莘 余 呂尚揆* 尤留超 樊 磊 張 瓊 蘇柘僮 曹隨忠 余樹民 沈留紅**

(1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，奶牛疾病研究中心，成都 611130；2.廣西英路維特藥物有限公司，荔浦 546600)

犢牛生長發(fā)育和健康狀況直接影響其生產性能，關乎養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，但斷奶前犢牛機體抵抗力弱，易受外界刺激而發(fā)生疾病[1]。因此，增強犢牛抵抗力，降低發(fā)病率，提高其生產性能，一直是養(yǎng)牛業(yè)追求的目標?？股乜捎行ПＵ蟿游锝】担斐傻乃幬餁埩粢约拔：娊】档葐栴}不容忽視。在養(yǎng)殖業(yè)減抗、禁抗背景下，尋求天然、無抗、無殘留、促生長的飼料添加劑具有重要意義[2]。多糖類、多酚類、皂苷類和氨基酸類[3]等天然植物提取物具有提高動物機體抗氧化活性[4]、促進腸道發(fā)育、增強機體免疫等作用[5]，進而改善其生長性能，被廣泛應用于動物生產[6-7]。研究表明，酵母多糖可促進犢牛的生長發(fā)育和營養(yǎng)物質的消化吸收[8]；枸杞多糖可顯著增強肉牛機體抗氧化能力，提高平均日增重[9]；植物水解單寧可有效提高秦川牛對蛋白質吸收能力，增強免疫力，改善瘤胃微生物區(qū)系[10]。葛根多糖作為葛根天然成分，具有抗氧化[11]、抗菌[12]和調節(jié)免疫[13]等作用，可恢復結腸炎小鼠受損緊密連接蛋白表達水平和結構，恢復腸道屏障功能[14]，還可上調腹瀉小鼠腸道有益菌水平，改善菌群結構[15]。目前，葛根多糖在犢牛上的應用鮮有報導。因此，本研究旨在探究葛根多糖對健康犢?；A臨床、生理生化指標及血漿代謝物的影響，為其在犢牛生產中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用葛根多糖(純度50.00%，平均分子質量1.09×105u)由廣西某藥物有限公司提供。

1.2 試驗動物與試驗設計

選擇四川某規(guī)模化牧場臨床檢查健康，年齡[(6.20±3.65) d]和體重[(47.09±4.50) kg]相近的荷斯坦犢牛24頭，隨機分為對照組(C組)和試驗組(E組)，每組12頭。參考相關文獻[16]并經(jīng)預試驗(每天每頭牛在牛奶中添加200、400、800 mg/kg葛根多糖，連續(xù)5 d，觀察至21 d，期間犢牛腹瀉率分別為1.19%、0、0)確定，E組每天每頭牛在牛奶中添加400 mg/kg葛根多糖，C組不添加。連續(xù)飼喂5 d，并持續(xù)觀察21 d。為確保全量攝入，先將葛根多糖溶于少量牛奶，待犢牛吃完后再飼喂剩余部分牛奶。

1.3 飼養(yǎng)管理

所有犢牛單籠飼養(yǎng)，出生后稱重，30～120 min內飼喂初乳4 L，3日齡提供自由飲水，7日齡提供干草和犢牛開食料；3周齡內，飼喂常乳2次/d，每次4 L。定期清理消毒，所有試驗犢牛均無既往病史和用藥史。犢牛開食料營養(yǎng)水平見表1。

表1 犢牛開食料營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Nutrient levels of calves starter (DM basis) %

1.4 樣品采集及指標測定

1.4.1 基礎臨床指標測定

每日飼喂前測定試驗第1～7天各組犢牛直腸溫度、心率、呼吸頻率。

1.4.2 體重及腹瀉率測定

試驗開始前、第7天、第14天和第21天對犢牛體重進行測定，統(tǒng)計腹瀉犢牛數(shù)并計算腹瀉率，計算公式如下：

腹瀉率(%)=100×(總腹瀉頭數(shù)×總腹瀉天數(shù))/(總頭數(shù)×試驗天數(shù))。

1.4.3 血液樣品采集及處理

在試驗第1天、第3天、第5天和第7天飼喂前分別采集各試驗犢牛頸靜脈血，添加乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，獲得犢牛血漿樣品；無抗凝血樣室溫靜置1 h，3 000 r/min離心5 min，獲得犢牛血清樣品。部分第7天血漿樣品置于-80 ℃保存，用于后續(xù)血漿代謝物檢測與分析。

1.4.4 血常規(guī)及血清生化指標檢測

分別使用IDEXX Procyte Dx全自動五分類血細胞分析儀和斯馬特全自動生化分析儀檢測各組犢牛第1天、第3天、第5天和第7天血常規(guī)指標和血清生化指標。

1.4.5 血漿代謝物檢測與分析

將-80 ℃的血漿樣品復融，吸取適量樣本加入預冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，體積比)，渦旋混勻，超聲30 min(冰水浴)，-20 ℃靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用Agilent 1 290 Infinity LC超高效液相色譜儀進行物質分離，在AB 6 600 Triple TOF質譜儀下基于IDA采集模式進行一級、二級質譜數(shù)據(jù)的采集。采集條件如下：轟擊能量為(35±15) ev，每50 ms采集15張二級譜圖。電噴霧離子源(ESI)參數(shù)設置如下：霧化氣壓(GSI)、輔助氣壓及氣簾氣壓分別為60、60、30 psi；溫度為600 ℃，噴霧電壓為5 500 V(正離子模式)和-5 500 V(負離子模式)。

使用ProteoWizard軟件將原始質譜轉成mzXML格式，XCMS保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，并使用二級質譜數(shù)據(jù)庫對峰進行物質鑒定。然后進行正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，獲得變量重要性投影(VIP)。差異代謝物篩選條件為變異倍數(shù)(FC)>1.5或FC<0.67，VIP>1和P<0.05。將篩選到的差異代謝物導入KEGG數(shù)據(jù)庫，注釋到差異代謝物相關的代謝通路，最后通過MetaboAnalyst 5.0在線數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和LSD法多重比較，統(tǒng)計結果用平均值±標準差表示，以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 葛根多糖對健康犢?；A臨床指標的影響

由表2可知，試驗第1～7天，C組與E組之間犢牛體溫、心率和呼吸頻率均無顯著差異(P>0.05)。

表2 葛根多糖對健康犢?；A臨床指標的影響Table 2 Effects of Pueraria polysaccharides on basic clinical indices of healthy calves

2.2 葛根多糖對犢牛體重和腹瀉率的影響

由表3可知，試驗第1～7天、第8～14天、第15～21天，C組與E組之間犢牛體重無顯著差異(P>0.05)，但各時間段E組犢牛體重均高于C組。這說明飼喂葛根多糖對犢牛后續(xù)生長具有一定的促進作用。

由表4可知，試驗第1～7天，C組和E組犢牛無腹瀉。試驗第8～21天，C組有3頭犢牛腹瀉，腹瀉率為5.36%；E組犢牛無腹瀉，腹瀉率為0。這說明葛根多糖具有預防犢牛腹瀉的作用。

表3 葛根多糖對健康犢牛體重的影響Table 3 Effects of Pueraria polysaccharides on body weight of healthy calves kg

表4 葛根多糖對健康犢牛腹瀉率的影響Table 4 Effects of Pueraria polysaccharides on diarrhea rate of healthy calves

2.3 葛根多糖對健康犢牛血常規(guī)指標的影響

由表5可知，C組與E組之間犢牛血常規(guī)指標均無顯著差異(P>0.05)。這說明添加400 mg/kg葛根多糖對犢牛血常規(guī)指標無明顯影響。

表5 葛根多糖對健康犢牛血常規(guī)指標的影響Table 5 Effects of Pueraria polysaccharides on blood routine indices of healthy calves

2.4 葛根多糖對健康犢牛血清生化指標的影響

由表6可知，C組與E組之間犢牛血清生化指標均無顯著差異(P>0.05)。這說明添加400 mg/kg葛根多糖對犢牛血清生化指標無明顯影響。

2.5 代謝組學的多元統(tǒng)計分析

使用有監(jiān)督的模式識別方法OPLS-DA對數(shù)據(jù)模型可靠性進行分析。如圖1-A所示，在正離子模式下R2Y=0.775；如圖1-B所示，在負離子模式下R2Y=0.90，表明模型建立較好，所獲得的數(shù)據(jù)可用于進一步分析。采用置換檢驗對模型進行過擬合檢驗，圖1-C、圖1-D顯示了在正負離子模式下，模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定性良好。

2.6 血漿差異代謝物分析

在正、負離子模式下，共檢測到14種差異代謝物。由表7可知，血漿溶血磷脂酰膽堿18∶0、膽綠素等10種代謝物豐度顯著下調(P<0.05)，血漿二酰甘油、瓜氨酸、N-乙酰腐胺和次黃嘌呤4種代謝物豐度顯著上調(P<0.05)。對血漿差異代謝物進行分類，發(fā)現(xiàn)共涉及苯類、二肽、脂質、脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機化合物、有機氧化合物、有機雜環(huán)化合物和未分類代謝物(圖2-A)。進一步篩選出葛根多糖影響健康犢牛的關鍵血漿代謝物，即二酰甘油、次黃嘌呤、瓜氨酸和溶血磷脂酰膽堿18∶0(圖2-B)。

表6 葛根多糖對健康犢牛血清生化指標的影響Table 6 Effects of Pueraria polysaccharides on serum biochemical indices of healthy calves

2.7 血漿差異代謝物途徑分析

利用Metaboanalyst通路富集分析功能，對血漿差異代謝物進行通路富集分析。如圖3所示，上述差異代謝物共涉及精氨酸和脯氨酸代謝，精氨酸生物合成，卟啉代謝，甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸代謝，甘油磷酸脂代謝和嘌呤代謝6條代謝通路。與飼喂葛根多糖的健康犢牛血漿代謝物改變最為相關的是精氨酸和脯氨酸代謝(P<0.05)。

3 討 論

3.1 葛根多糖對健康犢牛主要臨床指標、血常規(guī)和血清生化指標的影響

體溫、心率和呼吸頻率等臨床指標常用于評估機體健康[17]，血常規(guī)和血清生化指標同樣也被普遍用于評價動物健康狀況，其中血常規(guī)指標是衡量機體生理健康狀態(tài)和疾病嚴重程度的重要依據(jù)[18]，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)均是反映肝臟功能的可靠指標[19]，肌酐(CREA)和尿素氮(UN)是反映蛋白質代謝和腎功能的重要指標[20]，球蛋白包含大量炎癥反應蛋白，與機體炎癥狀態(tài)密切相關[21]。本試驗中，試驗組犢牛連續(xù)5 d飼喂葛根多糖，體溫、心率、呼吸頻率較對照組犢牛無顯著變化。結合血常規(guī)和血清生化指標檢測結果發(fā)現(xiàn)，葛根多糖同樣也沒有對試驗犢牛產生顯著影響。由此可見，每天每頭牛在牛奶中添加400 mg/kg葛根多糖對健康犢牛無明顯臨床副作用。

3.2 葛根多糖對健康犢牛血漿代謝物的影響

多糖通過調節(jié)機體代謝發(fā)揮抗氧化，降低炎癥反應等作用[22-24]。本研究中，健康犢牛飼喂葛根多糖后血漿二酰甘油、瓜氨酸和次黃嘌呤等豐度顯著升高。研究表明，二酰甘油可抑制膽汁酸的分泌，并參與氧化應激下腸道損傷的修復，用于治療腹瀉[25]。此外，二酰甘油還是多種信號分子的有效激活劑，是維持細胞間信息傳遞的關鍵物質[26]。二酰甘油參與了犢牛機體多種信號調節(jié)，其豐度的增加有利于健康犢牛生長發(fā)育。瓜氨酸是一種非必需氨基酸，在精氨酸琥珀酸裂解酶催化下轉化為精氨酸[27]。本試驗發(fā)現(xiàn)，牛奶中添加葛根多糖上調了瓜氨酸參與的精氨酸生物合成通路，而精氨酸作為新生犢牛生長過程中的一種條件性必需氨基酸[28]，除在蛋白質合成中起作用外，還是一氧化氮(NO)和多胺合成的常見底物，從而滿足腸道細胞增殖的關鍵調控作用[29]，且研究表明精氨酸具有促進犢牛腸道發(fā)育的作用[30]。雖然在檢測到的差異代謝物中并沒有精氨酸，但飼喂葛根多糖后上調了瓜氨酸的水平及其參與的精氨酸生物合成通路。并且，在試驗第8～21天，對照組犢牛有3頭發(fā)生了腹瀉，而試驗組犢牛在試驗期間未發(fā)生腹瀉。由此可推斷，葛根多糖可能通過促進健康犢牛腸道發(fā)育，從而預防了犢牛腹瀉。而次黃嘌呤可調節(jié)腸道上皮細胞能量代謝，改善腸道屏障功能并促進傷口愈合[31]。通過以上結果表明，葛根多糖具有提高機體抗氧化能力、促進腸道發(fā)育的作用，從而防止犢牛腹瀉。

A、C為正離子模式下所得結果，B、D為負離子模式下所得結果。A and C were the result from ESI+, and B and D were the result from ESI-.圖1 OPLS-DA得分圖Fig.1 OPLS-DA scores graphs

表7 2組之間血漿差異代謝物Table 7 Plasma differential metabolites between two groups

續(xù)表7項目Items變量投影重量度VIPP值P-value差異倍數(shù)FC趨勢TrendN-乙酰腐胺N-acetylputrescine1.00<0.051.65↑肌酐Creatinine4.35<0.050.73↓N1,N12-二乙酰精胺N1,N12-diacetylspermine1.64<0.050.54↓L-山梨糖L-sorbose1.28<0.010.55↓次黃嘌呤Hypoxanthine2.26<0.056.34↑膽綠素Biliverdin1.33<0.050.37↓1-甲基假尿苷1-methylpseudouridine1.28<0.010.39↓

*代表差異顯著(P<0.05)。* mean significant difference (P<0.05).圖2 2組血漿差異代謝物FC值柱狀圖(A)和關鍵代謝物的log10峰值圖(B)Fig.2 FC value histogram of plasma differential metabolites (A) and key metabolite peaks figure of log10 (B) between 2 groups

此外，健康犢牛飼喂葛根多糖后溶血磷脂酰膽堿18∶0等差異代謝物下調。溶血磷脂酰膽堿是由細胞膜衍生的磷脂酰膽堿產生，具有調節(jié)免疫功能的作用[32]。體現(xiàn)為溶血磷脂酰膽堿促進單核細胞趨化增強，并激活巨噬細胞[33]等。相關研究表明，發(fā)生圍產期疾病的奶牛血漿代謝物中常出現(xiàn)溶血磷脂酰膽堿水平升高[34]。溶血磷脂酰膽堿18∶0水平顯著下調提示葛根多糖在調節(jié)健康犢牛免疫反應方面發(fā)揮作用。在哺乳動物中，膽綠素通過膽綠素還原酶還原為膽紅素[35]。膽紅素是一種抗氧化劑，具有清除活性氧作用，以保護細胞免受氧化損傷[36]。飼喂葛根多糖后膽綠素顯著下調，推測可能是葛根多糖促進了膽綠素還原為膽紅素，以增強健康犢牛機體的抗氧化能力。肌酸是一種含氮的有機酸，在肝臟、腎臟中由精氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸合成[37]。肌酸通過肌酸-磷酸肌酸系統(tǒng)，在肌酸激酶的催化下轉化為磷酸肌酸，為機體功能[38]。肌酸水平下調，表明葛根多糖可促進犢牛生長，增加犢牛機體的能量需求，從而加速肌酸代謝。而肌酐由肌肉組織中的肌酸及磷酸肌酸代謝而來[39]，隨肌酸減少同樣出現(xiàn)了下調趨勢。本試驗中，犢牛體重雖無顯著差異，但葛根多糖對健康犢牛體重升高的趨勢高于對照組，推測可能是由于飼喂葛根多糖的時間較短所致。后續(xù)可通過增加飼喂天數(shù)來探究葛根多糖對健康犢牛生產性能的影響。

x軸為富集系數(shù)，y軸為P值，圓圈代表代謝通路，圓圈顏色深淺表示代謝物通路中代謝物顯著性變化，圓圈大小與代謝物數(shù)相對應。The x axis is the rich factor, the y axis is P-value. The circle represents the metabolic pathway, the color depth of the circle indicates a significant change in metabolic pathway, and the circle size corresponds metabolites number.圖3 血漿差異代謝物KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of plasma differential metabolites

4 結 論

葛根多糖對健康犢牛無明顯臨床副作用，可通過調節(jié)犢牛機體二酰甘油、瓜氨酸、溶血磷脂酰膽堿18∶0和膽綠素等代謝，促進腸道發(fā)育，增強機體抗氧化能力，降低機體炎性反應，從而減少犢牛腹瀉，促進犢牛生長。