王丙萍，段金凱，高艷偉，馬虎林，蘇日娜，張浩，高維實(shí)

010017呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤研究所(王丙萍)，腹部腫瘤外科(高艷偉、馬虎林、蘇日娜、張浩、高維實(shí));010070呼和浩特，內(nèi)蒙古建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院 公共課教學(xué)部(段金凱)

前列腺癌是目前全世界男性中最常見(jiàn)到的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球男性中位于第二位，癌癥死因第五位，并且死亡人數(shù)在持續(xù)增加[1-2]。在我國(guó)，前列腺癌患者的生存情況和預(yù)后與發(fā)達(dá)國(guó)家相比還存在一定的差距[3-5]。

過(guò)繼性免疫治療是腫瘤免疫療法的一種，其原理是將人體內(nèi)的抗腫瘤免疫細(xì)胞采集后，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后回輸患者，以增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，CIK)是經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)而成的一群異質(zhì)混合型細(xì)胞，以T細(xì)胞為主，其主要效應(yīng)細(xì)胞是天然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells， NKT)，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。NK細(xì)胞(natural killer cells，NK)是大顆粒淋巴細(xì)胞，約占人體外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%左右，大部分存在于人的肝臟、脾臟、外周血以及骨髓中，少部分存在于淋巴結(jié)中[6]。NK細(xì)胞參與天然免疫和適應(yīng)性免疫，是先天免疫系統(tǒng)中最具殺傷性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，能夠介導(dǎo)強(qiáng)大的抗病毒和抗腫瘤作用[7]。作為人體免疫系統(tǒng)中的第一道防線，NK細(xì)胞能夠直接殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,而不需要依賴抗體，也不受主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制，屬于非特異性的殺傷作用。

免疫檢查點(diǎn)指的是在免疫細(xì)胞上表達(dá)的一系列分子，它能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活，是人體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控機(jī)制。目前研究最清楚的免疫檢查點(diǎn)有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)、程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)及其配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)。PD-1發(fā)揮作用是在免疫應(yīng)答的后期，通過(guò)影響干擾素γ(interferon-gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)以及白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)等細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而影響T細(xì)胞的增殖。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中免疫檢查點(diǎn)起到的作用不可忽視，在免疫逃逸過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的表面通常會(huì)過(guò)度表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，使得細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值。

本研究擬通過(guò)研究CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)3種前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、DU145 、PC3的殺傷效率，鑒定其用于后期治療前列腺癌的可行性,為應(yīng)用細(xì)胞過(guò)繼回輸治療前列腺癌的研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、LNCaP、DU145購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；GT-551培養(yǎng)基為日本TaKaRa公司；VIVOTM15培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)為美國(guó)Gibco公司；IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、OKT3為美國(guó)R&D公司；抗人CD16單克隆抗體為中國(guó)北京同立海源生物科技有限公司；PD-1單克隆抗體(nivolumab)為中國(guó)大連美侖；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液為中國(guó)TBDTM公司；熒光標(biāo)記單克隆抗體：CD3-FITC、CD56-PE、鼠抗人IgG-FITC為美國(guó)BD公司；CCK8試劑盒為中國(guó)博士德生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱及生物安全柜(Thermo，美國(guó))；倒置熒光顯微鏡(Leica，德國(guó))；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州泰安空氣技術(shù)有限責(zé)任公司，中國(guó))；ELx808吸收光酶標(biāo)儀(Biotec，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前列腺癌細(xì)胞株的培養(yǎng) 前列腺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)液分別為PC3—DMEM-F12，LNCaP—RPMI-1640，DU145—DMEM高糖，F(xiàn)BS濃度均為10%。0.25%胰蛋白酶消化的時(shí)間分別是LNCaP、DU145為1 min，PC3為3 min。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs，收集血漿置于56℃水浴鍋內(nèi)保持30 min，冷卻后離心，轉(zhuǎn)移上清保存于4℃?zhèn)溆?；將白膜層移出，加入PBS吹打清洗，離心棄上清，VIVOTM15培養(yǎng)基重懸PBMCs細(xì)胞，顯微計(jì)數(shù)，取樣進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.3 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增 培養(yǎng)基為GT-551，調(diào)整PBMCs細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL第0 d加入IFN-γ 1 000 U/mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第1 d加入100 U/mL的IL-1α，50 μg/mL的CD3單抗(OKT3)，300 U/mL的IL-2。此后每隔2 d加入培養(yǎng)基及300 U/mL的IL-2，調(diào)整細(xì)胞濃度。FITC-CD3和PE-CD56抗體染色，流式細(xì)胞儀鑒定CIK細(xì)胞。

1.3.4 NK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增 調(diào)整PBMCs細(xì)胞密度為1.5×107個(gè)/mL,加入自體血清10%，IL-2 1 000 IU/mL、IL-7 10 ng/mL、IL-15 50 ng/mL、IL-18 10 ng/mL、IL-21 50 ng/mL、OKT3 10 ng/mL和Anti-CD16 10 ng/mL，90% VIVOTM15培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種密度≤1.5×107個(gè)/mL,密度過(guò)大影響NK生長(zhǎng)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2天補(bǔ)液調(diào)節(jié)細(xì)胞的密度為1.0×107個(gè)/mL；培養(yǎng)基=90% VIVOTM15培養(yǎng)基+自體血漿10%+IL-2 1 000 IU/mL。14 d后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，合格后收獲細(xì)胞。

1.3.5 流式細(xì)胞檢測(cè) 免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞分析，取免疫細(xì)胞1 mL，PBS洗滌，離心棄液，加入50 μL PBS輕輕懸浮細(xì)胞20 μL CD3-FITC和20 μL CD56-PE，4℃避光保存30 min。PBS洗滌后流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)，用異硫氰酸標(biāo)記IgG作為陰性對(duì)照,根據(jù)流式細(xì)胞分析圖中CD3+CD56+的百分比確定CIK細(xì)胞所占比例以及CD3-CD56+的百分比確定NK細(xì)胞所占比例。

1.3.6 CCK-8法檢測(cè)殺傷效率 分別以CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞、PD-1單抗+NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞分別為前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、DU145、PC3。將3種靶細(xì)胞以5×103個(gè)/孔 的數(shù)量分別接種于96孔板中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄液。PD-1單抗+NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的處理方式是每106個(gè)NK細(xì)胞加入PD-1單抗6 μg在培養(yǎng)箱中培育2 h。然后按效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例分別加入效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置單獨(dú)靶細(xì)胞孔和每種比例的單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞孔，每個(gè)比例3個(gè)復(fù)孔。共同培養(yǎng)24 h后，加入CCK8 試劑放于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育3.5 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的OD值，以此方法檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，公式如下：殺傷率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞OD值)/單獨(dú)靶細(xì)胞組OD值]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，在P<0.05時(shí)被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

健康人外周血分離PBMCs后，分別經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞。CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果是第0 d為散落的顆粒狀細(xì)胞，3～4 d后聚集成團(tuán)，出現(xiàn)CIK細(xì)胞集落(圖1A)。培養(yǎng)14 d，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定(圖1B、C)，CD3+細(xì)胞為85.28%±17.67%，CD3+CD56+細(xì)胞為22.02%±2.68%，CD8+CD56+細(xì)胞為23.09%±6.85%，確定為CIK細(xì)胞。NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果是第0 d為散落的顆粒狀細(xì)胞，3～4 d后聚集成團(tuán)，出現(xiàn)細(xì)胞集落，培養(yǎng)10～4 d后，細(xì)胞重新分散為單個(gè)細(xì)胞(圖1D)。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD3-CD56+細(xì)胞(圖1E、F)，外周血中占比較少的NK細(xì)胞，擴(kuò)增到占比83.20%±8.54%以上，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍，NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。

圖1 CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

2.2 CIK細(xì)胞毒活性的檢測(cè)

以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞分別為前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、DU145、PC3，在不同效靶比的情況下(0.1∶1、0.5∶1、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)，加入CCK8 試劑，孵育3.5 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)OD值的方法檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(圖2)。通過(guò)公式分別計(jì)算不同效靶比下CIK對(duì)靶細(xì)胞PC3、LNCaP、DU145的殺傷率。結(jié)果表明(表1)，隨著效靶比的增高，CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞PC3、LNCaP、DU145的殺傷率也逐步增高。CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為20∶1時(shí)殺傷率最高(76.34%±4.93%)，與效靶比為1∶1、5∶1、10∶1、15∶1的實(shí)驗(yàn)組相比殺傷效率逐步增高，各實(shí)驗(yàn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與效靶比0.1∶1和0.5∶1實(shí)驗(yàn)組相比差異顯著(P<0.05)；CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞DU145的殺傷率在1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1時(shí)逐步增高，在20∶1時(shí)殺傷率最高(34.59%±3.51%)，各效靶比的殺傷效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與其它組相比差異顯著(P<0.05)；CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞PC3的殺傷率在5∶1、10∶1、15∶1、20∶1時(shí)逐步增高，在20∶1時(shí)殺傷率最高(58.72%±8.08%)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與其它組相比差異顯著(P<0.05)；CIK細(xì)胞對(duì)3種靶細(xì)胞的殺傷率差異極顯著(P<0.01)。CIK細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)3種靶細(xì)胞的殺傷率結(jié)果表明,CIK效應(yīng)細(xì)胞在效靶比為10∶1、15∶1、20∶1時(shí)，殺傷率逐步增高，各效靶比的殺傷效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與其它組相比差異顯著(P<0.05)。

圖2 CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

表1 CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

2.3 NK細(xì)胞毒活性的檢測(cè)

通過(guò)公式分別計(jì)算不同效靶比下NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率。結(jié)果表明(表2、圖3)，NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為1∶1時(shí)殺傷率最高92.03%±9.95%，與效靶比為0.5∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的實(shí)驗(yàn)組相比，各實(shí)驗(yàn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與效靶比0.1∶1實(shí)驗(yàn)組相比差異極顯著(P<0.01)；NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞DU145在效靶比為10∶1時(shí)殺傷率最高72.40%±8.30%，與效靶比為5∶1的實(shí)驗(yàn)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與其它實(shí)驗(yàn)組相比差異顯著(P<0.05)；NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞PC3的殺傷率在除了效靶比為0.1∶1、0.5∶1的實(shí)驗(yàn)組外，其余各實(shí)驗(yàn)組的殺傷率均為負(fù)數(shù)，并且各實(shí)驗(yàn)組間差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明NK細(xì)胞對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞株沒(méi)有殺傷效果；并且隨著效靶比逐步增高，其負(fù)數(shù)值越大，說(shuō)明NK細(xì)胞對(duì)其有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。

表2 NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

圖3 NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

2.4 PD-1單抗+NK細(xì)胞毒活性檢測(cè)

通過(guò)公式分別計(jì)算不同效靶比下NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率。結(jié)果表明(表3、圖4)，PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為15:1時(shí)殺傷率最高(96.65%±17.89%)，與其它效靶比的實(shí)驗(yàn)組相比，各實(shí)驗(yàn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞DU145在效靶比為10∶1時(shí)殺傷率最高(69.64%±13.18%)，與效靶比為5∶1、15∶1、20∶1的實(shí)驗(yàn)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與其它實(shí)驗(yàn)組相比差異顯著(P<0.05)；PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞PC3的殺傷率在除了效靶比為0.1∶1、0.5∶1的實(shí)驗(yàn)組外，其余各實(shí)驗(yàn)組的殺傷率均為負(fù)數(shù)，并且各實(shí)驗(yàn)組間差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞株沒(méi)有殺傷效果；并且隨著效靶比逐步增高，其負(fù)數(shù)值越大，說(shuō)明NK細(xì)胞對(duì)其有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。

表3 PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

圖4 PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

2.5 三種效應(yīng)組對(duì)3種靶細(xì)胞最高殺傷效率比較

通過(guò)對(duì)三種效應(yīng)組殺傷3種靶細(xì)胞最高效率的比較分析(表4、圖5)，結(jié)果表明三種效應(yīng)組對(duì)靶細(xì)胞LNCaP的最高殺傷效率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)靶細(xì)胞DU145的最高殺傷效率CIK效應(yīng)組與NK、PD-1+NK效應(yīng)組間差異極顯著(P<0.01)，對(duì)靶細(xì)胞PC3的最高殺傷效率CIK效應(yīng)組與NK、PD-1+NK效應(yīng)組間差異極顯著(P<0.01)。三種效應(yīng)組對(duì)3種靶細(xì)胞最高殺傷效率各組間相比都差異極顯著(P<0.01)。

表4 三種效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、 PC3的最高殺傷率比較(%)

圖5 三種效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LNCaP、DU145、 PC3的最高殺傷率比較(%)

3 討 論

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人口壽命增長(zhǎng)，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率近年來(lái)已出現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)[8-12]。目前對(duì)于前列腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放療以及化療。而對(duì)于晚期和轉(zhuǎn)移性的前列腺癌患者，雄激素剝奪治療是其主要治療手段，但這種方法破壞了男性正常的內(nèi)分泌環(huán)境，會(huì)引起一定的并發(fā)癥，且部分患者并發(fā)癥嚴(yán)重，如果出現(xiàn)疾病進(jìn)展，患者將失去所有現(xiàn)有治療手段對(duì)生存期的收益。因此，對(duì)于這部分前列腺癌患者，急需開(kāi)發(fā)出新的治療手段，以提高其生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期。

CIK細(xì)胞是近年細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療的主要應(yīng)用類型，主要是由于其技術(shù)操作簡(jiǎn)便、容易獲得，同時(shí)成本相對(duì)較低，能夠降低廣大癌癥患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使其易于接受；由于CIK細(xì)胞是異質(zhì)混合型細(xì)胞，其CD3+CD56+效應(yīng)細(xì)胞純度有限[13-14]，對(duì)于治療時(shí)易產(chǎn)生的嚴(yán)重副反應(yīng)有減輕作用，同時(shí)還可以彌補(bǔ)晚期腫瘤患者免疫低下導(dǎo)致的自身免疫細(xì)胞弱化的缺點(diǎn)，降低移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，CIK細(xì)胞對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞系的殺傷效率差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明CIK細(xì)胞過(guò)繼性回輸治療前列腺癌的效果可能與患者所患前列腺癌類型相關(guān)。

NK細(xì)胞是除T細(xì)胞之外的機(jī)體抗腫瘤的另一重要利器，其本身具有廣譜抗腫瘤的作用，同時(shí)還具有強(qiáng)大的間接增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，是T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能的基礎(chǔ)[17]。有研究表明，NK細(xì)胞受損和細(xì)胞數(shù)量的減少，與各類腫瘤的進(jìn)展都具有相關(guān)性，NK細(xì)胞過(guò)繼性回輸在晚期非小細(xì)胞肺癌的治療中取得了令人滿意的效果[18]。與T細(xì)胞相比，NK細(xì)胞的過(guò)繼性回輸具有耐受性良好，神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子釋放綜合征和GVHD等嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率大大降低；同種異體NK細(xì)胞的回輸還能避免或降低殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體介導(dǎo)的抑制性信號(hào)，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示效應(yīng)細(xì)胞NK對(duì)3種靶細(xì)胞LNCaP、DU145 、PC3的殺傷率差異極顯著(P<0.01)；NK細(xì)胞對(duì)LNCaP的殺傷效率大于對(duì)DU145的殺傷效率；對(duì)于PC3沒(méi)有殺傷作用，反而促進(jìn)其生長(zhǎng)。筆者通過(guò)對(duì)以往研究資料的梳理，發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)特性方面[22]，PC3與DU145均為低分化、雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞，均具有轉(zhuǎn)移潛能且缺乏內(nèi)源性的雄激素受體的表達(dá)，均同時(shí)表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)因子CK5和CK8/18；而PC3與LNCaP均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性、高表達(dá)E-cadherin、不表達(dá)Vimentin。因此，除PC3細(xì)胞系不表達(dá)野生型P53蛋白，而DU145和LNCaP細(xì)胞均可表達(dá)野生型P53蛋白外，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞系與另外兩株前列腺癌細(xì)胞系的不同之處。然而，P53是人體的抑癌基因之一，其突變會(huì)導(dǎo)致原有抑癌功能的喪失，同時(shí)獲得新的致癌功能；有研究證明表達(dá)野生型P53的腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性強(qiáng)于不表達(dá)野生型P53的腫瘤細(xì)胞[23-24]。這說(shuō)明本研究中“NK細(xì)胞促進(jìn)PC3細(xì)胞系生長(zhǎng)”的結(jié)果，可能是由PC3細(xì)胞系不表達(dá)野生型P53蛋白引起的；也可能是由PC3細(xì)胞系的特殊性導(dǎo)致的，而這種“特殊性”在目前的研究資料中并沒(méi)有呈現(xiàn)出來(lái)，因此需要后續(xù)進(jìn)行深入研究探索其作用機(jī)制。本研究的結(jié)果為腫瘤免疫逃逸的研究提出了可能作為目標(biāo)的研究細(xì)胞以及研究方向。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用為腫瘤患者的治療帶來(lái)了新的希望，其作用機(jī)制是阻斷免疫檢查點(diǎn)與其受體的結(jié)合，從而解除了腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用，使得T細(xì)胞的抗腫瘤免疫得以激活。目前，關(guān)于PD-1/PD-L抑制劑的應(yīng)用在腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤和結(jié)直腸癌的治療中取得了十分重大的突破，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可以應(yīng)用于臨床治療[25-30]。

研究表明NK細(xì)胞也表達(dá)PD-1分子，在卵巢癌患者中有一個(gè)高表達(dá)PD-1的NK細(xì)胞亞群，其抗腫瘤能力及增殖能力明顯受到了抑制，當(dāng)使用PD-1抑制劑時(shí)，可以部分恢復(fù)該NK細(xì)胞亞群的功能[31]。在肝癌、食道癌、胃癌及結(jié)直腸癌患者的腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞及外周血NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)增高，并提示與患者的不良預(yù)后相關(guān)；通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)的方法可以使NK細(xì)胞的脫顆粒水平和細(xì)胞因子水平顯著增加，同時(shí)能夠抑制NK細(xì)胞的凋亡[32]。在霍奇金淋巴瘤中，PD-1在CD3-CD56hiNK細(xì)胞上的表達(dá)明顯升高，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)其與PD-L1+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的相互作用，介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸[33]。在多種小鼠腫瘤模型中都發(fā)現(xiàn)了阻斷PD-1和PD-L1信號(hào)可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的NK細(xì)胞反應(yīng)，并且證明這種反應(yīng)是PD-1抑制劑發(fā)揮治療效果所必須的[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞可以分泌FLT3LG細(xì)胞因子，其作用是富集刺激性樹(shù)突狀細(xì)胞(stimulatory dendritic cells,SDCs)于腫瘤內(nèi)，而SDCs可以激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞并促進(jìn)其抗腫瘤免疫反應(yīng)，因此NK細(xì)胞可以促進(jìn)患者對(duì)PD-1抑制劑治療的反應(yīng)性。還有研究表明，通過(guò)IFN-γ等細(xì)胞因子預(yù)先激活腫瘤微環(huán)境中的STAT1/NK細(xì)胞軸，可以增加腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法的敏感性[35]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，在治療白血病和非小細(xì)胞肺癌患者時(shí)是安全、有效且具有生存益處的[36-37]。以上所有研究都說(shuō)明，NK細(xì)胞在PD-1信號(hào)通路阻斷療法中發(fā)揮著十分重要的作用。然而本研究結(jié)果顯示，PD-1單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)3種前列腺癌細(xì)胞系的殺傷效率與單獨(dú)NK細(xì)胞相比，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示PD-1單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用并不能提高NK細(xì)胞體外殺傷前列腺癌細(xì)胞系的效率。本研究結(jié)果表明PD-1單抗可能不適用于前列腺癌的治療，并且NK細(xì)胞過(guò)繼性回輸聯(lián)合PD-1抑制劑的治療策略可能并不適用于前列腺癌治療；但是這個(gè)研究結(jié)論的確定還有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)對(duì)三種效應(yīng)組殺傷3種靶細(xì)胞最高效率的比較分析，結(jié)果表明NK細(xì)胞與PD-1單抗+NK細(xì)胞效應(yīng)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且趨勢(shì)相同，除對(duì)靶細(xì)胞LNCaP的最高殺傷效率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，對(duì)靶細(xì)胞DU145和PC3的最高殺傷效率與CIK細(xì)胞效應(yīng)組之間差異極顯著。NK細(xì)胞對(duì)于靶細(xì)胞LNCaP和DU145細(xì)胞系的殺傷效率要高于CIK細(xì)胞對(duì)其殺傷效率；而相較于“NK細(xì)胞促進(jìn)PC3細(xì)胞系生長(zhǎng)”的結(jié)果，CIK細(xì)胞對(duì)PC3細(xì)胞系的殺傷效率最高能達(dá)到58.72%±8.08%。這說(shuō)明在未能明確“NK細(xì)胞促進(jìn)PC3細(xì)胞系生長(zhǎng)”機(jī)制的前提下，CIK細(xì)胞可能更適合作為前列腺癌治療的免疫細(xì)胞；或者以NK細(xì)胞作為前列腺癌治療的免疫細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)不起作用或疾病進(jìn)展，則應(yīng)當(dāng)停止NK細(xì)胞治療或改為CIK細(xì)胞治療。PC3細(xì)胞、DU145細(xì)胞是激素抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，而LNCaP細(xì)胞是激素敏感性前列腺癌(metastatic hormone-sensitive prostate cancerm，mHSPC)，為什么NK細(xì)胞、PD-1+NK對(duì)LNCaP的殺傷效果好，而對(duì)PC3細(xì)胞反而無(wú)殺傷力？甚至促進(jìn)其生長(zhǎng)？可能的機(jī)制是這種治療對(duì)mHSPC效果好而對(duì)于CRPC效果差甚至起到反作用。因此，NK細(xì)胞、PD-1+NK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療對(duì)于早期的激素敏感性前列腺癌可能有一定的治療作用,但具體效果仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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