陳 奇,宋協(xié)法??,周廣軍，薛致勇

(1.中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003；2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264034；3.海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 265122)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行期間生物濾池中硝化細(xì)菌的數(shù)量是動(dòng)態(tài)變化的，但影響其時(shí)空分布的主要環(huán)境因子目前尚未明確。本研究以雜交鱘(施氏鱘Acipenserschrenckii♀×西伯利亞鱘Acipenserbaerii♂)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的四級(jí)生物濾池為研究對(duì)象，運(yùn)用16S rRNA高通量測(cè)序手段研究微生物的群落結(jié)構(gòu)、種群穩(wěn)定性以及功能菌在生物濾池中所起的作用。探究循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池中微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物群落對(duì)水質(zhì)變化的響應(yīng)及生物濾池的運(yùn)行參數(shù)，為鱘魚及其他名貴魚類的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池的設(shè)計(jì)與運(yùn)行提供技術(shù)支撐和理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)位于山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司7號(hào)養(yǎng)殖車間，整個(gè)系統(tǒng)由9個(gè)養(yǎng)殖池(養(yǎng)殖面積50 m2，有效水深1 m)、轉(zhuǎn)鼓式微濾機(jī)、生物濾池、充氧池和紫外線殺菌消毒裝置等組成。養(yǎng)殖用水鹽度13，日補(bǔ)充水量約占總水量的15%，循環(huán)率為8次/d。生物濾池分為四級(jí)(1～4級(jí)生物濾池)，其中2級(jí)為MBBR，生物濾料為比表面積600 m2/m3的多孔塑料環(huán)，其余3級(jí)為固定床，生物濾料為比表面積316 m2/m3的立體彈性填料，均采用自然掛膜。

2019年6月開(kāi)始鱘魚養(yǎng)殖，初始養(yǎng)殖密度為42.5 kg/m3，鱘魚平均體長(zhǎng)為(74.58±4.24)cm、平均體質(zhì)量為(3.87±0.56)kg，魚體健康狀況良好。養(yǎng)殖過(guò)程中投喂鱘魚專用顆粒飼料(升索牌G8餌料，粗蛋白含量44%)，每天投餌2次，時(shí)間為7:30和16:30，日投喂量為魚體質(zhì)量的0.36%。

1.2 水質(zhì)檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)期間，每5天測(cè)定1次各級(jí)生物濾池進(jìn)、出水水質(zhì)。水溫、溶解氧、pH采用YSI多參數(shù)水質(zhì)分析儀于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；總氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮、化學(xué)需氧量等指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分：海水分析》(GB17378.4—2007)操作規(guī)范進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3次,結(jié)果取平均值。

1.3 樣品采集和高通量測(cè)序

將四級(jí)生物濾池按水流方向依次標(biāo)為A～D，并在實(shí)驗(yàn)第1、11、21、31、41天分別從4個(gè)濾池中以五點(diǎn)取樣法剪取濾料樣品，混合樣品約15 g分別放入編號(hào)A～D的50 mL取樣管中[8]，加40 mL無(wú)菌水后放入-80 ℃冰箱中保存，并將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina-MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 分析方法

使用Microsoft Excel和SPSS 26.0軟件對(duì)各級(jí)生物濾池的水質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和單因素方差分析。根據(jù)Index序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù)，將其以fasta格式保存，利用Qiime(version 1.9.1)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)并去除嵌合體序列[9]。利用Uparse軟件(version 7.0.1090)按照97%相似性進(jìn)行OTUs聚類(不含單序列)，形成OTUs列表[10]。用RDP Classifier(version 2.11)對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，在不同分類學(xué)水平上注釋其群落的物種信息[11]?；贠TU聚類的結(jié)果，利用R語(yǔ)言工具計(jì)算Shannon和Chao1指數(shù)[12]，對(duì)微生物群落與測(cè)定的各環(huán)境理化指標(biāo)進(jìn)行主成份分析(PCA)和冗余分析(RDA)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 四級(jí)生物濾池水處理性能及分析

實(shí)驗(yàn)期間，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定，四級(jí)生物濾池進(jìn)、出水的水質(zhì)參數(shù)如表1所示，生物濾池進(jìn)、出水的總氨氮濃度、COD濃度存在顯著性差異(P<0.05)，水溫18.2 ℃、溶解氧6.24 mg/L、pH 7.0。總氨氮、亞硝態(tài)氮和化學(xué)需氧量的去除率為60.23%、15.56%和33.77%。生物濾池總進(jìn)水與1、2、3級(jí)生物濾池出水的總氨氮濃度依次顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明前3級(jí)生物濾池對(duì)氨氮去除效果明顯；相反，3級(jí)生物濾池出水和生物濾池總出水總氨氮濃度相差不大，即4級(jí)生物濾池的氨氮去除率較差；而2級(jí)生物濾池出水COD濃度顯著低于1級(jí)生物濾池出水COD濃度(P<0.05)，說(shuō)明COD的去除主要發(fā)生在2級(jí)生物濾池。

2.1.1 總氨氮(TAN)去除率變化 生物濾池總進(jìn)水的TAN濃度為 0.209～0.369 mg/L，總出水的TAN濃度為0.047～0.164 mg/L，TAN總?cè)コ势骄鶠?0.23%(見(jiàn)圖1)，生物濾池可有效去除養(yǎng)殖水中的氨氮，且水質(zhì)穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。其中，1級(jí)生物濾池的TAN去除率為21.65%，占總?cè)コ实?6.81%；2級(jí)生物濾池的TAN去除率為24.74%，占總?cè)コ实?1.21%；3級(jí)生物濾池的TAN去除率為26.80%;占總?cè)コ实?6.00%；4級(jí)生物濾池的TAN去除率為9.5%，占總?cè)コ实?.98%。1、2、3級(jí)生物濾池對(duì)TAN的去除率顯著高于4級(jí)生物濾池(P<0.05，見(jiàn)表2)，4級(jí)生物濾池對(duì)TAN去除效果不明顯。

表1 各級(jí)生物濾池進(jìn)、出水的水質(zhì)參數(shù)Table 1 Water quality parameters of inlet and outlet water at all levels of biological filter

表2 各級(jí)生物濾池去除率Table 2 Removal rate of various biological filters %

2.1.4 COD去除率變化 生物濾池總進(jìn)、出水的COD濃度存在顯著性差異(P<0.05，見(jiàn)表1)，總進(jìn)水的COD濃度為2.43～4.43 mg/L，出水的COD為1.39～2.88 mg/L，去除率為33.77%。試驗(yàn)期間COD去除率變化如圖4所示。其中，1級(jí)生物濾池的COD去除率為-1.21%，2級(jí)生物濾池的COD去除率為25.18%，3級(jí)生物濾池的COD去除率為-11.49%，4級(jí)生物濾池的COD去除率為18.59%。2、4級(jí)生物濾池的COD去除率顯著高于1、3級(jí)生物濾池(P<0.05，見(jiàn)表2)，2、4級(jí)生物濾池的COD去除效果更明顯。

2.2 生物濾池微生物群落多樣性變化

2.2.1微生物群落多樣性指數(shù)變化 20個(gè)生物膜樣品均得到原始序列數(shù)和多樣性指數(shù)(見(jiàn)表3)，樣本覆蓋率(Coverage)為100%。通過(guò)比較5個(gè)時(shí)間點(diǎn)生物濾池的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，第3個(gè)時(shí)間點(diǎn)整個(gè)生物濾池平均Shannon指數(shù)為5.650，高于其他4個(gè)時(shí)期。微生物群落豐富度和多樣性在第3、4、5個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)依次降低。

表3 微生物群落多樣性指數(shù)Table 3 Microbial community diversity index

續(xù)表3

2.2.2 微生物群落組成變化 20個(gè)生物膜樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成相似(見(jiàn)圖5)，微生物主要隸屬于37個(gè)門，561個(gè)屬，926個(gè)種，其優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(Proteobacteria,19.4%～38.1%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,10.6%～27.3%)、綠彎菌門(Chloroflex，10.7%～21.1%)、浮霉菌門(Planctomycetes，3.9%～30.9%)、疣微菌門(Verrucomicrobiota，1.0%～12.1%)，其組成分布在門水平上與先前報(bào)道的結(jié)果相似[14-16]。

優(yōu)勢(shì)菌屬(見(jiàn)圖6)分別為：norank_f__AKYG1722(4.11%～9.31%)、unclassified_f__Rhodobacteraceae(3.21%～8.85%)、norank_f__Saprospiraceae(3.25%～9.63%)、norank_f__Caldilineaceae(0.97%～7.90%)、unclassified_f__Flavobacteriaceae(1.10%～6.81%)、unclassified_k__norank_d__Bacteria(0.87%～4.66%)、浮霉菌屬(Planctomicrobium，0.048%～16.50%)。它們分別屬于AKYG1722科、紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、暖繩菌科(Caldilineaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)等。在生物濾池中起硝化作用的主要細(xì)菌是氨氧化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌[17]，此生物濾池中的相關(guān)細(xì)菌有硝化螺旋菌屬(Nitrospira,0.037%～1.43%)和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas，0.054%～0.21%)細(xì)菌。其中，硝化螺旋菌屬在時(shí)間上相對(duì)豐度顯著性降低(見(jiàn)圖7)，雖然這些菌屬的豐度不高，但其是水處理過(guò)程中起十分重要作用的功能性細(xì)菌[18]。

2.2.3 不同時(shí)期微生物群落的相似性分析 OTU(Operational taxonomic unit)水平PCA分析(見(jiàn)圖8)所示，兩軸的總貢獻(xiàn)率為67.99%。其中，主坐標(biāo)1的方差貢獻(xiàn)率為47.40%，主坐標(biāo)2的方差貢獻(xiàn)率為20.59%。在空間上，1、3、4級(jí)生物濾池各樣本點(diǎn)之間的相似度較高，與2級(jí)生物濾池樣本點(diǎn)之間相似度較低，說(shuō)明1、3、4級(jí)生物濾池中微生物群落有更高的相似性；在時(shí)間上，2級(jí)生物濾池3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(B1、B2、B3)的相似度較高，與B4、B5之間相似度較低。結(jié)果表明，不同樣品的微生物群落差異較大，即各級(jí)生物濾池中不同時(shí)期的微生物群落差異較大。

2.3 微生物群落組成與水環(huán)境因子的響應(yīng)分析

3 討論

4 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物濾池對(duì)總氨氮、亞硝酸鹽和化學(xué)需氧量的去除率分別達(dá)到60.23%、15.56%和33.77%，整個(gè)過(guò)程對(duì)亞硝酸氮去除不明顯。其中，4級(jí)生物濾池進(jìn)、出水的總氨氮、亞硝酸鹽和COD濃度相差不大，相較于前3級(jí)生物濾池對(duì)氨氮的去除效果不明顯，其可能存在功能上的浪費(fèi)。

(2)通過(guò)高通量測(cè)序，本次實(shí)驗(yàn)生物濾池中微生物隸屬于37個(gè)門，100個(gè)綱，240個(gè)目，369個(gè)科和561個(gè)屬的細(xì)菌，其主要為變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門。1、3、4級(jí)生物濾池的微生物群落組成相似，且在時(shí)間、空間尺度上存在動(dòng)態(tài)變化。

(3)受生物濾池的水環(huán)境因子的影響微生物群落結(jié)構(gòu)并非一成不變，即其對(duì)水質(zhì)變化有一定程度的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。在實(shí)際生產(chǎn)中可以合理調(diào)節(jié)生物濾池內(nèi)COD濃度來(lái)穩(wěn)定生物濾池運(yùn)行期的微生物群落結(jié)構(gòu)，增加硝化螺旋菌屬、亞硝化單胞菌屬細(xì)菌的豐度，從而提高生物濾池的水處理效率。