Ⅳ for 1 h; LPS+100 AS-Ⅳ 3 h: 0.5 μg/mL LPS for 24 h+100 μg/mL AS-Ⅳ for 3 h; LPS+100 AS-Ⅳ 6 h: 0.5 μg/mL LPS for 24 h+100 μg/mL AS-Ⅳ for 6 h; LPS+25 AS-Ⅳ 6 h: 0.5 μg/mL LPS for 24 h+25 μg/mL AS-Ⅳ for 6 h; LPS+50 AS-Ⅳ 6 h: 0.5 μg/mL LPS for 24 h+50 μg/mL AS-Ⅳ for 6 h. Data columns with different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same as below.圖2 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs中CSN2、CSN1S1基因相對表達量的影響Fig.2 Effects of AS-Ⅳ on relative expression levels of CSN2 and CSN1S1 genes in LPS-stimulated BMECs

如圖5所示，LPS預(yù)處理后脂滴表達量降低，100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞1 h及25、50 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞6 h顯著提高炎癥細胞中脂滴的含量(P<0.05)。

2.5 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs中p-mTOR、mTOR蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，LPS組p-mTOR蛋白被顯著抑制(P<0.05)；與LPS組相比，AS-Ⅳ刺激炎癥細胞時，25，100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞6 h可顯著激活炎癥細胞中p-mTOR蛋白的表達(P<0.05)。

2.6 BMECs對ASIV-CFDA的攝取

ASIV-CDFA以100 μg/mL刺激BMECs 1 h，發(fā)現(xiàn)BMECs可吸收ASIV-CDFA，并在細胞質(zhì)中聚集(圖7)。之后使用流式細胞儀檢測了在炎癥狀態(tài)下，BMECs所吸收的ASIV-CDFA熒光強度，結(jié)果如圖8所示，在同一時間中，ASIV-CDFA的細胞吸收量會隨著濃度的升高而增高；但同一濃度中，ASIV-CDFA的細胞吸收量卻沒有隨時間的延長而提高。

3 討 論

奶牛乳腺炎是奶牛中頻發(fā)發(fā)作、對乳業(yè)生產(chǎn)影響最嚴重的疾病之一，乳腺炎的發(fā)生會影響乳脂、乳蛋白的合成[6]。當發(fā)生臨床性乳腺炎時，乳汁的顏色變?yōu)榛野咨螯S褐色、濃度變稀、伴有絮狀沉淀物等明顯變化；發(fā)生隱性乳腺炎時，雖肉眼不能觀察到乳汁顏色變化，但乳汁成分發(fā)生改變，其中乳脂、乳糖等含量顯著降低[15-16]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，當革蘭氏陰性菌入侵乳腺組織，細菌大量繁殖時或治療乳腺炎細菌裂解死亡時，LPS會被大量釋放，其中BMECs對LPS高度敏感，短時間內(nèi)可引起細胞中炎癥因子的大量分泌，LPS刺激BMECs是體外研究乳腺炎病理的理想模型之一[17]。AS-Ⅳ是我國傳統(tǒng)常用中藥黃芪的主要活性物質(zhì)，可作為評價黃芪質(zhì)量的重要標志物，在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗應(yīng)激等方面具有顯著效果[18-19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可抑制LPS損傷的BMECs炎癥因子及氧化因子的表達，提高LPS損傷的BMECs中β-酪蛋白表達[12]，本試驗進一步觀察了不同時間和濃度的AS-Ⅳ對炎癥細胞中乳蛋白及乳脂合成相關(guān)因子的影響。

ACC：乙酰輔酶A羧化酶 acetyl CoA carboxylase；FABP3：脂肪酸結(jié)合蛋白3 fatty acid-binding protein 3；FASN：脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase；LPL：脂蛋白酯酶 lipoprotein lipase；SCD：硬酯酰輔酶A去飽和酶 stearoyl-CoA-desaturase；SREBP1：固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白1 sterol regulatory element binding proteins 1；PPARγ：過氧化酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptors γ。圖3 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs中FABP3、ACC、FASN、PPARγ、LPL、SCD、SREBP1基因相對表達量影響Fig.3 Effects of AS-Ⅳ on relative expression levels of FABP3, ACC, FASN, PPARγ, LPL, SCD and SREBP1 genes in LPS-stimulated BMECs

大多研究認為，酪蛋白基因的表達是影響酪蛋白合成和分泌的關(guān)鍵因素，但酪蛋白的分泌還會受到其他營養(yǎng)物質(zhì)的影響，在炎癥狀態(tài)下，用于合成酪蛋白的營養(yǎng)物質(zhì)及前體物會被用于抗炎，因此導(dǎo)致酪蛋白基因的表達量降低[20-21]。100 mL牛乳中總蛋白質(zhì)含量約為3.3 g，其中酪蛋白可占總蛋白質(zhì)含量的80%，剩余20%為乳清蛋白，酪蛋白分為4類，分別是CSN1S1(約40%)、CSN2(約36%)、κ-酪蛋白(約14%)、αs2-酪蛋白(約10%)，α-酪蛋白及β-乳球蛋白是乳蛋白中引起過敏的主要蛋白質(zhì)[22]。胡耀等[23]發(fā)現(xiàn)LPS刺激BMECs會抑制CSN2、CSN1S1基因及蛋白的表達，LPS還可抑制細胞中mTOR基因的表達，黃花蒿乙醇提取物可以拮抗LPS對BMECs中乳蛋白的抑制。田青等[20]發(fā)現(xiàn)，LPS刺激大鼠乳腺上皮細胞會抑制細胞中CSN2、乳清蛋白(α-LA)基因的表達，但增強CSN1S1基因的表達，并推測CSN2與CSN1S1基因之間的拮抗作用是由于CSN1S1基因部分承擔炎癥免疫調(diào)節(jié)作用所導(dǎo)致。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激BMECs時會抑制乳蛋白合成相關(guān)基因CSN2、CSN1S1基因的相對表達，與胡耀等[23]研究結(jié)果相似；100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激炎癥細胞1、3、6 h和25、50、100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激炎癥細胞6 h均可提高細胞中CSN2基因相對表達，但各個AS-Ⅳ組之間無顯著差異；AS-Ⅳ不能提高炎癥細胞中CSN1S1基因相對表達，且100 μg/mL AS-Ⅳ刺激細胞1 h顯著抑制了炎癥細胞中CSN1S1基因相對表達量，并推測AS-Ⅳ可能通過提高炎癥細胞中的CSN2含量，從而調(diào)節(jié)酪蛋白的組成成分。

MDA：丙二醛 malondialdehyde；LPO：脂質(zhì)過氧化物 lipid peroxidase。圖4 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs中MDA、LPO含量的影響Fig.4 Effects of AS-Ⅳ on MDA and LPO contents in LPS-stimulated BMECs

圖5 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs中BODIPY脂滴熒光染色圖及熒光染色量化結(jié)果圖Fig.5 Fluorescence staining of BODIPY lipid droplets in LPS-stimulated BMECs by AS-Ⅳ and quantification results of fluorescence staining (40×)

乳脂是牛奶中的另一主要成分，其中短鏈脂肪酸可在乳腺中合成，長鏈脂肪酸由血液運輸中獲取[1,13]。當奶牛泌乳期時，BMECs細胞代謝速度增高，導(dǎo)致細胞中活性氧(ROS)的沉積增多，當過量的ROS沉積會引起細胞損傷，并攻擊細胞中的不飽和脂肪酸，引起細胞中的脂質(zhì)過氧化物的沉積[24]。MDA和LPO是細胞中活性氧和不飽和脂肪酸作用后的氧自由基產(chǎn)物，是反映細胞中脂質(zhì)過氧化程度的指示劑，并間接反映細胞損傷程度[25]。本試驗發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ可顯著抑制炎癥細胞中MDA的含量，25、50、100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞6 h可顯著抑制炎癥細胞中LPO的含量，100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞1 h及25、50 μg/mL的AS-Ⅳ刺激細胞6 h顯著提高炎癥細胞中脂滴的含量。FASN及ACC是合成短鏈脂肪酸的關(guān)鍵因子，可調(diào)控脂肪酸的初始合成及碳鏈延伸，F(xiàn)ABP3及LPL是參與長鏈脂肪酸攝取及轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵因子，硬酯酰輔酶A去飽和酶(SCD)是催化飽和脂肪酸形成不飽和脂肪酸關(guān)鍵因子，PPARγ及SREBP1是影響長鏈脂肪酸代謝并調(diào)控脂肪合成的重要因子[13,26]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，當LPS刺激BMECs會降低脂滴含量，抑制細胞中乳脂合成相關(guān)基因FABP3、FASN、SREBP1基因相對表達量，提高細胞中脂質(zhì)氧化相關(guān)因子LPO和MDA含量。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理后的BMECs中SREBP1、FASN、ACC基因在轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，與本試驗研究結(jié)果相似。AS-Ⅳ在不同的刺激時間和刺激濃度提高乳蛋白合成相關(guān)基因的效果不同，其中100 μg/mL AS-Ⅳ刺激炎癥細胞，刺激時間為1 h比3、6 h對細胞中ACC、FASN、LPL基因激活表達更佳，使用ASIV-CDFA觀察炎癥細胞對AS-Ⅳ的吸收效果發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ的吸收量會呈濃度依賴性升高，但沒有呈時間依賴性升高。這可能是因為AS-Ⅳ的細胞吸收量無顯著差異時，AS-Ⅳ刺激細胞首先調(diào)控了脂肪酸從頭合成相關(guān)ACC、FASN基因和乳糜攝取相關(guān)的LPL基因，之后再影響SCD、PPARγ基因的表達。AS-Ⅳ不僅可以激活乳脂合成相關(guān)基因的表達，而且對細胞中的脂質(zhì)氧化有抑制作用，抑制細胞損傷。

圖6 AS-Ⅳ對LPS刺激的BMECs中p-mTOR、mTOR蛋白表達的影響Fig.6 Effects of AS-Ⅳ on expression of p-mTOR and mTOR proteins in LPS-stimulated BMECs

圖7 100 μg/mL的ASIV-CDFA刺激BMECs 1 h細胞圖Fig.7 Graph of 100 μg/mL ASIV-CDFA stimulated BMECs for 1 h (40×)

mTOR信號通路廣泛存在于多種細胞中，影響細胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、凋亡等多種生命活動，在BMECs中還會影響細胞中乳脂和乳蛋白的合成[28]。mTOR信號對于細胞中脂肪酸合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ、SREBP1的表達具有調(diào)控作用，對于乳蛋白的合成、翻譯過程發(fā)揮重要作用[1,29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激細胞后，p-mTOR蛋白被顯著抑制，25、100 μg/mL的AS-Ⅳ刺激炎癥細胞6 h時p-mTOR蛋白表達顯著提高。這提示AS-Ⅳ可能激活炎性細胞中mTOR信號通路，從而緩解LPS對乳蛋白和乳脂的抑制作用，并抑制細胞上清液中脂質(zhì)氧化物的表達。但AS-Ⅳ如何通過影響mTOR信號通路中關(guān)鍵因子的表達，從而影響乳脂及乳蛋白的合成；在不同時間點，細胞對AS-Ⅳ的吸收量不變，但是不同時間點對CSN1S1、FASN、ACC、SCD、LPL、LPO的響應(yīng)不同的原因和機制尚不明確，具體機制仍需進一步試驗深入研究。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)環(huán)境下，LPS刺激BMECs會抑制細胞中乳脂及乳蛋白合成相關(guān)基因的表達，激活脂質(zhì)過氧化物MDA及LPO的產(chǎn)生。AS-Ⅳ可提高炎癥細胞中FABP3、ACC、FASN、PPARγ、LPL、SCD、CSN2基因相對表達量，降低炎癥細胞上清液中MDA、LPO含量，從而起到保護細胞的作用；AS-Ⅳ可通過激活mTOR信號通路，調(diào)節(jié)乳脂及乳蛋白合成關(guān)鍵調(diào)控基因的表達。

圖8 BMECs對ASIV-CDFA的攝取Fig.8 Uptake of ASIV-CDFA by BMECs