萬磊，劉健，黃傳兵，趙磊，孫廣瀚，朱子衡，李舒，馬熙檬，程靜，胡賽賽，李方澤，陳瑩瑩

1 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

2 美國希望之城國家醫(yī)學中心和貝克曼研究所癌癥生物學系 美國加州 91010

類風濕關(guān)節(jié)炎的主要臨床特征包括關(guān)節(jié)腫脹﹑發(fā)熱﹑疼痛﹑功能障礙和變形，這些都會導致關(guān)節(jié)殘疾和生活質(zhì)量下降[1-2]。盡管我們對類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的認識有了很大的提高，但對類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的認識仍受疾病異質(zhì)性的限制，靶向治療仍不理想。表觀遺傳學的作用，特別是 RNA 修飾在關(guān)節(jié)炎中的作用引起極大的關(guān)注[3]。已經(jīng)證明DNA和組蛋白的表觀遺傳修飾參與了類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制，但探討是否涉及RNA中N6-甲基腺苷（m6A）的修飾研究較少[4]。參與m6A調(diào)節(jié)的酶主要包括m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）﹑去甲基化酶（demethylase）﹑m6A結(jié)合蛋白（m6A-binding proteins）。它們對細胞生命的調(diào)控至關(guān)重要。對M6A甲基化機制的廣泛研究表明[5]，與m6A相關(guān)的RNA水平的調(diào)控是復(fù)雜多樣的。研究表明[6-7]，m6A修飾對于包括免疫應(yīng)答在內(nèi)的多種生物過程是必需的。并且有越來越多的證據(jù)表明，其失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)。進一步研究m6A甲基化在類風濕關(guān)節(jié)炎中的作用機制，將對免疫性疾病的治療產(chǎn)生深遠的影響。

m6A甲基化修飾基因

1 甲基轉(zhuǎn)移酶

m6A甲基化修飾在天然免疫應(yīng)答和抗腫瘤免疫中起著不可或缺的作用。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶促進m6A對RNA的甲基化修飾。最早發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是METTL3﹑METTL14和Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）[8]。這些蛋白并不是各自孤立的，而是會形成復(fù)合物共同行使催化功能。METTL3是一種腫瘤抑制因子，因為它對m6A修飾具有上調(diào)作用。METTL3在一些腫瘤疾病中表達增加，并介導增殖﹑轉(zhuǎn)移和癌細胞的集落形成[9]。METTL3在類風濕關(guān)節(jié)炎中的作用機制尚不清楚。在類風濕關(guān)節(jié)炎患者中METTL3的表達顯著升高，METTL3通過NF-kB途徑影響類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥因子的分泌[10]。因此，METTL3可能具有治療免疫疾病的潛力。研究表明[11]，METTL14的缺失依賴于mTOR信號誘導的自噬。METTL3和METTL14這兩種蛋白有關(guān)鍵的催化結(jié)構(gòu)域，兩者之間會形成雜絡(luò)物。其中METTL3是具有催化活性的亞基，而METTL14會在底物識別上起到關(guān)鍵作用。WTAP是一種在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物。WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。WTAP表達降低時METTL3的RNA結(jié)合能力顯著減弱。這表明WTAP調(diào)節(jié)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物向mRNA靶的募集并影響其結(jié)合能力[12]。WTAP的功能沒有甲基化活性，但它與METTL3和METTL14復(fù)合物相互作用，顯著影響功能細胞m6A的沉積[13]。

2 去甲基化酶

m6A去甲基化酶是從RNA中去除m6A甲基化基團。最常見的去甲基化酶是肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和烷基化修復(fù)同源蛋白5（ALKBH5）。

FTO被認為是一種調(diào)節(jié)肥胖的蛋白。 屬于Alkb蛋白家族中的一員并且與肥胖相關(guān)。FTO的過度激活會增加食物攝入，從而導致肥胖。無論是在DNA還是RNA中，F(xiàn)TO蛋白都是一種十分重要的去甲基化酶。FTO去除m6A修飾并調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，這最終導致各種類型的疾病發(fā)生。FTO對疾病免疫逃逸至關(guān)重要。FTO蛋白在核心結(jié)構(gòu)域上與Alkb蛋白家族相似，但是C端獨有的長loop與Alkb家族其他蛋白有所不同。正是這種特有的結(jié)構(gòu)域使得FTO蛋白能夠?qū)Πl(fā)生甲基化的單鏈DNA或單鏈RNA進行去甲基化修飾。一旦FTO基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生異常，會引起多種風濕免疫性疾病如類風濕關(guān)節(jié)炎等[14]。ALKBH5是另一種重要的去甲基化酶，能夠?qū)毎酥械膍RNA進行去甲基化修飾，在N端有丙氨酸富集區(qū)和獨有的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。在細胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修飾水平顯著上升。ALKBH5缺失通過YTHDF2依賴的方式降低單核-巨噬細胞上炎癥因子的表達[15]。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5通過調(diào)節(jié)細胞遷移﹑侵襲和轉(zhuǎn)移來抑制細胞增殖。如果通過FTO和ALKBH5減少滑膜細胞的增殖和遷移，則可以延遲類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此，m6A去甲基化酶FTO和ALKBN5有可能成為在類風濕關(guān)節(jié)炎治療的靶點。

3 閱讀蛋白

m6A修飾的mRNA行使特定的生物學功能需要一種特定的RNA結(jié)合蛋白，RNA結(jié)合蛋白通過與RNA中的m6A甲基化位點結(jié)合而發(fā)揮特定作用，其編碼基因被稱為閱讀蛋白。閱讀蛋白包括YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白﹑核不均一核糖蛋白以及真核起始因子（eIF）等。具有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等[16]。這些閱讀蛋白的功能主要包括特異性結(jié)合m6A甲基化區(qū)域，削弱與RNA結(jié)合蛋白同源結(jié)合以及改變RNA二級結(jié)構(gòu)從而改變蛋白與RNA的互作。YTHDF1-3主要在胞漿中特異性識別m6A修飾的mRNA[17]。YTHDF1通過與起始因子相互作用增強mRNA翻譯和蛋白質(zhì)合成。YTHDF2通過選擇性結(jié)合并募集m6A-修飾的mRNA至mRNA衰變位點。YTHDF3已被認為是第一個閱讀蛋白。YTHDF3通過與其他因子相互作用增強RNA翻譯[18]。YTHDC1-2的作用部位主要在細胞核內(nèi)。eIF3蛋白能夠與RNA 5’端UTR上發(fā)生m6A修飾的堿基相結(jié)合，從而促進mRNA的翻譯[19]。

m6A甲基化修飾對類風濕關(guān)節(jié)炎的影響

類風濕關(guān)節(jié)炎 特征在于免疫細胞浸潤﹑成纖維細胞樣滑膜細胞過度增殖以及軟骨和骨骼破壞。類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵的病理變化是巨噬細胞樣滑膜細胞產(chǎn)生促炎細胞因子，包括 IL-1﹑IL-6 和 TNF[20]。大量研究表明調(diào)節(jié)免疫細胞是治療 類風濕關(guān)節(jié)炎 的關(guān)鍵靶點之一。m6A甲基化通過控制基因表達在各種生物過程中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化修飾參與對類風濕關(guān)節(jié)炎疾病的過程。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶MetTL3通過調(diào)節(jié)細胞因子變化減輕類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)[21]。

研究發(fā)現(xiàn)[22]，在類風濕關(guān)節(jié)炎患者中，外周血中MetTL3的表達顯著增加，但其他RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶沒有明顯的變化。通過LPS刺激可以上調(diào)巨噬細胞中的MetTL3來增加總m6A含量，并且MetTL3相關(guān)的m6A修飾與細胞因子IL-6和TNF-a相關(guān)。研究表明，在類風濕關(guān)節(jié)炎患者m6A調(diào)節(jié)的甲基轉(zhuǎn)移酶﹑去甲基酶和閱讀蛋白表達發(fā)生變化[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)[24]， m6A甲基轉(zhuǎn)移酶MetTL3通過激活NF-kB信號通路促進類風濕關(guān)節(jié)炎 FLs的炎癥反應(yīng)。

DNA異常甲基化可能參與了類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，異常甲基化的基因可能成為類風濕關(guān)節(jié)炎評估發(fā)病﹑疾病進展和疾病嚴重程度的生物標記物或預(yù)測因子，也有望成為類風濕關(guān)節(jié)炎治療的潛在靶點[25]。 研究發(fā)現(xiàn)[26]，METTL3 表達在人類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織和大鼠 AIA 模型中顯著上調(diào)。METTL3敲低抑制了人 類風濕關(guān)節(jié)炎-FLS 和大鼠 AIA-FLS中的白介素 （IL）-6﹑基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP）-3 和MMP-9 水平。相反，它們因 METTL3 過表達而增加。此外，在 FLS 中，METTL3 可能激活核因子 （NF）-κB信號通路。研究表明，METTL3可能通過NF-κB信號通路促進FLS激活和炎癥反應(yīng)。

通過c-Myc基因啟動子甲基化在類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究發(fā)現(xiàn)[27]，c-Myc基因低甲基化可能與類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病相關(guān)，且c-Myc（chr8:127736502）甲基化率與IL-17水平呈負相關(guān)。

類風濕關(guān)節(jié)炎患者中ALKBH5﹑FTO和YTHDF2表達顯著變化[28]。YTHDF2 降低顯著增加了 LPS 誘導 的 IL-6 ﹑TNF-α﹑IL-1 β 和 IL-12水 平 表 達。研究發(fā)現(xiàn)[29]，與對照組相比，類風濕關(guān)節(jié)炎 患者中ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的 mRNA 表達顯著降低。在接受常規(guī)治療的類風濕關(guān)節(jié)炎患者中，ALKBH5的mRNA表達顯著增加。 FTO 的 mRNA 表達與疾病活動性評分 28 （DAS28）﹑補體 3 （C3）﹑免疫球蛋白G （IgG） 和淋巴細胞與單核細胞比率 （LMR） 相關(guān)。YTHDF2 的 mRNA 表達與 RBC﹑L%﹑N%﹑NLR 和LMR 相關(guān)。邏輯回歸分析顯示，外周血中 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的表達降低是 類風濕關(guān)節(jié)炎 的危險因素。此外，與對照組相比，類風濕關(guān)節(jié)炎 患者外周血整體 m6A 含量顯著增加，并且 m6A 含量增加與 FTO mRNA 表達降低呈負相關(guān)。研究說明了 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 在 類風濕關(guān)節(jié)炎 中的關(guān)鍵作用，這為認識類風濕關(guān)節(jié)炎 的發(fā)病機制提供了新的見解，同時也是一種新型的類風濕關(guān)節(jié)炎 生物標志物。

類風濕關(guān)節(jié)炎DNA甲基化干預(yù)研究

劉喜德等[30]運用real time PCR﹑反義寡核苷酸技術(shù)﹑細胞培養(yǎng)﹑轉(zhuǎn)染等方法進行體內(nèi)及體外實驗，基于miRNA-146a對類風濕關(guān)節(jié)炎患者DNA甲基化調(diào)控作用研究中藥溫化蠲痹方治療活動期類風濕關(guān)節(jié)炎增效的分子機制。了解ras-MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路是否介導了miRNA-146a對DNA甲基化調(diào)控作用，研究溫化蠲痹方對miRNA-146a調(diào)控DNA甲基化作用的影響，闡釋其治療類風濕關(guān)節(jié)炎增效的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)中藥溫化蠲痹方具有下調(diào)類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血PBMC 微小RNA-146a表達，上調(diào)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達，可能通過ras-MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路影響微小RNA-146a調(diào)控類風濕關(guān)節(jié)炎患者DNA甲基化作用而達到治療類風濕關(guān)節(jié)炎目的。

劉煥興等[31]通過觀察甲氨蝶呤片（MTX）治療類風濕關(guān)節(jié)炎對Th17細胞DNA甲基化的影響及其機制。結(jié)果顯示，治療后ESR﹑CRP及PLT水平顯著降低（P＜0.05），Th17細胞比例及IL-17水平顯著降低（P＜0.001），DNMT1基因mRNA表達水平顯著升高（P＜0.001），ROR-γt基因mRNA表達水平顯著降低（P＜0.001），ROR-γt基因甲基化比例顯著增加（P＜0.05）;Th17細胞比例與IL-17水平呈正相關(guān)，ROR-γt基因甲基化程度與IL-17水平呈負相關(guān)（P＜0.05）。說明甲氨蝶呤可通過提高類風濕關(guān)節(jié)炎患者Th17細胞ROR-γt基因甲基化程度抑制體內(nèi)IL-17分泌改善和延緩疾病進程，同時此過程有DNMT1酶參與。

劉亞飛等[32]利用風寒濕刺激類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型，觀察風寒濕因素刺激對關(guān)節(jié)炎的DNA甲基化水平影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，風寒濕病證結(jié)合模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分≥5分的比例顯著升高。大鼠踝關(guān)節(jié)直徑顯著增加。與類風濕關(guān)節(jié)炎模型組相比，風寒濕病證結(jié)合模型組單個核細胞 DNA甲基化水平顯著下降。單個核細胞組蛋白H3乙酰化水平有所升高，但無統(tǒng)計學意義。結(jié)論風寒濕因素可能通過下調(diào)單個核細胞DNA甲基化水平，從而影響類風濕關(guān)節(jié)炎嚴重程度。

John等[33]人通過對 早期類風濕性關(guān)節(jié)炎DNA 甲基化水平的測定，觀察緩解疾病的抗風濕藥（DMARD） 是否與調(diào)節(jié)DNA 甲基化水平有關(guān)。結(jié)果顯示 DNA 甲基化與早期 類風濕關(guān)節(jié)炎 中改善疾病的抗風濕藥物治療反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，m6A甲基化修飾蛋白是否參與類風濕關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生和發(fā)展全過程需進一步研究。m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶可以甲基化非編碼 RNA。然而，關(guān)于非編碼 RNA 與 m6A 在類風濕關(guān)節(jié)炎疾病中相互作用的研究很少。此外，m6A在T細胞穩(wěn)態(tài)或其他免疫細胞分化中的作用研究偏少。同時，關(guān)于藥物對m6A甲基化修飾蛋白的干預(yù)研究尤為不足。因此，需要進一步的研究來確定 m6A 在類風濕關(guān)節(jié)炎中的潛在作用靶點和分子機制。