戴凡，羅文，夏航彪，鄧燕，肖情，邱容

629000四川 遂寧，遂寧市中心醫(yī)院/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬遂寧市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院附屬遂寧醫(yī)院 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌是中國(guó)及全球范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]，按照病理類型可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中NSCLC約占85%[3]。有約80%的NSCLC患者在確診時(shí)已處于中晚期，其5年生存率僅17.4%[4]，原因之一為NSCLC細(xì)胞可以通過(guò)不同機(jī)制逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)控，使機(jī)體不能產(chǎn)生或不能及時(shí)產(chǎn)生抗腫瘤的免疫應(yīng)答[5]。近年來(lái)，腫瘤免疫治療已逐漸成為包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的重要治療手段之一[6]，其中免疫檢查點(diǎn)程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)和及其配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)受到了很大的關(guān)注[7]。PD-L1與PD-1結(jié)合可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，參與腫瘤免疫逃逸、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與侵襲[8]。因此，PD-1/PD-L1表達(dá)水平作為腫瘤監(jiān)測(cè)及免疫治療效果的生物標(biāo)志物的相關(guān)研究備受關(guān)注。本研究采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者外周血T細(xì)胞亞群和單核細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平，并探討其臨床意義，為尋找PD-1/PD-L1抑制劑的有效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)收集2020年1月至2021年2月遂寧市中心醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科二病區(qū)收治的符合入排標(biāo)準(zhǔn)的晚期NSCLC患者作為肺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)經(jīng)病理學(xué)和(或)細(xì)胞學(xué)檢查確診為NSCLC；2)依據(jù)國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第7版)分期為ⅢB～Ⅳ期；3)年齡>18歲，首次治療患者；4)患者對(duì)研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)有腫瘤疾病史或罹患其他惡性腫瘤；2)臨床信息不完整。共納入56例NSCLC患者，其中，男性38例(67.86%)、女性18例(32.14%)；年齡48～79歲，平均年齡(61.86±7.11)歲；ⅢB期10例(17.86%)、Ⅳ期46例(82.14%)；肺腺癌18例(32.14%)、肺鱗癌36例(64.29%)、肺腺鱗癌2例(3.57%)。

按照1∶2的比例選擇科室同期收治的性別(同性別)、年齡(±3歲)相匹配的普通肺部疾病患者為作為對(duì)照組，排除肺癌及其他惡性腫瘤疾病史。共納入112例普通肺部疾病患者，男性76例(67.86%)、女性36例(32.14%)；年齡46～77歲，平均年齡(60.12±8.23)歲；疾病類型：慢阻肺48例(42.86%)、支氣管擴(kuò)張27例(24.11%)、社區(qū)獲得性肺炎26例(23.21%)、哮喘11例(9.82%)。兩組患者性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，基線資料具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血PD-1/PD-L1表達(dá)水平檢測(cè)

1.2.1.1 外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)制備 分別抽取兩組患者新鮮外周血5 mL送至檢驗(yàn)科備用，在15 mL容量的離心管中加入5 mL外周血淋巴細(xì)胞分離液(上海索寶生物科技公司生產(chǎn))，再將經(jīng)肝素抗凝的5 mL外周血緩慢加入離心管中，使用低速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)在室溫環(huán)境下離心20 min，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min，吸出單核細(xì)胞層將其移至新的離心管備用，即為PBMC。

1.2.1.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 取3支流式細(xì)胞儀試管分別標(biāo)記為CD4/PD-1、CD8/PD-1和CD14/PD-L1，加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution, PBS)清洗制備待用的PBMC細(xì)胞3次，細(xì)胞密度保持在1×106個(gè)/mL。在3支試管中分別加入CD4-FITC/PD-1-PE、CD8-FITC/PD-1-PE和CD14-FITC/PD-L1-PE(美國(guó)Biolegend公司)，室溫環(huán)境下避光反應(yīng)20 min，加入200 μL紅細(xì)胞裂解液(美國(guó)Beckman-Couter公司)和2 mL的PBS，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心5 min，后棄上清液，加入2 mL的PBS，通過(guò)流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-Couter)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞PD-1、CD8+T細(xì)胞PD-1和CD14+單核細(xì)胞PD-L1的表達(dá)率。

1.2.2 療效評(píng)價(jià)及亞組分析

采用實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)(RECIST 1.1)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺癌組中完成2～4個(gè)周期化療患者進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，其中，部分緩解(partial response, PR)：治療后靶病灶的總直徑相比基線水平減少>30%；疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)：治療后靶病灶的總直徑相比總直徑最小測(cè)量值增加>20%，且靶病灶的總直徑的絕對(duì)值增加>5 mm或出現(xiàn)一個(gè)及以上新病灶。比較PR組(n=10)和PD組(n=12)治療前后外周血PD-1和PD-L1表達(dá)水平的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)服從正態(tài)分布或近似服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率/百分比/構(gòu)成比[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率

NSCLC組患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表1)。

表1 兩組患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率及CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率

2.2 兩組患者外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率

NSCLC組患者外周血CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

2.3 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率

組間比較：治療前不同療效兩組患者的外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而治療后PD療效組NSCLC患者的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率均明顯高于PR療效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

組內(nèi)比較：PR療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率均低于治療前基線水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PD療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率均明顯高于治療前基線水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率

2.4 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率

組間比較：治療前不同療效兩組患者的外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而治療后PD療效組NSCLC患者的CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率明顯高于PR療效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

組內(nèi)比較：PR療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率低于治療前基線水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PD療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率明顯高于治療前基線水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3)。

表3 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率

3 討 論

目前腫瘤免疫療法是近幾年腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，其中PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑被認(rèn)為是最有前景的治療方式[9]，且在肺癌患者的治療中取得了令人矚目的成效[10]。PD-1在活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞及B細(xì)胞中大量表達(dá)，而PD-L1則在各種免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)高表達(dá)的PD-L1與T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合后，抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞程序性死亡，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[11]。有研究顯示[12]，PD-1/PD-L1抑制劑能顯著延長(zhǎng)晚期NSCLC患者的總生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間。美國(guó)食藥監(jiān)局已經(jīng)批準(zhǔn)了帕博利珠單抗、阿替利珠單抗等多種抗PD-1/PD-L1單克隆抗體在晚期NSCLC患者中的應(yīng)用，F(xiàn)DA還批準(zhǔn)了多種商業(yè)化的PD-L1檢測(cè)試劑盒用于臨床檢測(cè)[13]。在中國(guó)，PD-1/PD-L1抑制劑及PD-L1檢測(cè)試劑盒已逐步上市，并應(yīng)用于NSCLC的治療和診斷[14]。

本研究中采用流式細(xì)胞學(xué)檢查方法，檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1分子的表達(dá)率，結(jié)果證實(shí)晚期NSCLC患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子表達(dá)百分率相較于呼吸內(nèi)科收治的肺部普通疾病患者群體明顯升高，同時(shí)在晚期NSCLC患者的外周血CD14+單核細(xì)胞表面同樣存在PD-L1分子的高表達(dá)。據(jù)此推測(cè)位于CD14+單核細(xì)胞表面高表達(dá)的PD-L1分子也可以通過(guò)與T細(xì)胞表面的PD-1分子相互作用，抑制T細(xì)胞的活化功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的免疫功能，最終導(dǎo)致NSCLC腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生[15-16]。

與此同時(shí)，本研究還對(duì)完成單純采用三代含鉑方案的全身化療治療2～4周期后患者的PD-1/PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行隨訪，按照實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)(RECIST 1.1)標(biāo)準(zhǔn)，選擇治療后PR和PD患者進(jìn)行亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床療效為PR的NSCLC患者治療后其外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率及CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)率均較治療前的基線水平明顯下降；與此相反，PD組患者的PD-1、PD-L1表達(dá)水平均較治療前基線水平進(jìn)一步上升[17]。這與國(guó)內(nèi)學(xué)者邢玉斐等[18]報(bào)道的晚期NSCLC患者PBMC表面PD-L1分子表達(dá)率的強(qiáng)弱決定了PD-L1分子與T細(xì)胞相互作用過(guò)程中所發(fā)揮的抑制T細(xì)胞增殖作用具有一致性。

綜上所述，晚期NSCLC患者外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞存在PD-1和PD-L1表達(dá)的異常上調(diào)，提示可通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)水平來(lái)判斷疾病嚴(yán)重程度和作為預(yù)后的輔助生物學(xué)預(yù)測(cè)指標(biāo)，但由于本研究樣本量較小、也并未做不同臨床病理特征之間的比較，因此研究結(jié)論還需要更多的前瞻性、大樣本研究進(jìn)一步探討。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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