王新超，王 璐，郝心愿，李娜娜，丁長慶，黃建燕，楊亞軍

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

茶樹起源于我國西南地區(qū)[1]，喜溫畏寒，溫度是影響其分布范圍、產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益的最重要環(huán)境因子之一。隨著茶樹種植范圍的不斷擴(kuò)大和全球氣候變化的加劇，溫度對(duì)茶樹生長及產(chǎn)量的影響加劇。無論是年生育周期還是總生育周期，茶樹都會(huì)碰到多種環(huán)境逆境的脅迫，其中低溫嚴(yán)重限制了茶樹生長發(fā)育、產(chǎn)量、種植范圍和茶葉品質(zhì)。

茶樹的低溫脅迫分為兩種：越冬期脅迫和芽萌發(fā)以后的“倒春寒”脅迫。越冬期脅迫是冬季0℃以下低溫對(duì)茶樹生長的影響，抗寒性差的品種其成熟葉片受到低溫?fù)p傷后變得枯焦脫落，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致茶樹死亡。而“倒春寒”則是指初春氣溫上升，茶芽萌動(dòng)伸展后突然發(fā)生的急劇降溫導(dǎo)致幼嫩新梢受凍褐變、焦枯壞死。受“倒春寒”危害的茶樹茶葉品質(zhì)下降，產(chǎn)量銳減甚至絕收，給茶農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此“倒春寒”是對(duì)茶葉生產(chǎn)影響最大的氣象災(zāi)害之一[2]。

茶樹越冬期抗寒性是茶樹在長期適應(yīng)低溫脅迫過程中逐步發(fā)展和形成的一種獲得性遺傳能力，需要通過一定時(shí)間的低溫鍛煉才能表現(xiàn)出來，這個(gè)過程稱之為冷馴化（cold acclimation）[3]。茶樹冷馴化的臨界溫度為7℃左右（15日平均氣溫），脫馴化的臨界溫度為9℃左右（15日平均氣溫）。通過冷馴化以后的茶樹抗寒力提高，而脫馴化以后茶樹的抗寒力又減弱[4]。而茶樹的新梢在組織結(jié)構(gòu)、葉片含水量、糖組分和細(xì)胞器發(fā)育等方面與成熟葉明顯不同[5]，抗寒性弱于成熟葉片。新梢萌發(fā)以后遭遇突然降溫的“倒春寒”，對(duì)低溫非常敏感，非常容易受到傷害。目前，茶樹越冬期抗寒性機(jī)理取得了系列研究結(jié)果，而“倒春寒”響應(yīng)機(jī)理研究則剛剛起步。由于“倒春寒”對(duì)茶產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的影響更大，因此“茶樹對(duì)‘倒春寒’的響應(yīng)機(jī)制及其防控技術(shù)”在2019年被中國茶葉學(xué)會(huì)遴選為茶學(xué)十大科學(xué)問題和工程技術(shù)難題之一。

有關(guān)茶樹抗寒的研究進(jìn)展前人已有綜述[6-8]。本文在前人綜述的基礎(chǔ)上，吸收最新研究結(jié)果，簡要回顧茶樹抗寒機(jī)制取得的研究進(jìn)展，并結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的趨勢提出未來的研究重點(diǎn)，供相關(guān)研究工作參考。

1 細(xì)胞學(xué)機(jī)制

茶樹的越冬期抗寒性與其葉片結(jié)構(gòu)密切相關(guān)?？购詮?qiáng)的茶樹品種葉片具有如下結(jié)構(gòu)特征：葉肉組織發(fā)達(dá)，分化程度高；葉片總厚度、角質(zhì)層厚度、上表皮厚度和柵欄組織的厚度大；柵欄組織細(xì)胞細(xì)長，排列緊密；柵欄組織厚度/海綿組織厚度和柵欄組織厚度/葉肉厚度的比值高[9-11]。生產(chǎn)上阿薩姆變種的抗寒性低于茶變種，也正是由于它們在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上存在上述的差異[10]。Yue等[12]的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，冷馴化對(duì)茶樹葉片表面的細(xì)胞排列、氣孔的開閉等均沒有明顯的影響，但葉綠體上的變化較明顯，冷馴化前的葉綠體中類囊體排列緊密，通過馴化后葉綠體上的類囊體發(fā)生解離分散，且嗜鋨顆粒增多并在葉綠體上聚集，脫馴化后類囊體又出現(xiàn)堆積，嗜鋨顆粒的數(shù)量逐漸減少。

2 生理學(xué)機(jī)制

茶樹受到低溫脅迫后會(huì)發(fā)生一系列的生理生化響應(yīng)，以應(yīng)對(duì)低溫的不利影響。生物膜是生物體細(xì)胞與外界環(huán)境隔離的界面結(jié)構(gòu)，在低溫脅迫下生物膜減輕或避免膜脂相變的發(fā)生是植物抵御低溫的一種重要策略?？购詮?qiáng)的茶樹品種葉片生物膜結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不易受低溫的影響，質(zhì)膜的透性較小[13]。楊亞軍等發(fā)現(xiàn)，越冬期抗寒性強(qiáng)的品種‘龍井43’的成熟葉片不飽和脂肪酸指數(shù)和亞麻酸（18∶3）比例在冷馴化-低溫脅迫-和脫馴化階段呈現(xiàn)出“低-高-低”的變化趨勢，而抗寒性弱的品種‘大葉云峰’則無明顯變化規(guī)律。還發(fā)現(xiàn)低溫期間膜蛋白含量在低溫脅迫時(shí)大幅度上升，且經(jīng)低溫誘導(dǎo)后出現(xiàn)了兩種新的蛋白組分，在脫馴化后消失[14]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）的積累損害植物膜系統(tǒng)是低溫對(duì)植物造成的損傷結(jié)果之一，清除ROS能力的高低是茶樹品種間抗寒性差異的決定性因素之一[15]。多個(gè)研究結(jié)果表明，越冬期抗寒性強(qiáng)的茶樹品種的抗氧化保護(hù)性酶SOD和CAT的活性較高，且抗寒品種SOD同工酶譜帶數(shù)及同工酶活性具有明顯優(yōu)勢[16-18]。胞內(nèi)可溶性物質(zhì)的濃度影響著冰晶的形成，其高低決定了細(xì)胞的冰點(diǎn)高低和抗寒力的大小。影響胞內(nèi)可溶性物質(zhì)含量有兩個(gè)因素，一是胞內(nèi)水分的含量和狀態(tài)，即自由水/束縛水的比例；二是胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的類型和含量。在茶樹完成冷馴化后，葉片中水分總量和自由水含量下降，束縛水含量上升，束縛水/自由水的比例也升高，與之同步的是胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度也升高，如可溶性糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖和棉子糖、甜菜堿、γ-氨基丁酸（GABA）等物質(zhì)的含量顯著增加[12,19-21]，而且在抗寒性不同的品種間存在差異[22-23]。黃海濤等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)抗寒性茶樹品種的秋季新梢POD活性和可溶性糖含量較高，而弱抗寒性的茶樹品種POD活性和可溶性糖含量較低。在低溫脅迫條件下，茶樹新梢的生長、光合作用、類黃酮合成等次級(jí)代謝途徑受到顯著影響，淀粉代謝增強(qiáng)，以保護(hù)新梢免受春季低溫危害[25]。

3 分子機(jī)制

茶樹的抗寒性是一個(gè)受多基因控制的復(fù)雜遺傳性狀，解析其調(diào)控分子機(jī)制對(duì)抗寒品種選育和抗寒技術(shù)的開發(fā)都具有重要意義。進(jìn)入21世紀(jì)以后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及高通量測序技術(shù)的普遍應(yīng)用，特別是“組學(xué)”技術(shù)為代表的技術(shù)手段的應(yīng)用，茶樹抗寒性的分子機(jī)制從宏觀到微觀不同層面取得了一系列研究成果。

3.1 茶樹抗寒性分子機(jī)制的宏觀研究

早期茶樹抗寒分子機(jī)制的宏觀研究主要是基于mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）或者cDNA-AFLP等技術(shù)，但由于通量低，分離的差異表達(dá)基因少，很難從宏觀層面把握抗寒的內(nèi)在本質(zhì)[26-28]。隨著高通量測序技術(shù)應(yīng)用于茶樹抗寒機(jī)理研究，推動(dòng)了抗寒分子機(jī)理研究的深入。Wang等[29]率先利用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和數(shù)字表達(dá)譜（Digital gene expression）技術(shù)研究了茶樹冷馴化不同階段的基因表達(dá)差異，篩選出1770條在冷馴化/對(duì)照和冷馴化/脫馴化兩組樣品間共同差異表達(dá)的基因（differential expression gene，DEG），涉及到冷信號(hào)感知與傳導(dǎo)、冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、質(zhì)膜穩(wěn)定性和滲透響應(yīng)、ROS的清除等，其中碳水化合物代謝途徑和鈣離子信號(hào)途徑在茶樹冷馴化誘導(dǎo)抗寒性提高中發(fā)揮著核心作用。Li等[30]比較了抗寒的茶變種‘舒茶早’與不抗寒的阿薩姆變種‘英紅9號(hào)’在冷馴化過程中的基因表達(dá)差異，共鑒定出在兩個(gè)品種間共有的978個(gè)DEG，涉及到光合作用、激素信號(hào)傳導(dǎo)、植物-病原菌互作的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑，其中Lhca 2的下調(diào)表達(dá)和SnRK 2.8的上調(diào)表達(dá)與‘舒茶早’的抗寒性關(guān)系密切。Wang等[15]對(duì)不同抗寒性茶樹品種的研究發(fā)現(xiàn)，除了鈣離子信號(hào)途徑及碳水化合物代謝途徑外，調(diào)控ROS的產(chǎn)生和清除途徑也是茶樹適應(yīng)冷馴化的主要機(jī)制之一，而且OST1/SnRK2.6-ICE1、MAPK3-ICE1調(diào)控的低溫響應(yīng)過程和活性氧的清除能力是影響茶樹品種間冬季低溫抗性差異的主要原因。Wu等[31]綜合轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究了冰凍狀態(tài)下（＜-10℃）茶樹葉片與正常生長溫度下（15℃）葉片的差異，鑒定出3880個(gè)DEG和353個(gè)差異代謝物，深入分析發(fā)現(xiàn)以MAPK和ABA為中心的Pyr/PYL-PP2CSnRK2信號(hào)傳導(dǎo)途徑在冰凍脅迫下起著重要作用，苯丙烷合成、黃酮和黃酮醇合成、類黃酮合成等3個(gè)代謝途徑對(duì)茶樹的抗凍有較大貢獻(xiàn)。除了冷馴化以外，茶樹也會(huì)遇到突然的降溫。Hao等[32]利用人工氣候室模擬了冷馴化和突然降溫過程，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)冷馴化和突然的降溫在分子調(diào)控機(jī)制上有所區(qū)別：細(xì)胞壁重組在冷馴化過程中對(duì)提高抗寒性具有重要作用，碳代謝和脂肪酸代謝途徑是冷馴化過程中的主要代謝途徑，而突然降溫過程中差異表達(dá)基因主要富集在質(zhì)膜和ROS積累途徑上。一些研究認(rèn)為，茶樹葉片表面冰核活性細(xì)菌（ice nucleation active bacteria，INA 細(xì)菌）的多少也是引起茶樹低溫凍害的誘因之一[33]。有趣的是，基于重測序和群體分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在長期的馴化選擇過程中抗寒性強(qiáng)的茶變種抗INA的基因選擇強(qiáng)度上遠(yuǎn)高于不抗寒的阿薩姆變種，這為抗寒品種的選育提供了新的思路[34]。

以上的研究多集中于成熟葉，而新梢的低溫響應(yīng)機(jī)制與成熟葉有顯著差異。Li等[8]比較了茶樹新梢與成熟葉在冷脅迫下的耐寒性和表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)新梢耐寒性遠(yuǎn)低于成熟葉，細(xì)胞膜完整性破壞和光合系統(tǒng)的氧化損傷是造成幼嫩葉片低溫傷害的主要原因。通過分析人工模擬“倒春寒”低溫脅迫下茶樹新梢的轉(zhuǎn)錄組和代謝組，確定了多個(gè)差異基因富集通路，揭示了MAPK依賴的乙烯信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路是新梢響應(yīng)低溫脅迫的主要早期信號(hào)，隨后下游的ICE-CBF-COR低溫響應(yīng)信號(hào)途徑被激活，從而增加抗寒性[25]。

除了常規(guī)的基因表達(dá)差異轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，表觀調(diào)控（DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、miRNA等）、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（如可變剪切、RNA穩(wěn)定性、RNA沉默等）也是參與植物低溫抗性調(diào)控的重要機(jī)制[35-36]。Zhang等[37]從‘迎霜’和‘白葉1號(hào)’兩個(gè)品種冷脅迫樣品中分別鑒定出31個(gè)和46個(gè)上調(diào)的miRNA、43個(gè)和46個(gè)下調(diào)的miRNA，這些miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因涉及到生長發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及脅迫響應(yīng)等過程，其中miR156、miR159和miR396在不同低溫敏感型品種間表現(xiàn)出不同的冷脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)模式。Zheng等[38]整合了低溫（4℃）和冷凍（-5℃）處理樣品的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）和miRNA測序（sRNA-Seq）數(shù)據(jù)，鑒定出22個(gè)與低溫響應(yīng)相關(guān)的miRNA-mRNA對(duì)。周艷華等[39]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹冷馴化過程中同時(shí)發(fā)生了甲基化和去甲基化現(xiàn)象，但總體變化趨勢表現(xiàn)為甲基化水平的增加，表明DNA甲基化參與了茶樹的冷馴化過程。Tong等[40]建立了茶樹低溫脅迫下的DNA甲基化圖譜，與對(duì)照相比，在低溫處理樣品中共鑒定出6 834個(gè)DEG和192 869個(gè)差異甲基化區(qū)段（differentially methylated regions，DRM），在冷響應(yīng)過程中檢測到上調(diào)DEG數(shù)多于下調(diào)的，這與大量的DRM的去甲基化有關(guān)。24 519個(gè)與DRM相關(guān)的基因被鑒定，其中4 338個(gè)與鑒定出的DEG重復(fù)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)它們大多與冷脅迫響應(yīng)有關(guān)。有意思的是，3個(gè)被研究證實(shí)的冷響應(yīng)基因CsCBF4、CsUGT91Q2和CsbZIP18在冷脅迫過程中上調(diào)表達(dá)，在它們的啟動(dòng)子和基因本體區(qū)域檢測到許多去甲基化的基因組區(qū)域，而且DNA甲基化在冷脅迫24 h內(nèi)降到最低，說明DNA甲基化參與茶樹冷響應(yīng)的早期調(diào)控?？勺兗羟校╝lternative splicing）是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，即從前體mRNA中產(chǎn)生一個(gè)以上的mRNA轉(zhuǎn)錄本，有利于提高植物基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的多樣性[41]。Li等[42]繪制了茶樹冷馴化過程中可變剪切圖譜，發(fā)現(xiàn)41%的基因發(fā)生了可變剪切，并且可變剪切事件在冷馴化過程中快速上升，而脫馴化后快速下降。值得注意的是，發(fā)生可變剪切的差異基因數(shù)目在冷馴化過程中逐漸增加，這些基因富集于抗氧化酶系統(tǒng)和糖代謝途徑，表明可變剪切事件在茶樹冷馴化過程中起著重要作用。染色質(zhì)可及性（chromatin accessibility）是指核酸大分子能夠與染色質(zhì)上的DNA進(jìn)行物理接觸的程度，由核小體的占據(jù)度和拓?fù)浣M織以及染色質(zhì)結(jié)合因子與DNA的結(jié)合來決定，在生長發(fā)育及外界刺激過程中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，是一種重要的表觀基因組表達(dá)調(diào)控指標(biāo)[43]。一項(xiàng)研究繪制了首張冷脅迫下茶樹的染色質(zhì)可及性和翻譯組圖譜，發(fā)現(xiàn)冷脅迫在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平影響茶樹的翻譯效率，一批基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平快速響應(yīng)冷脅迫，為了解茶樹靈活響應(yīng)冷脅迫的基因表達(dá)調(diào)控提供了新的視角[44]。

3.2 茶樹抗寒相關(guān)基因鑒定及功能研究

茶樹對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)以及抗性的形成，無論是細(xì)胞學(xué)層面還是生理生化層面，最根本的原因還是受到抗寒相關(guān)基因及其調(diào)控單元的控制。因此，對(duì)抗寒相關(guān)基因的鑒定及其功能的研究是茶樹抗寒分子機(jī)制研究的重點(diǎn)之一。

3.2.1 信號(hào)感知與傳導(dǎo)相關(guān)基因

感知低溫脅迫信號(hào)進(jìn)而傳導(dǎo)到下游以啟動(dòng)防御機(jī)制是植物抵抗低溫的第一步。鈣離子（Ca2+）作為第二信使，在植物中參與許多生物學(xué)過程。植物對(duì)低溫信號(hào)的初始反應(yīng)可能是細(xì)胞膜上的Ca2+通道，當(dāng)受到低溫刺激后植物細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度在短時(shí)間內(nèi)迅速增加，從而激發(fā)下游耐寒防御反應(yīng)。課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)鈣離子信號(hào)通路在茶樹低溫響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，隨后茶樹鈣離子信號(hào)通路的關(guān)鍵基因如鈣調(diào)素蛋白（calmodulin proteins, CaMs）和類鈣調(diào)蛋白（CaM-like, CMLs）家族、鈣調(diào)磷酸酶B 類似蛋白（calcineurin B-like, CBL）家族和鈣依賴性蛋白激酶家族（calcium-dependent protein kinase，CPKs）等陸續(xù)被鑒定出來。黃玉婷等[45]克隆到2個(gè)鈣調(diào)素蛋白CsCaM 1和CsCaM 2，二者的表達(dá)受低溫和CaCl2處理誘導(dǎo)上調(diào)，而受鈣調(diào)素拮抗劑W7和鈣離子通道抑制劑LaCl3抑制。在已克隆的CsCML基因中，CsCML16、CsCML18-2和CsCML42受低溫顯著誘導(dǎo)[46-47]。通過鑒定茶樹中26個(gè)鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CPK） 基 因家族成員，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫抑制了10個(gè)CsCPKs基因的表達(dá)，而14個(gè)CsCPKs基因則至少在低溫處理的某一階段被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[48]。對(duì)其中一個(gè)基因CsCPK9的功能進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其正調(diào)控植物的抗寒性（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。對(duì)8個(gè)CsCBLs和25個(gè)CsCIPKs基因的表達(dá)及蛋白互作鑒定發(fā)現(xiàn)，CBL-CIPK模塊介導(dǎo)的茶樹新梢和成熟葉的低溫響應(yīng)存在不同的機(jī)制，CsCBL9-CsCIPK14b和CsCBL9-CsCIPK1/10b/12/14b可能分別調(diào)節(jié)茶樹新梢和成熟葉的低溫響應(yīng)[49]。

3.2.2 茶樹ICE-CBF-COR途徑相關(guān)基因

ICE-CBF/DREB-COR信號(hào)途徑在誘導(dǎo)植物抗寒響應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用，也是植物低溫響應(yīng)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中研究得最清晰的一條途徑。低溫條件下，ICE轉(zhuǎn)錄因子通過特異地結(jié)合CBF/DREB1基因啟動(dòng)子中的MYC元件（CANNTG）來調(diào)控CBF/DREB1基因的轉(zhuǎn)錄[50]。隨后，被激活的CBF/DREB1與許多低溫調(diào)控基因COR啟動(dòng)子中的CRT/DRE元件（CCGAC）結(jié)合，以促進(jìn)COR基因的表達(dá)來提高植物抗寒能力[51]。茶樹中克隆了1個(gè)CsICE1和6個(gè)CsCBF基因，與模式植物類似，CsICE1的表達(dá)基本上呈現(xiàn)組成型表達(dá)模式，而CsCBFs表達(dá)均受低溫處理顯著上調(diào)，且CsCBF1-3的表達(dá)在低溫處理1 d內(nèi)上調(diào)了超過100倍甚至1000倍。過表達(dá)CsCBF3能通過ABA非依賴性途徑增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒能力[52-53]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，CsICE1正調(diào)控CsCBF1和CsCBF3，但對(duì)CsCBF 2和CsCBF 5沒有調(diào)控作用。此外，CsWRKY 4 和 CsOCP 3 都能與 CsICE 1 相互作用并調(diào)節(jié)CsCBF1/3的轉(zhuǎn)錄，從而介導(dǎo)茶樹的脅迫響應(yīng)[54]。CORs即低溫調(diào)節(jié)或低溫響應(yīng)基因，分為受CBF調(diào)控和不受CBF調(diào)控兩類。茶樹中已有多個(gè)CsCORs被鑒定，如Wang等[55]從低溫處理茶樹中鑒定到10個(gè)上調(diào)表達(dá)的CsCORs，其主要編碼鋅指蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、甘氨酸豐富蛋白、早期光誘導(dǎo)蛋白、β-淀粉酶、查爾酮合酶和黃酮醇合酶等。轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出很多CsCORs基因，如β-1,3-葡聚糖酶相關(guān)基因（GLPs）、幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因（CLPs）、胚胎后期發(fā)生豐富蛋白相關(guān)基因（LEAs）等都受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[29]。β-淀粉酶（BAM）是植物中參與淀粉水解的關(guān)鍵酶類，郝心愿等[56]克隆了茶樹β-淀粉酶基因CsBAM3，發(fā)現(xiàn)它在成熟葉冷馴化初期即被顯著上調(diào)且一直保持較高表達(dá)水平，在新梢中也被低溫快速誘導(dǎo)表達(dá)，與前期發(fā)現(xiàn)冷馴化期間淀粉水解的結(jié)果吻合。從茶樹基因組中鑒定出48個(gè)CsLEAs基因，其中47個(gè)基因在低溫處理不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)，特別是CsLEA13/21/24/32/45受低溫處理誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)[57]。這些基因資源的鑒定為解析茶樹抗寒機(jī)理和培育抗寒品種提供了素材。有意思的是，茶樹的一個(gè)CsCOR基因中具有兩種不同的可變剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CsCOR-1和CsCOR-2，其中CsCOR-1在冷馴化期間受低溫誘導(dǎo)上調(diào)[42]。

3.2.3 碳水化合物代謝途徑相關(guān)基因

如前所述，無論是在成熟葉還是在新梢中，碳水化合物代謝途徑在茶樹低溫響應(yīng)中都起著重要的作用。因此，對(duì)該途徑的基因鑒定及功能研究是茶樹抗寒研究的重點(diǎn)之一。Yue等[12]通過分析自然冷馴化過程中59個(gè)與淀粉代謝、可溶性糖代謝、糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因（如CsINVs、CsSnRK1.2、CsHXK3、CsSWEETs和CsBAM3等）受低溫調(diào)控，并提出了一個(gè)糖介導(dǎo)的茶樹低溫脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)模型。隨后，Qian等[58-59]明確了7個(gè)低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化酶基因（CsINVs），并通過在擬南芥中過表達(dá)CsINV5，闡明其能促進(jìn)蔗糖水解，提高相應(yīng)的己糖與蔗糖的比例，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒能力。Li等[60]明確了己糖激酶基因CsHXK1/3/4受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，而CsHXK 2和果糖激酶基因CsFRK6/7則受低溫脅迫顯著抑制。在糖轉(zhuǎn)運(yùn)體方面，冷馴化和低溫脅迫條件下己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因CsSWEET1a/1b/2a/9b/17都有不同程度的上調(diào)表達(dá)，而CsSWEET16受低溫脅迫抑制。功能鑒定表明，CsSWEET16是液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，它在低溫條件下通過調(diào)控液泡膜內(nèi)外的糖分配來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性。CsSWEET1a和CsSWEET17是細(xì)胞膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，二者在細(xì)胞膜上互作介導(dǎo)質(zhì)膜內(nèi)外的糖轉(zhuǎn)運(yùn)來提高植物的抗凍能力[61-62]。

3.2.4 抗氧化途徑相關(guān)基因

低溫導(dǎo)致的氧化損傷是造成茶樹低溫傷害的主要原因之一，抗氧化能力在茶樹抵御低溫脅迫中非常重要。近幾年，茶樹的揮發(fā)性物質(zhì)有效調(diào)控抗寒性的研究取得重要進(jìn)展。糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT91Q2特異性催化橙花叔醇的糖基化，使低溫環(huán)境下茶樹體內(nèi)的橙花叔醇糖苷大量積累，有效地清除低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，提高茶樹抗寒性[63]。類似的，CsUGT78A14和CsUGT71A59分別催化黃酮醇和丁香酚的糖基化，提高ROS清除能力，正調(diào)控茶樹的抗寒性[64-65]。

3.2.5 茶樹低溫響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因

轉(zhuǎn)錄因子是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用調(diào)控目的基因表達(dá)時(shí)間和強(qiáng)度的蛋白質(zhì)分子。植物中已鑒定到超過80個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族基因。茶樹上，除了CBF和ICE外，許多轉(zhuǎn)錄因子也已被報(bào)道參與了茶樹的低溫響應(yīng)過程，如WRKY[66-67]、bHLH[68]、bZIP[69]和Hsf[70]等。一些轉(zhuǎn)錄因子的功能通過模式植物進(jìn)行了異源功能鑒定。茶樹的兩個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控植物的抗寒性，其中CsbZIP6過表達(dá)植株中大多數(shù)低溫響應(yīng)基因和淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)均受低溫抑制[71]，而CsbZIP18在擬南芥中過表達(dá)是通過抑制ABA途徑相關(guān)基因的表達(dá)在冷凍脅迫中起負(fù)調(diào)控作用[72]。

4 展望

進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代以來，對(duì)復(fù)雜性狀的研究已經(jīng)從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，生命科學(xué)研究進(jìn)入生物學(xué)2.0時(shí)代[73]。近十年來，隨著多組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用以及茶樹全基因組測序的完成，茶樹基因的發(fā)掘變得越來越便捷和快速，一大批低溫響應(yīng)基因被克隆，相關(guān)的調(diào)控途徑也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，這些研究結(jié)果豐富了茶樹低溫響應(yīng)基因資源庫，推動(dòng)了對(duì)闡明茶樹抗寒機(jī)制起到了促進(jìn)作用。但是由于茶樹缺乏基因同源鑒定技術(shù)，使得目前的大多數(shù)研究仍停留在基因的克隆及表達(dá)模式分析上，少數(shù)通過異源轉(zhuǎn)化擬南芥等模式植物進(jìn)行單基因的功能鑒定，然而茶樹和模式植物的代謝模式及生長發(fā)育調(diào)控存在較大差異，異源鑒定的結(jié)果不足以支撐茶樹本體基因的功能，也無法實(shí)現(xiàn)對(duì)基因調(diào)控單元或網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確鑒定。另外，以前的研究結(jié)果大多數(shù)集中于茶樹的越冬期抗性機(jī)制研究，對(duì)幼嫩新梢抗寒機(jī)制的研究較少。而產(chǎn)業(yè)需求最大的則是新梢抵抗“倒春寒”防治技術(shù)的研發(fā)。因此，今后茶樹抗寒的研究應(yīng)重點(diǎn)布局以下幾個(gè)方面：

找到茶樹快速感受低溫的“溫度感受器”。生物激發(fā)對(duì)溫度脅迫響應(yīng)的第一關(guān)是快速感受溫度的變化，這個(gè)過程需要通過溫度感受器來實(shí)現(xiàn)。動(dòng)物細(xì)胞主要通過膜上的TRP家族離子通道作為溫度的感知受體[74]，但植物基因組上并未發(fā)現(xiàn)TRP基因。多個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物的“溫度感受器”不是唯一的[75]。目前茶樹的低溫感受器并不清楚。尋找到茶樹快速感受低溫的“溫度感受器”這個(gè)“開關(guān)”，對(duì)于揭示茶樹抗寒響應(yīng)機(jī)制至關(guān)重要。

抗寒基因的功能鑒定及其調(diào)控模塊的發(fā)掘與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析。抗寒能力提升的本質(zhì)是各種抗寒基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同發(fā)揮作用產(chǎn)生的綜合結(jié)果，解析每個(gè)基因及其調(diào)控單元的功能與調(diào)控機(jī)制進(jìn)而建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是解開茶樹抗寒機(jī)制本質(zhì)最主要的內(nèi)容。這需要建立成熟的茶樹基因功能同源鑒定技術(shù)，包括遺傳轉(zhuǎn)化、RNAi、VIGS（virus-induced gene silencing）或者最新的基因編輯技術(shù)等，以及利用多組學(xué)（multi-omics）技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法的應(yīng)用。

抗寒分子標(biāo)記的發(fā)掘及關(guān)鍵抗寒代謝物質(zhì)的鑒定。對(duì)于越冬期抗寒來說，種植抗寒品種仍然是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。隨著極端天氣的頻繁發(fā)生，選育抗寒品種還是茶樹育種的重要目標(biāo)之一。運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析等高通量技術(shù)手段定位控制抗寒的QTL、發(fā)掘等位基因和變異位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化為可信的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)抗寒的早期鑒定，對(duì)推動(dòng)抗寒育種意義重大。

攻克“倒春寒”防控的技術(shù)瓶頸。作為困擾茶學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)的難點(diǎn)之一，解析茶樹新梢快速響應(yīng)“倒春寒”的機(jī)制并開發(fā)防治技術(shù)將是未來茶樹抗寒研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。研究表明，一些次生代謝物能影響植物的抗寒性，而茶樹有著比模式植物更為豐富的次生代謝物質(zhì)。Zhao等[63]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境下，作為茶樹重要的香氣物質(zhì)之一的橙花叔醇糖苷大量積累，可以有效地清除低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧；橙花叔醇也可作為信號(hào)物質(zhì)激發(fā)茶樹體內(nèi)的冷防御機(jī)制，從而提高茶樹的抗寒性。該項(xiàng)研究結(jié)果為我們解決“倒春寒”難題提供了新思路。從茶樹中鑒定出能快速調(diào)控新梢抗寒性的代謝物，進(jìn)而開發(fā)綠色可行的防控技術(shù)和產(chǎn)品將是未來解決茶樹“倒春寒”的途徑之一。