王向陽，劉永輝，石 洋，崔宏勛

（1.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州 450000；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院，河南省骨科醫(yī)院，河南鄭州 450000）

腰痛是世界主要疾病負擔之一，其預防和治療是公共衛(wèi)生計劃中的一個重要挑戰(zhàn)，并且產(chǎn)生了巨大的社會經(jīng)濟和健康影響[1]。盡管導致腰痛原因復雜多樣，但研究發(fā)現(xiàn)椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是導致慢性腰痛的重要原因之一[2]。IDD主要特征是其內(nèi)部區(qū)域髓核細胞的丟失和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）分解。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）是一種多能干細胞，易于獲取，在一定條件下能夠分化為椎間盤細胞，同時能夠分泌多種營養(yǎng)因子，促進組織穩(wěn)態(tài)以及免疫調(diào)節(jié)，這些特性對于修復IDD具有重要意義，因此它作為一種創(chuàng)新的生物治療方法逐漸引起了研究人員的注意，現(xiàn)將MSC在IDD修復中的研究成果及臨床應用進展綜述如下。

1 MSC概述

MSC是在體外和體內(nèi)均具有廣泛增殖能力的潛能干細胞，在特定誘導條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)及冷凍保存后仍具有多向分化潛能。Friedenstein等[3]于1968年首次從大鼠骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），他描述了這種能夠分泌生長因子和細胞因子的成纖維細胞樣種群，后來由Caplan等[4]首先提出的成人“間充質(zhì)干細胞”的一般概念是為適應源自胚胎中胚層的細胞的概念而出現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)MSC能夠從脂肪組織、肺、牙髓、外周血、滑膜、子宮內(nèi)膜等諸多組織中分離出來[5]，且具有多重生理特性，主要為多能性、營養(yǎng)能力、歸巢/遷移、免疫抑制等[6，7]。目前MSC已被廣泛應用于臨床治療中，在組織修復、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等多個領(lǐng)域研究中展現(xiàn)了光明的前景。

2 MSC修復退變椎間盤的作用機制及對比

2.1 MSC增殖與多向分化潛能

MSC具有廣泛的增殖和分化能力，這是其區(qū)別于其他成體細胞的顯著特征之一，MSC增殖分化的健康細胞能夠重新填充受損椎間盤，在恢復正常的組織平衡的同時能夠抑制椎間盤的退化級聯(lián)[8]。Risbud等[9]率先證實了BMSCs在低氧和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1作用下可向類髓核細胞分化，之后研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤中低氧、高滲和機械負荷的特殊環(huán)境有助于MSC獲得椎間盤細胞樣表型，并能促進合成ECM的結(jié)構(gòu)成分合成[10]，但也有學者研究認為，椎間盤中無血管、低糖、低pH值的環(huán)境，可能會導致植入的細胞無法長期存活，基于MSC增殖分化機制的修復功能可能受到限制，不足以誘導椎間盤的再生[11]。

2.2 MSC的“歸巢”特性

MSC的歸巢特性是維持組織穩(wěn)態(tài)并促進組織修復的重要機制之一。MSC通過響應損傷、免疫或物理化學信號而被動員，并遷移至效應位點，進而發(fā)揮作用，該過程受到信號分子、氧氣和機械信號的嚴格梯度控制[12]。Illien-Jünger等[13]在離體培養(yǎng)的牛椎間盤中證實了MSC的歸巢，與模擬生理條件下的椎間盤相比，退化變性椎間盤表現(xiàn)出對MSC較強的吸引性，且顯著增加了蛋白聚糖的合成。Sakai等[14]在小鼠模型中同樣證實了MSC的歸巢，并發(fā)現(xiàn)其遷移效率與椎間盤變性的嚴重程度呈正相關(guān)。Wangler等[15]發(fā)現(xiàn)，MSC的歸巢能夠可激活Tie2陽性祖細胞群，表達Tie2的椎間盤細胞是具有分化潛能的祖細胞群，一旦激活，可以分裂產(chǎn)生子細胞，子細胞能夠遷移到損傷部位，并最終分化成修復受損組織所需的細胞類型。但是，Tie2陽性祖細胞的比例會隨著衰老和椎間盤變性而降低，從而導致椎間盤再生修復能力的喪失，MSC歸巢提高了椎間盤中Tie2細胞的比例?？偠灾壳把芯科毡檎J為MSC歸巢對退變的椎間盤有非常積極的影響，包括免疫調(diào)節(jié)作用，合成代謝基因的上調(diào)，細胞存活和增殖以及生長因子的產(chǎn)生[16]，通過MSC歸巢機制開辟關(guān)于內(nèi)源修復策略的新方法也將是今后研究重點。

2.3 MSC旁分泌作用

MSC的旁分泌作用能夠以細胞外囊泡的方式分泌產(chǎn)生的大量生物活性因子（生長因子、細胞因子、趨化因子及外泌體等）并作用于鄰近的細胞，這些因子在關(guān)鍵生物學過程的調(diào)節(jié)中起著重要作用[17]。Shim等[18]將BMSCs和變性椎間盤細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)過程中，BMSCs降低了白細胞介素-1a、白細胞介素-1b、白細胞介素-6、和腫瘤壞死因子-a等各種促炎細胞因子基因的表達水平，這些基因共同參與了ECM的降解。同時表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1、成骨蛋白-1、生長分化因子-7和轉(zhuǎn)化生長因子-b等生長因子基因表達出現(xiàn)上調(diào)，此外，共培養(yǎng)的退變椎間盤細胞中ECM的積累量大于單獨培養(yǎng)細胞。Cao等[19]研究也驗證了BMSCs可能通過同時上調(diào)細胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β和下調(diào)炎癥信號分子NF-κB的途徑來延遲髓核細胞基質(zhì)的變性。隨著越來越多的證據(jù)表明炎癥與腰背痛的發(fā)展相關(guān)[20]，MSC通過旁分泌機制調(diào)控炎癥反應可能比其再生性質(zhì)更重要。

2.4 不同來源MSC的比較

盡管已發(fā)現(xiàn)了多種MSC細胞類型和來源，但依據(jù)取材難度，分化能力、增殖能力不同，目前用于椎間盤修復的MSC的主要來源是椎間盤本身（髓核組織、纖維環(huán)、軟骨終板中的駐留干細胞或原代細胞）及骨髓和脂肪組織。在細胞獲取方面，相較于椎盤源性干細胞分離的較低效率及BMSCs的較高侵入性，脂肪來源干細胞（adipose mesenchymal stem cells,ADSCs）在豐富性和易于分離收集方面優(yōu)勢明顯[21]。在細胞增殖分化方面，不同來源的MSC表征和分化潛力有所不同，但不同文獻報道結(jié)果存在差異，這可能是樣本來源、試驗方法不同所致。Liang等[22]比較了軟骨終板源性干細胞（cartilage endplate-derived stem cells,CESCs）、髓核源性干細胞（nucleus puplposusderived stem cells,NPSCs）、纖維環(huán)源性干細胞（annulus fibrosus-derived stem cells,AFSCs）三種椎間盤源性MSC，發(fā)現(xiàn)三者細胞形態(tài)沒有明顯差異，但NPSCs和AFSCs的細胞增殖能力強于CESCs，在分化相關(guān)基因的表達方面，AFSCs要強于NPSCs和CESCs。Zhou等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs相比，ADSCs較少依賴線粒體呼吸來產(chǎn)生能量，因此能夠較好地適應缺氧環(huán)境，同時ADSCs具有較低的人白細胞抗原I類抗原表達水平和較高的免疫抑制能力，在調(diào)節(jié)炎癥方面可能更具優(yōu)勢，此外有研究發(fā)現(xiàn)ADSCs較BMSCs可以分化為更具NP樣表型的細胞[24]。綜上所述，不同來源的MSC均能夠分化成椎間盤所需細胞來促進修復，但椎間盤源性干細胞不僅具有普通干細胞分化、免疫調(diào)節(jié)特性，同時因其內(nèi)源性特點，在椎間盤修復有著巨大潛力，ADSCs在獲取、增殖分化能力、免疫調(diào)節(jié)等方面較其他來源細胞更具有優(yōu)勢，也可以作為修復IDD優(yōu)秀的干細胞來源。

3 MSC應用進展

3.1 MSC臨床研究

從臨床的角度來看，MSC是非常有吸引力的，因為它們可以安全地從患者組織中分離出來，并且其免疫原性幾乎可以忽略不計，自體移植和同種異體移植都可以進行，且無需免疫抑制藥物[25，26]。Sakai等[27]于2003年首次提出了干細胞移植治療IDD的方法，此后，在前期動物實驗的基礎(chǔ)上，各研究團隊逐步開始進行臨床研究。Noriega等[28]對24例保守治療無效的的慢性腰痛患者進行的一項隨機對照實驗顯示，接受MSC治療的患者在功能指標上顯示出快速而顯著的改善，且長期隨訪發(fā)現(xiàn)（42個月），即使在接受治療數(shù)月以后，仍可以觀察到IDD逐步的改善，包括含水量增加、Pfirrmann評分下降；而安慰劑組沒有疼痛或殘疾的任何改善，1年后，Pfirrmann評分甚至顯著惡化。Centeno等[[29]對33例慢性腰痛患者進行了培養(yǎng)擴增的自體BSMCs治療，隨訪期長達6年；患者疼痛評分及改良SANE評分均明顯改善，MRI顯示85%的患者的椎間盤膨出尺寸平均減小了23%，此外，未發(fā)生感染、腫瘤、異位骨化等任何不良事件。由此可見，MSC治療IDD具有較好的療效及安全性。Pettine等[30]的研究中，26例椎間盤源性腰痛患者接受了自體BMSCs注射治療，并接受了2年隨訪。在接受治療1年后，患者視覺模擬評分和Oswestry有了顯著的改善，磁共振成像發(fā)現(xiàn)8例患者的椎間盤高度增加，Pfirrmann評分有所改善，值得注意的是研究還發(fā)現(xiàn)患者疼痛緩解的總次數(shù)和速率與注射BMSCs濃度相關(guān)。Pettine等[31]的另一項研究中也報告了類似的結(jié)果，接受多次BMSCs注射治療的患者ODI和VAS評分改善速度更快，幅度更高。盡管臨床應用MSC治療取得了積極進展，但關(guān)于其適應證選擇及安全問題也引起了關(guān)注，適應證的選擇對于MSC治療的效果至關(guān)重要，但目前無明確標準，當前研究認為MSC治療更適用于處于IDD的早期，Pfirrmann分級為三級或四級的單節(jié)段IDD所引起的的中度慢性背痛[32]。綜上，MSC的臨床應用仍處于萌芽階段，盡管研究證實了MSC治療能夠降低患者疼痛并改善IDD情況，但需要進一步研究以確定哪些患者是合適的治療對象，此外MSC合適的注射方法、次數(shù)及劑量、長期效果及安全性也需進一步評價。

3.2 MSC聯(lián)合生物材料支架

MSC的分化增殖過程中，易受到生長因子和內(nèi)環(huán)境的影響，目前針對椎間盤應用已經(jīng)開發(fā)了基于膠原、透明質(zhì)酸、藻酸鹽和纖維蛋白等多種支架。Chen等[33]使用光交聯(lián)的明膠-透明質(zhì)酸水凝膠支架，移植ADSCs后置入大鼠體內(nèi)；結(jié)果顯示，該支架能夠激活αVβ6-TGF-β1通路從而促進ADSCs向椎間盤細胞分化、增強修復效果。Frauchiger等[34]將工程絲絨膜復合材料作為BMSCs支架，并在其中加入GDF-6、TGF-β3基因，體外培養(yǎng)后觀察到支架的應用提高了細胞存活率，同時GDF-6和TGF-β3的加入使BMSCs分化為更趨近椎間盤細胞的表型。周逸馳等[35]應用多能誘導干細胞結(jié)合海藻酸鈉鹽微球凝膠支架置入兔椎間盤退變模型，結(jié)果顯示支架的應用使得椎間盤內(nèi)蛋白多糖和Ⅱ型膠原增加更顯著，且顯著降低MMP3蛋白表達，有效改善了椎間盤退變。除了人工材料制作的支架外，天然生物材料，如來自椎間盤的脫細胞基質(zhì)，因其天然的ECM成分對MSC分化具有良好誘導作用，也展現(xiàn)出了巨大潛力[36]。綜上，利用MSC與生物材料支架相結(jié)合的組織工程方法既可以為MSC提供合適的環(huán)境，促進其增殖分化避免損害，同時支架中的某些藥物成分能夠控制MSC的分化傾向，此外應用支架能夠減少細胞滲漏損失，降低由滲漏引起的異位骨贅形成的風險[37]，因此未來組織工程可能在椎間盤再生領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

綜上所述，基于MSC治療IDD得到了廣泛的研究，MSC可以補充椎間盤細胞、調(diào)節(jié)免疫反應、釋放生長因子，進而修復椎間盤緩解患者癥狀，目前的體外及體內(nèi)試驗表明MSC療法效果及安全性較高，但最佳細胞來源、細胞預處理、注射量等問題仍然尚未清楚，此外如何評估椎間盤再生的效果，其長期療效及潛在不良反應也還需要研究。對于某些椎間盤疾病患者，MSC細胞的再生療法彌補保守治療和積極手術(shù)之間的鴻溝，但治療的具體適應證仍需進一步明確。隨著組織工程學的發(fā)展，支架技術(shù)的應用提高了MSC治療的效果及安全性，也將推動MSC在臨床的應用。