劉 韜 潘韻超 夏 燕 楊培江 華雪銘*

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；4.九江大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司，九江 332000；5.上海市奉賢區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 201499；6.上海市奉賢區(qū)奉城鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，上海 201411)

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在過(guò)去的10年間發(fā)展迅猛，高強(qiáng)度的養(yǎng)殖對(duì)飼料資源的要求隨之增加，水產(chǎn)動(dòng)物飼料蛋白質(zhì)原料資源短缺問(wèn)題愈演愈烈。魚粉因其高含量的蛋白質(zhì)、平衡且齊全的氨基酸、豐富的微量元素等營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)成為了水產(chǎn)動(dòng)物飼料中最主要的蛋白質(zhì)源，但近年來(lái)隨著海洋漁業(yè)資源短缺，其價(jià)位不斷攀升，魚粉的各種摻假等問(wèn)題也頻繁出現(xiàn)，各大飼料企業(yè)和研究人員為了尋求更低的飼料成本正著力研究各種魚粉替代物，其大致可分為兩大類：動(dòng)物性蛋白質(zhì)源和植物性蛋白質(zhì)源。豆粕因其來(lái)源廣泛，價(jià)位較低，是魚粉替代物的優(yōu)選對(duì)象，但豆粕中不平衡的氨基酸和各種抗?fàn)I養(yǎng)因子嚴(yán)重地影響了水產(chǎn)動(dòng)物的健康，進(jìn)而限制其在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的廣泛應(yīng)用。而發(fā)酵豆粕相較于豆粕擁有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、更低的抗?fàn)I養(yǎng)因子、更平衡的氨基酸等特點(diǎn)，越來(lái)越受到飼料研究者的青睞。但相較于魚粉，發(fā)酵豆粕氨基酸平衡性較差，精氨酸就是其中一種含量偏低的氨基酸。

精氨酸是機(jī)體蛋白質(zhì)的組成成分，也參與機(jī)體內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)等[1]。精氨酸代謝產(chǎn)生的一氧化氮合成酶(NOS)促進(jìn)一氧化氮(NO)生成，而NO自由基既能協(xié)助巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中對(duì)抗病原體，又是多種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子。有研究表明，在利用去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的植物蛋白質(zhì)源替代魚粉時(shí)，添加晶體或包膜氨基酸可顯著提高替代效果[2-3]。研究也發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加精氨酸能提高魚類溶菌酶(LZM)活性，增強(qiáng)殺菌能力，提高免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)，減少免疫應(yīng)答時(shí)的自我損傷等[4-8]。

Toll樣受體(TLRs)、免疫缺陷(IMD)和LZM基因的表達(dá)量是對(duì)蝦免疫、健康能力的關(guān)鍵性指標(biāo)。TLRs作為參與天然免疫的主要模式識(shí)別受體(PRR)，在其信號(hào)通路被激活后能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，有利于機(jī)體抵抗病原微生物的感染，尤其是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌的刺激。髓樣分化因子88(mmyeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLRs通路的下游效應(yīng)因子，其表達(dá)水平直接表示機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的程度。IMD途徑是對(duì)蝦另一個(gè)重要免疫識(shí)別信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要響應(yīng)革蘭氏陰性細(xì)菌的入侵[9]。轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是氨基酸營(yíng)養(yǎng)感知和代謝途徑氨基酸應(yīng)答信號(hào)(amino acid response signal transduction pathway，AAR)通路中的關(guān)鍵基因，當(dāng)必需氨基酸缺乏時(shí)，ATF4基因表達(dá)上調(diào)。對(duì)于精氨酸是否通過(guò)上述基因調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫和蛋白質(zhì)代謝尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

目前，凡納濱對(duì)蝦的營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究主要集中在蛋白質(zhì)[10]、脂肪[11-12]、糖類[13]、維生素[14]等方面，雖有不少關(guān)于晶體氨基酸添加效果的報(bào)道[15-16]，但關(guān)于凡納濱對(duì)蝦對(duì)精氨酸需求量的研究相對(duì)較少。曾雯娉[17]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦幼蝦對(duì)精氨酸的需求量為2.16%(蛋白質(zhì)含量5.27%)。黃凱等[18]研究認(rèn)為，凡納濱對(duì)蝦幼蝦需要2.43%的精氨酸才能滿足其正常生長(zhǎng)。由于不同的飼料組成會(huì)影響對(duì)蝦對(duì)氨基酸的利用，因而為了達(dá)到精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)的目的，減少飼料浪費(fèi)，節(jié)約養(yǎng)殖成本，有必要重新評(píng)估在發(fā)酵豆粕替代魚粉后凡納濱對(duì)蝦對(duì)精氨酸的需求量。因此，本試驗(yàn)主要根據(jù)生長(zhǎng)性能、生理生化和抗應(yīng)激能力評(píng)估精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦的作用效果，通過(guò)檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦鰓中TLR、LZM、IMD和肝胰腺中MyD88、ATF4基因相對(duì)表達(dá)量來(lái)探索精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制，為發(fā)酵豆粕替代魚粉時(shí)飼料中合理添加精氨酸提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以凡納濱對(duì)蝦[初重(0.62±0.10) g]為研究對(duì)象，在前期獲得發(fā)酵豆粕對(duì)魚粉最適替代量[19]的基礎(chǔ)上，以魚粉(22.53%)和發(fā)酵豆粕(10.00%)為主要蛋白質(zhì)源，且根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[17]以及水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)植物蛋白質(zhì)源性氨基酸利用率較低的情況，本試驗(yàn)在精氨酸水平為1.98%的基礎(chǔ)飼料中，分別添加0(A00組)、0.2%(A02組)、0.4%(A04組)、0.6%(A06組)、0.8%(A08組)的晶體L-精氨酸(有效含量為98%)，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items飼料DietsA00A02A04A06A08面粉Wheatflour22.1921.9921.7921.5921.39血球蛋白粉Spray-driedbloodcellmeal3.993.993.993.993.99魚油Fishoil4.004.004.004.004.00烏賊膏Squidvisceralointment3.503.503.503.503.50啤酒酵母Brewer’syeast4.994.994.994.994.99維生素預(yù)混料Vitaminpremix1)0.800.800.800.800.80礦物質(zhì)預(yù)混料Mineralpremix2)0.700.700.700.700.70磷酸二氫鈣Ca(H2PO4)20.300.300.300.300.30晶體精氨酸Crystallinearginine(98%)0.200.400.600.80合計(jì)Total100.00100.00100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平Nutrientlevels3)粗蛋白質(zhì)CP40.4440.4240.4040.3840.36粗脂肪EE7.347.347.347.337.33總能GE/(MJ/kg)4)17.7617.7317.7017.6717.64精氨酸Arg1.982.182.372.572.76

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖飼料在上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地進(jìn)行，挑選初始均重為(0.62±0.10) g的健康凡納濱對(duì)蝦1 000尾，平均分成5組，每組4個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)蝦飼養(yǎng)于室內(nèi)水泥池網(wǎng)箱(1.90 m×1.25 m×1.00 m)中，每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)50尾，共20個(gè)網(wǎng)箱。試驗(yàn)前所有網(wǎng)箱和池子均作消毒處理，試驗(yàn)蝦先暫養(yǎng)1周，稱初始體重后分組。采用限量投喂，初期投喂率為體重的8%，后期6%，投飼時(shí)間分別為06:00、10:30、16:30、22:00。養(yǎng)殖周期為60 d，每周根據(jù)對(duì)蝦生長(zhǎng)狀況相應(yīng)調(diào)節(jié)投飼量。養(yǎng)殖期間水溫為24～32 ℃，氨氮含量<0.3 mg/L，pH=8.0±0.2，溶解氧含量>5 mg/L，24 h連續(xù)充氧。每2 d換1次水，保證水質(zhì)環(huán)境正常。

1.3 樣品采集

在養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有對(duì)蝦經(jīng)過(guò)24 h饑餓處理后計(jì)數(shù)并稱重。另從每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取10尾蝦，抽取血淋巴液于1.5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置過(guò)夜后12 000 r/min離心15 min，取上清液于離心管中-20 ℃保存，用于后續(xù)血清生化指標(biāo)的檢測(cè)；去殼取其肌肉和肝胰腺于-20 ℃保存，用于測(cè)定肌肉營(yíng)養(yǎng)成分及肝胰腺生化指標(biāo)。同時(shí)取對(duì)蝦鰓組織用于測(cè)定TLR、LZM、IMD的基因相對(duì)表達(dá)量，取肝胰腺用于測(cè)定MyD88、ATF4基因相對(duì)表達(dá)量，樣品置于液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。

1.4 樣品檢測(cè)

肌肉常規(guī)檢測(cè)參照AOAC(1984)[20]的方法：其中粗灰分含量在550 ℃馬弗爐中測(cè)定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定，粗脂肪含量采用氯仿甲醇法測(cè)定。

肝胰腺及血清生化指標(biāo)：肝胰腺中的丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性，血清中的總蛋白(TP)含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、一氧化氮合成酶(NOS)活性按照南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

免疫相關(guān)基因表達(dá)：測(cè)定低水平(A00)、中等水平(A04)和高水平(A08)精氨酸組腮中LZM、TLR、IMD[19]及肝胰腺中MyD88、ATF4基因相對(duì)表達(dá)量，設(shè)置參照基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，基因引物序列見(jiàn)表2。ABI PRISM?7900 Sequence Detection System具體反應(yīng)程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算法進(jìn)行相對(duì)定量。

表2 基因引物序列Table 2 Primer sequence of genes

1.5 低氧應(yīng)激試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取9尾體重相似且經(jīng)24 h饑餓處理、健康的對(duì)蝦進(jìn)行低氧脅迫試驗(yàn)。每次取3尾對(duì)蝦放于3 L的錐形瓶中，將溶氧儀探頭放入錐形瓶記錄初始溶氧含量后，用液體石蠟封住瓶口，每30 min記錄1次溶氧含量，直到全部對(duì)蝦死亡后結(jié)束。記錄從第1尾蝦死亡到最后1尾蝦死亡的累計(jì)時(shí)間，即為死亡耗時(shí)。試驗(yàn)分批進(jìn)行，每次試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)錐形瓶進(jìn)行清洗換水，以消除批次試驗(yàn)之間的影響。

1.6 體外血清弧菌感染

將培養(yǎng)好的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)稀釋至最適濃度后，取100 μL菌液加入96孔板，并加入等體積的血清，以只加入血清的微孔作為陰性對(duì)照，以只加入細(xì)菌稀釋液的微孔作為陽(yáng)性對(duì)照組，置于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，在600 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(OD)值，每2 h讀取1次數(shù)據(jù)，以達(dá)到穩(wěn)定期的菌懸液OD值進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)Sunyer等[21]方法修改得到的計(jì)算公式為：

抗弧菌能力(%)=[1-(OD2-OD1)/OD0]×100。

式中：OD0、OD1、OD2分別為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及試驗(yàn)組OD值。

1.7 結(jié)果計(jì)算

增重率(WGR,%)=100×(終末體重-初始體重)/初始體重；特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/投喂天數(shù)；成活率(SG,%)=100×試驗(yàn)結(jié)束時(shí)尾數(shù)/試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)尾數(shù)；飼料系數(shù)(FCR)=飼料攝食量/(終末總重+死亡體重-初始總重)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05即認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能及肌肉成分的影響

由表3可知，5組間成活率和飼料系數(shù)皆無(wú)顯著差異(P>0.05)，增重率和特定生長(zhǎng)率在A02組出現(xiàn)最大值，其次為A08組，但2組差異不顯著(P>0.05)。

由表4可知，肌肉水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量在各組間并無(wú)顯著差異(P>0.05)，粗脂肪含量在A02組最低，顯著低于A00組(P<0.05)。

表3 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects of different levels of arginine on growth performance of L.vannamei

表4 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉成分的影響(干重)Table 4 Effects of different levels of arginine on muscle composition of L.vannamei.(dry basis) %

2.2 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺生化指標(biāo)的影響

由表5可知，肝胰腺M(fèi)DA含量最低值出現(xiàn)在A02組，肝胰腺SOD活性在A02組最高且顯著高于其他組(P<0.05)；血清MDA含量在5組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但A02組血清AST、ALT活性顯著高于其他組(P<0.05)，A08組處于最低值，A06組血清NOS活性顯著高于A02組(P<0.05)。

表5 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of different levels of arginine on biochemical indexes in serum and hepatopancreas of L.vannamei.

2.3 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗應(yīng)激能力的影響

凡納濱對(duì)蝦的耐低氧能力除A04組和A08組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)外，其余組之間差異顯著(P<0.05)，A00組最弱，A02組最強(qiáng)(圖1)?？够【芰﹄S精氨酸添加水平升高呈現(xiàn)先增強(qiáng)后變?nèi)醯内厔?shì)，峰值出現(xiàn)在A04組(圖2)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value bars with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦耐低氧能力影響Fig.1 Effects of different levels of arginine on low oxygen tolerance of L.vannamei.

圖2 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦體外血清抗弧菌能力的影響Fig.2 Effects of different levels of arginine on anti-vibiro ability in vitro serum of L.vannamei.

2.4 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于A02組肝胰腺受損的風(fēng)險(xiǎn)最大，A06組體外血清抗弧菌能力和耐低氧能力在4個(gè)氨基酸添加組中最弱，因此選擇A00組、A04組、A08組進(jìn)行免疫基因的表達(dá)分析。由圖3和圖4可知，A04組鰓IMD、LZM和肝胰腺M(fèi)yD88基因相對(duì)表達(dá)量皆為最低，顯著低于A00組(P<0.05)，鰓TLR基因相對(duì)表達(dá)量隨著精氨酸添加水平升高而顯著降低(P<0.05)，肝胰腺ATF4基因相對(duì)表達(dá)量在A00組最低。

圖3 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦鰓基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different levels of arginine on gene expression in gills of L.vannamei.

圖4 不同水平精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different levels of arginine on gene expression in hepatopancreas of L. vannamei.

3 討 論

精氨酸對(duì)陸生動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響已有較多研究，閆偉[22]研究發(fā)現(xiàn)，鵝飼糧中適量增加精氨酸可以提高免疫反應(yīng)能力和法氏囊指數(shù)。Lieboldt等[23]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧精氨酸水平影響仔雞淋巴器官的發(fā)育，水平過(guò)低時(shí)會(huì)導(dǎo)致仔雞的胸腺和脾臟發(fā)育遲緩。近年來(lái)圍繞水產(chǎn)動(dòng)物飼料精氨酸的研究也不斷被學(xué)者關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalunespunctatus)等飼料缺少精氨酸時(shí)會(huì)造成魚體生長(zhǎng)緩慢、魚鰭腐爛等現(xiàn)象[24]；適量精氨酸則能改善魚類的腸道組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用[25]。但過(guò)多的精氨酸也會(huì)限制草魚(Ctenopharyngodonidellus)、建鯉(Cyprinuscarpiovarvar.Jian)、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)的生長(zhǎng)和飼料的利用[26-28]，Kaushik等[29]認(rèn)為高比例的精氨酸與賴氨酸發(fā)生的拮抗作用會(huì)使機(jī)體內(nèi)部受到應(yīng)激從而導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵豆粕替代魚粉后，飼料精氨酸水平在1.98%～2.76%不會(huì)影響對(duì)蝦的存活率，添加0.2%的晶體精氨酸，即飼料精氨酸水平達(dá)到2.18%時(shí)對(duì)蝦增重率和特定生長(zhǎng)率最大，而此時(shí)肌肉中粗脂肪含量最低。有研究表明，精氨酸缺乏會(huì)降低魚類蛋白質(zhì)沉積率[30]；補(bǔ)充精氨酸能夠激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路進(jìn)行蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，并通過(guò)降低脂肪沉積，增加瘦肉率來(lái)調(diào)控機(jī)體能量的分配[31]。從以上文獻(xiàn)結(jié)論和試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，精氨酸可通過(guò)調(diào)控肌肉中的脂肪代謝來(lái)影響對(duì)蝦生長(zhǎng)性能。但本試驗(yàn)中對(duì)蝦生長(zhǎng)性能并未隨著飼料精氨酸水平的增加而下降，因此有必要結(jié)合對(duì)蝦機(jī)體健康程度以及免疫能力來(lái)綜合評(píng)估發(fā)酵豆粕替代魚粉時(shí)精氨酸的最適添加水平。

凡納濱對(duì)蝦免疫系統(tǒng)與魚類不同，以先天免疫為主，體液中沒(méi)有免疫球蛋白，是無(wú)抗體介導(dǎo)的非特異性免疫反應(yīng)，主要依靠血清中的一些免疫酶[32]。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸能顯著提高草魚鰓組織超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽硫基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性及谷胱甘肽(GSH)含量[33]；朱春華等[34]發(fā)現(xiàn)，L-精氨酸能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦NOS活性，血清中SOD和酸性磷酸酶(ACP)活性在中等劑量L-精氨酸(1%)組中顯著提高，在高劑量(1.5%)和低劑量L-精氨酸(0.5%)組無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較低水平的精氨酸添加組(A02組)雖然降低了肝胰腺M(fèi)DA含量，但AST和ALT活性顯著高于其他組，說(shuō)明其肝胰腺的損傷風(fēng)險(xiǎn)要高于其他組；在高添加水平組(A08組)中不管是表示肝胰臟損傷程度的AST和ALT活性、MDA含量，還是提高NO合成的NOS活性，均表現(xiàn)出比其他組更有利于對(duì)蝦健康的一面。

對(duì)蝦疾病主要來(lái)自對(duì)蝦白斑病毒(WSSV)和弧菌感染，冀培豐[35]用WSSV病毒刺激對(duì)蝦后，發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦血細(xì)胞和肝胰腺中NOS基因表達(dá)量和酶活性都顯著下降，說(shuō)明在對(duì)蝦受到病毒或細(xì)菌感染時(shí)其抗應(yīng)激能力和免疫機(jī)能明顯下降，NOS活性高低可以體現(xiàn)出對(duì)蝦受細(xì)菌或病毒感染的程度。本試驗(yàn)通過(guò)體外血清弧菌感染試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證精氨酸是否對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗菌能力產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，A04組抗菌能力最強(qiáng)，A06組最低，抗菌能力有隨著精氨酸添加水平先升后降的趨勢(shì)，表明過(guò)高的精氨酸水平對(duì)對(duì)蝦的抗菌能力有負(fù)向作用。結(jié)合血清NOS活性結(jié)果來(lái)看，NOS活性有隨著飼料精氨酸水平增加而先降后增的趨勢(shì)，A06組血清NOS活性最高，但抗菌能力卻最弱，并未表現(xiàn)出NOS活性越高，抗菌能力越強(qiáng)的結(jié)果，故血清中NOS活性是否能體現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦抗菌能力還有待進(jìn)一步研究。低溶解氧是重要的環(huán)境脅迫因子，易引起水產(chǎn)動(dòng)物死亡。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提高飼料精氨酸水平有助于增強(qiáng)對(duì)蝦的耐低氧能力。有研究表明，在急性缺氧時(shí)，機(jī)體發(fā)生—系列病理生理變化，其中包括NO釋放抑制、內(nèi)皮素釋放增加[36]。精氨酸是NO合成的前體物質(zhì)，因而在飼料中添加精氨酸，可能通過(guò)增加體內(nèi)NO的合成量來(lái)緩解缺氧產(chǎn)生的毒性。

精氨酸另一個(gè)重要的作用是調(diào)控炎癥因子。白細(xì)胞介素-8(IL-8)是誘發(fā)炎癥的主要因子，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠降低大西洋鮭(SalmosalarL.)和草魚頭腎組織中IL-8的表達(dá)量，進(jìn)而降低其體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；類似的結(jié)果在建鯉上也有所報(bào)道[7-8,37]。對(duì)于精氨酸調(diào)控免疫因子的機(jī)制，普遍認(rèn)為有2種途徑，即胰島素-磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)/蛋白激酶B(PKB)信號(hào)途徑和Toll樣受體4(TLR4)通路MyD88依賴途徑。胰島素是TLRs的激活物質(zhì)，MyD88是炎癥免疫應(yīng)答通路的關(guān)鍵基因；此外，精氨酸能夠影響魚類LZM基因表達(dá)[5]。IMD是對(duì)蝦體內(nèi)先天免疫調(diào)節(jié)的重要免疫基因[38]，研究發(fā)現(xiàn)在凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中，IMD基因能夠被WSSV誘導(dǎo)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[39]，說(shuō)明蝦類IMD基因與免疫功能相關(guān)。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)低水平(A00組)、中等水平(A04組)和高水平(A08組)精氨酸組對(duì)蝦以上幾種基因的表達(dá)量后，發(fā)現(xiàn)中等水平的精氨酸添加組肝胰腺M(fèi)yD88基因相對(duì)表達(dá)量最低，說(shuō)明在該精氨酸水平下對(duì)蝦的炎癥反應(yīng)最小，此時(shí)鰓中IMD與LZM基因相對(duì)表達(dá)量最低，鰓中TLR基因相對(duì)表達(dá)量相比對(duì)照組(A00組)也顯著下調(diào)，說(shuō)明機(jī)體不需要通過(guò)增強(qiáng)免疫應(yīng)答應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)；而高水平精氨酸能提高對(duì)蝦肝胰腺中MyD88基因相對(duì)表達(dá)量，存在引起對(duì)蝦炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。ATF4是氨基酸營(yíng)養(yǎng)感知和代謝途徑氨基酸應(yīng)答信號(hào)(AAR)通路中的關(guān)鍵基因，當(dāng)必需氨基酸缺乏時(shí)，ATF4基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)氨基酸的合成與吸收，保證正常的生理機(jī)能[40]。但本試驗(yàn)結(jié)果表明，低水平精氨酸組肝胰腺中ATF4基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于另外2組，說(shuō)明在低精氨酸水平條件下，凡納濱對(duì)蝦對(duì)氨基酸的合成與吸收能力非常有限，可能因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給不足影響對(duì)蝦抗菌、保護(hù)機(jī)體自身健康等作用的正常發(fā)揮。

4 結(jié) 論

當(dāng)飼料中精氨酸水平在2.18%時(shí)，能顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能；當(dāng)飼料中精氨酸水平在2.37%時(shí)，對(duì)肝胰腺健康以及耐低氧和抗弧菌感染能力在轉(zhuǎn)錄水平的免疫調(diào)控能力更有優(yōu)勢(shì)，建議將2.37%作為魚粉用量為22.53%、發(fā)酵豆粕用量為10.00%時(shí)的飼料精氨酸添加水平。