劉亞芹，王 輝，楊霽虹，周漢琛，黃建琴，雷攀登

安徽省農業(yè)科學院 茶葉研究所，安徽 黃山 245000

祁門紅茶色澤烏潤、香氣馥郁、滋味甜醇，是我國十大名茶之一[1]。祁門紅茶的風味形成與工藝密切相關，其初制工藝為萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥，其中發(fā)酵是紅茶色香味等品質形成的關鍵環(huán)節(jié)之一[2]。發(fā)酵是高溫高濕下利用酶促作用使多酚類物質氧化及香氣前體物質轉化，從而達到紅茶紅湯紅葉、甜香鮮醇的品質特征[3]。因此，探索祁門紅茶發(fā)酵過程中關鍵滋味成分變化，是了解祁門紅茶品質形成的重要途徑。目前認為影響紅茶滋味的主要物質有多酚類、氨基酸、咖啡堿、糖類和果膠物質等[1]；其中，在發(fā)酵過程中兒茶素是生化反應主體物質，而茶黃素是重要指標，對紅茶茶湯醇厚度、鮮爽度及湯色亮度起著重要作用[4-6]。

紅茶的發(fā)酵程度受多方面因素影響，主要基于人工經驗來判斷，缺乏客觀性與科學性。目前，針對紅茶發(fā)酵在適度判別方法等方面得到廣泛研究。錢園鳳[7]基于EGCG含量、Hab值建立決策樹模型及顏玲[8]利用近紅外光譜技術建立判別模型及YANG[9]根據高光譜和化學計量建立RF模型等，都有較好的預測效果。有學者認為，發(fā)酵葉葉色、湯色的色差Lab值和圖像RGB值的變化可以作為紅茶適度發(fā)酵判別的方法[10-12]。何華鋒[13]根據發(fā)酵過程中香氣的變化進行工夫紅茶發(fā)酵適度的預測，發(fā)現5個單萜類香氣組分與發(fā)酵適度相關性較顯著。關于滋味成分與發(fā)酵適度的相關性也有相關研究。據研究，茶黃素可作為發(fā)酵程度的判斷指標，茶黃素含量最高點即為發(fā)酵最適點[11,14]。桂安輝等[15]基于動態(tài)聚類分析認為，紅茶發(fā)酵過程中兒茶素、茶黃素含量有變化規(guī)律，可作為發(fā)酵適度判別依據之一。

本研究擬通過感官審評判定不同紅茶在制樣品的發(fā)酵程度，對滋味成分氨基酸、兒茶素、咖啡堿、茶黃素進行測定，利用Dot值、OPLSDA模型和VIP值綜合分析出區(qū)別紅茶發(fā)酵程度的關鍵滋味成分。通過試驗研究，以期為紅茶適度發(fā)酵提供一個理論指標及參數指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

祁門紅茶樣品制備所用茶樹品種為舒茶早（C. sinensis var. sinensis. cv Shuchazao）和鳧早2 號（C. sinensis var. sinensis. cv Fuzao 2），來自安徽省農業(yè)科學院茶葉研究所試驗基地的五年生茶樹。鮮葉采摘時間2021年4月13日，采摘標準以一芽二葉初展為主，鮮葉重量約10 kg。沒食子酸、咖啡堿、4種茶黃素、8種兒茶素標準品，上海源葉生物公司；茶氨酸標準品，北京百靈威科技有限公司；15種游離氨基酸標準品，德國Sykam公司。

1.2 儀器與設備

35型揉捻機和碧螺春烘干機，均為浙江上洋茶葉機械有限公司；C18色譜柱（1.9 μm，2.1*100 mm），美國沃特世科技有限公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；S-433D氨基酸分析儀，德國Sykam公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵樣制備

發(fā)酵室溫度25℃，相對濕度90% RH。發(fā)酵前 90 min，每 30 min 取樣 1 次，之后每 15 min取樣一次，直至195 min，共計取樣11次。取樣后進行干燥，磨粉后-80℃保存。

1.3.2 感官審評

參考國家標準GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[16]，由經過培訓且有高級評茶員及以上資質的5名人員組成審評小組，對不同發(fā)酵程度樣品的滋味從青澀感與醇厚度兩方面進行評價及判定。

1.3.3 茶黃素含量測定

前處理：稱取0.2 g茶樣，加入70%甲醇溶液5 mL，70℃水浴中浸提10 min，冷卻至室溫，3500 r/min 離心 10 min，上清液轉移至 10 mL 容量瓶。殘渣用70%甲醇溶液按以上操作重復提取一次，合并提取液定容至10 mL，搖勻。取上述提取液5 mL置于10 mL容量瓶中，用EDTA-抗壞血酸溶液定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，待測。

檢測條件：C18色譜柱，流動相：乙腈（20%），2%乙 酸（80%）； 流 速：0.2 mL/min，停止時間15 min。進樣量5 μL；檢測波長：380 nm；柱溫：35℃。

1.3.4 兒茶素、沒食子酸和咖啡堿含量測定

兒茶素、沒食子酸前處理：稱取0.2 g茶樣，加 0.9 g 氯化鎂及60 mL沸水，沸水浸提20 min，浸提完畢后趁熱減壓過濾，濾液移入100 mL容量瓶中，冷卻后，用水定容，混勻，過膜，待測。

咖啡堿前處理：稱取0.2 g茶樣，加入5 mL沸水，70℃水浴浸提10 min，浸提后冷卻至室溫，3500 r/min 離心 10 min，將上清液轉移至 10 mL容量瓶。殘渣再重復提取一次，定容至10 mL容量瓶中，搖勻，過0.45 μm濾膜，待測。

檢測條件：C18色譜柱，流動相：A相：2%乙酸；B相：乙腈。梯度洗脫條件：0 ～ 3 min（95%A），3 ～ 5 min（80%A），5 ～ 18 min（95%A），流速：0.2 mL/min。進樣量 5 μL；檢測波長：278 nm；柱溫：35℃。

1.3.5 氨基酸含量測定

前處理：隨機稱取0.25 g磨碎茶樣（約40目），裝入茶包中，茶包封口后置于具塞25 mL三角瓶中，加8 mL沸水，90℃水浴8 min，倒出至25 mL容量瓶中，重復提取3次，定容至25 mL。每個樣品平行提取3次。提取液稀釋200倍，過0.45 μm濾膜，待測。

采用氨基酸分析儀測定待測樣品中游離氨基酸組分含量，分析條件同周漢琛等[17]的方法。

1.4 數據分析

主要滋味成分的含量計算以各物質標準品的峰面積為橫坐標、濃度為縱坐標作標準曲線，用樣品的峰面積求出各組分含量，再換算出茶樣中各組分的含量。單因素方差分析（ANOVA）LSD多重檢驗、Pearson相關性分析采用SPSS 22（IBM，美國）進行。正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）采用SIMCA 14.1軟件（Umetrics，瑞典）進行。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵程度判定

根據感官評價，從青澀和醇厚感判定為三個等級，分別是發(fā)酵偏輕（青澀感明顯）、發(fā)酵適宜（無青澀感，有醇厚度）和發(fā)酵偏重（無青澀感，醇厚度下降）。結果如表1所示，鳧早2號茶樣在發(fā)酵過程中從發(fā)酵開始到發(fā)酵105 min有青澀感，判定為“發(fā)酵偏輕”。從120 min后，滋味厚度增加，出現醇厚感，青澀感消失；發(fā)酵165 min時，滋味醇厚爽口，品質最佳，感官評價分值最高，發(fā)酵進程判定為“發(fā)酵適宜”。發(fā)酵180 min后，滋味變淡，醇厚度下降，此時發(fā)酵程度開始偏重。舒茶早茶樣審評結果和鳧早2號有相似規(guī)律：從發(fā)酵開始到105 min，滋味呈現“青澀感”，發(fā)酵120 min到165 min，滋味醇厚度增加，無青澀感，發(fā)酵適宜；其中在發(fā)酵135 min時滋味最好，品質得分最高。在發(fā)酵180 min時，滋味醇厚度減弱，發(fā)酵程度偏重。

表1 不同發(fā)酵程度茶樣感官審評結果和分類Table 1 Sensory evaluation and classification of Keemun black tea with different fermentation levels

2.2 不同發(fā)酵程度茶樣主要滋味成分變化

茶黃素是茶葉加工過程中形成的色素，也是紅茶色素的主要成分之一。目前，已分離鑒定的茶黃素主要有12種，其中最主要的成分4種，分別為茶黃素（TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（TF-3’-G）和茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（TFDG）[18-19]。對不同發(fā)酵程度樣品的茶黃素進行測定結果如圖1：隨著發(fā)酵程度的增加，舒茶早和鳧早2號兩個品種茶樣的茶黃素總量稍有增加，分別從發(fā)酵偏輕（I）的8.65 mg/g和 4.10 mg/g增加到發(fā)酵過度（III）8.66 mg/g 和 5.52 mg/g。其中，TF和TF-3’-G含量降低，而TF-3-G和TFDG的含量呈增高趨勢，與前人研究結果一致[20-21]?？傮w上，舒茶早比鳧早2號的紅茶在制品茶黃素含量高。鳧早2號在制紅茶樣品中，與發(fā)酵偏輕（I）相比，TF-3-G的含量在發(fā)酵過度（III）時增加了43.75%，而TFDG增加了86.52%。

圖1 主要滋味成分含量變化熱圖Figure 1 Heat map of changes in contents of major taste components

游離氨基酸是茶葉中的重要滋味成分，不同種類氨基酸的呈味屬性有所差異。目前已經鑒定的氨基酸中，鮮味主要是茶氨酸（THE）、谷氨酸（GLU）、天冬氨酸（ASP），甜味是丙氨酸（ALA）、甘氨酸（GLY）和絲氨酸（SER），苦味是精氨酸（ARG）[22-23]。這些氨基酸也是茶湯中的主要氨基酸，占80%左右[24]。圖1結果表明：隨著發(fā)酵進程的增加，游離氨基酸總量總體上逐漸降低，與余鵬輝[25]、宮連瑾[26]等人研究結果類似。舒茶早和鳧早2號兩個品種，發(fā)酵偏重（III）茶樣氨基酸總量分別為82.98 mg/g和80.23 mg/g，比發(fā)酵偏輕（I）分別降低31.2%和9.4%。不同發(fā)酵程度茶樣中，發(fā)酵適度（II）茶樣的氨基酸含量明顯低于發(fā)酵偏輕（I）的茶樣，舒茶早和鳧早2號兩個品種均有類似規(guī)律，而發(fā)酵偏重（III）茶樣的氨基酸含量總體上稍低于發(fā)酵偏輕（I），且由表1可知，發(fā)酵偏重（III）茶樣的爽口度弱于發(fā)酵適度（II）。

兒茶素是多酚類物質的主體成分，包括酯型兒茶素和非酯型兒茶素。兒茶素具有苦澀味，在紅茶發(fā)酵過程中氧化形成有色氧化物[3,27]。對不同發(fā)酵程度樣品的兒茶素含量進行測定，結果表明：舒茶早和鳧早2號兩個品種紅茶在制品的兒茶素（酯型兒茶素和非酯型兒茶素）的含量隨發(fā)酵進程顯著下降，分別從36.78 mg/g和 18.52 mg/g 降至 13.51 mg/g 和 6.96 mg/g，且下降速度II快于III。兒茶素含量過高，茶湯濃苦，但兒茶素含量過低，茶湯濃度降低，湯感醇和。可見，茶湯中兒茶素含量不能過高或過低。

咖啡堿是茶葉重要的滋味成分，有苦味，但與茶黃素、茶紅素締合形成的復合物有鮮爽味[28]，此外，氨基酸能減弱其苦味強度，而茶多酚能增強其苦味強度[29]。圖1的結果可看出，舒茶早紅茶在制品在發(fā)酵進程中咖啡堿含量呈增加趨勢，而鳧早2號呈下降趨勢，二者相反，但總體上咖啡堿含量較為穩(wěn)定。

2.3 滋味成分貢獻度

不同的滋味成分有不同的滋味屬性，且對茶湯滋味的貢獻大小不一。Dot值指某一滋味成分濃度與其閾值的比值，可以避免以滋味成分含量反映滋味貢獻大小的問題，是評價滋味成分對樣品貢獻率的一種重要方法。若Dot值＞ 1，則表明該成分對茶湯滋味有顯著貢獻；反之，則貢獻較小。Dot值越大其滋味貢獻度越高[30-32]。

基于不同發(fā)酵程度在制品的主要滋味成分含量，通過文獻查找各滋味成分的呈味閾值[32-33]，對所測樣品進行滋味貢獻度分析。由表2可知，不同茶樹品種加工成的祁門紅茶品質不一，貢獻大小的滋味成分存在差異。鳧早2號發(fā)酵在制品中的平均Dot值＞ 1的共有7種，TF-3-G、TFDG、TF、TF-3’-G、GA、CAF 和 EGCG；舒茶早中主要滋味貢獻物質有4種，包括TF-3-G、TFDG、GA和CAF?？梢?，在鳧早2號和舒茶早不同發(fā)酵程度在制品中，對呈味貢獻大的共性物質主要有4種，即TF-3-G、TFDG、GA和CAF。

表2 祁門紅茶主要滋味成分Dot值Table 2 Dot value of main flavor components in Keemun black tea

續(xù)表

2.4 影響發(fā)酵程度的潛在關鍵成分

為分析不同發(fā)酵程度的化合物的差異，以4個茶黃素組分、9個兒茶素組分、16個氨基酸組分及咖啡堿的DOT值作為變量，采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）對不同發(fā)酵程度祁門紅茶在制品進行聚類分析。如圖2A和圖2B所示，模型可有效地將鳧早2號和舒茶早的不同發(fā)酵程度祁門紅茶在制品區(qū)分為3個區(qū)域，鳧早2號和舒茶早的這3個分區(qū)與感官品質的結果較為一致。發(fā)酵0 ～ 105 min為發(fā)酵程度偏輕，120 ～ 165 min 為發(fā)酵適宜，180 ～ 195 min為發(fā)酵偏重。

圖2 OPLS-DA模型構建Figure 2 Model construction of OPLS-DA

此外，根據圖2C和圖2D，鳧早2號和舒茶早的Q2回歸直線與Y軸的截距分別是-0.51、-0.649，說明OPLS-DA判別模型不存在過擬合現象，模型較為可靠。

為了進一步篩選出影響這些結果的差異物質，針對三種發(fā)酵程度（I、II、III）類型進行VIP分析。一般認為物質的VIP值＞ 1，則說明該物質是影響較大的差異物質。結果（表3）發(fā)現，不同品種中影響發(fā)酵程度的滋味成分存在差 異。GA、TFDG、EGCG、TF-3-G、TF、TF-3’-G是區(qū)別鳧早2號品種紅茶發(fā)酵適度的重要化合物，而EGCG、ECG、GA、TFDG、TF、TF-3-G、EGC、TF-3’-G、CAF是區(qū)別舒茶早品種紅茶發(fā)酵適度的重要化合物。其中共有的重要化合物是GA、TFDG、EGCG、TF-3-G、TF和TF-3’-G這6種滋味成分。

表3 基于OPLS-DA模型的差異物質VIP值分析Table 3 Analysis of VIP values of different substances based on OPLS-DA model

3 結論與討論

對舒茶早和鳧早2號兩個茶樹品種鮮葉加工祁門紅茶不同發(fā)酵程度（發(fā)酵時間0 ～ 195 min）茶樣進行感官審評的判定，將發(fā)酵程度分為發(fā)酵偏輕（I）、發(fā)酵適宜（II）及發(fā)酵偏重（III）3類。對不同發(fā)酵程度（I、II、III）茶樣進行茶黃素、兒茶素、咖啡堿和氨基酸的測定結果發(fā)現，發(fā)酵進程中，茶黃素的總量稍有增加，兒茶素類物質劇烈降低，但降低速度越來越慢，這可能是由于兒茶素的下降與茶黃素的生成高度相關[34]。紅茶發(fā)酵時，兒茶素與酶結合發(fā)生酶促氧化生成大量茶黃素類物質[35]，隨著發(fā)酵的進行，多酚氧化酶的催化能力變弱及多酚類物質變少使得兒茶素類物質下降的趨勢變緩。游離氨基酸類物質總體上減少，這可能是因為在發(fā)酵進程中氨基酸轉化為其他物質，一是在酶的作用下產生了脫羧和脫氨作用，從而轉化為芳香物質如醛、醇、酸等；二是氨基酸與多酚類、糖類結合形成醌、醛、酸、醇等物質；三是氨基酸與茶黃素及茶紅素相互作用，形成深暗色的高聚合物[36-37]。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵偏輕（I）茶樣兒茶素含量較高，茶湯青澀；發(fā)酵適度（II）茶樣兒茶素含量降低，茶黃素含量增加，形成茶湯醇厚爽口的品質。發(fā)酵偏重（III）茶樣兒茶素保留量低，茶湯濃度降低，滋味醇和。

通過Dot值計算發(fā)現，THE和GLU都是所測樣品中主要的鮮味氨基酸成分，在鳧早2號和舒茶早所制紅茶中，THE的含量高于GLU，但是Dot值相差5 ～ 8倍，這是由于THE閾值較大，導致對鮮味的貢獻小于GLU。此外，鳧早2號茶樣中的TF-3’-G、GA、EGCG和舒茶早茶樣中的TF-3-G、TFDG、GA、EGCG在某些在制品中Dot ＜ 1，推測這些物質可能是導致不同發(fā)酵程度紅茶品質差異的重要物質。在鳧早2號和舒茶早不同發(fā)酵程度在制品中，對呈味貢獻大的共性物質主要有4種，分別是TF-3-G、TFDG、GA和CAF。進一步利用OPLSDA模型和VIP值分析，篩選到3種貢獻差異物質，分別是GA、TFDG和TF-3-G，其中GA的貢獻值大于其余茶黃素組分。Scharbert等[32,38]研究認為兒茶素是紅茶茶湯澀味的主要來源，咖啡堿是紅茶茶湯的苦味貢獻者，但是茶黃素、氨基酸及有機酸等滋味單體對茶湯的澀味、鮮味及酸味沒有顯著貢獻。這可能是因為茶湯中茶黃素、氨基酸等單體成分與其他物質如兒茶素的共同作用使茶湯呈現澀、鮮、酸的風味特征。桂安輝[12]采用方差分析研究發(fā)現，在“鳩坑種”工夫紅茶發(fā)酵適度判別時，EC大于其他兒茶素組分，而兒茶素組分大于茶黃素組分。陳冬等[39]對3種優(yōu)質祁門紅茶的滋味特征分析結果表明，茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸3個重要滋味成分存在顯著差異，相關性分析證明祁門紅茶的滋味是由多種成分共同作用的結果。

本試驗結果梳理了不同發(fā)酵程度下紅茶發(fā)酵滋味成分變化規(guī)律，同時篩選出區(qū)別紅茶發(fā)酵程度的關鍵滋味成分，為紅茶適度發(fā)酵提供一個理論指標，可對紅茶生產實踐具有指導意義。但試驗茶樹品種、滋味成分等不夠豐富，成分間的相互作用不明確，研究尚存在不足。后續(xù)試驗可豐富茶樹品種及滋味成分，考慮不同成分間的相互作用，以更加全面解析紅茶發(fā)酵過程中滋味成分的變化，篩選出貢獻物質，更加精準地實現對紅茶發(fā)酵適度的判別。