劉思楊 綜述 文飛球 審校

（中國醫(yī)科大學深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科，廣東深圳 518000）

神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實體瘤，診斷時約50%為高危患者，長期生存率低于40%［1］。NB的診斷、療效的評估和復發(fā)的監(jiān)測通常是通過腫瘤組織活檢，但連續(xù)性的侵入性檢查不易實施，而且腫瘤組織取樣過程中可能導致局部轉(zhuǎn)移。由于NB具有高度異質(zhì)性，原發(fā)性腫瘤及其轉(zhuǎn)移性病變的分子特征并不總是一致的。液體活檢在廣義上是指以血液為主的體液標本中細胞及核酸的檢測，包括循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）及外泌體等。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢可以大幅縮短癌癥確診時間，對癌癥患者的治療情況進行動態(tài)跟蹤，真正實現(xiàn)“個性化精準治療”。本文對液體活檢在NB中應用的最新臨床研究進展綜述如下。

1 CTC

1.1 CTC的概述

CTC是一種腫瘤轉(zhuǎn)移的中間產(chǎn)物，與骨髓（bone marrow，BM）中的播散性腫瘤細胞一起，作為微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）的標志物。MRD指的是緩解期患者在治療后仍有少量腫瘤細胞存在，是NB患者復發(fā)的主要原因［2］。CTC是目前研究最廣泛的液體活檢標記物，已被廣泛用于提供關(guān)于原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤特征的信息，跟蹤腫瘤的動態(tài)變化和異質(zhì)性，并用于檢測治療耐藥性和監(jiān)測復發(fā)［3］。CTC在外周血（peripheral blood，PB）中的數(shù)量極低，約占PB細胞的百萬分之一。因此，對CTC的有效富集與檢測是對CTC研究的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。目前，多種CTC的分離富集方法主要依據(jù)CTC的物理特征（大小、密度、電荷等）與免疫學特性。后者采用免疫親和分離技術(shù)，包括以下兩種方法：一是通過腫瘤特異性標記物來陽性選擇CTCs；二是陰性選擇，這種方法是通過去除正常血液成分（包括紅細胞、白細胞和血小板），最終富集CTC。微過濾技術(shù)的發(fā)展使得通過直徑大小捕獲CTC的靈敏度提高，包括微孔或微流體，還可以專門用于捕獲CTC團［4］。除此之外，還有根據(jù)腫瘤細胞和血細胞的電荷不同來分離出CTC的介質(zhì)電泳。富集后的細胞需要進行CTC的識別，主要包括免疫細胞化學法、熒光原位雜交、流式細胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）及酶聯(lián)免疫斑點實驗等。

1.2 CTC在NB的應用情況

Merugu等［5］應用成像流式細胞技術(shù)，以GD2+/CD45-作為標記物，對41例NB患者的血漿及BM樣本分別進行CTC及播散性腫瘤細胞檢測，其中24例有BM浸潤的患者中19例在血漿中檢測到CTC，沒有BM浸潤的17例患者中6例檢測到CTC，因此CTC的存在或CTC的數(shù)量與BM受累相關(guān)。重要的是，對19例有BM浸潤的新診斷高危NB患者進行一線誘導治療后，未達到BM完全緩解（complete response，CR）的患者與達到BM CR的患者相比在診斷時血漿中具有更高數(shù)量的CTC，因此CTC計數(shù)可能有助于評估療效，以及決定高危NB患者誘導化療的時間長度，從而指導治療。同時該研究首次證明了用成像流式細胞技術(shù)檢測NB患者CTC可以作為早期臨床試驗中新療法的非侵入性藥效學方面的生物標志物。

Batth等［6］對93例緩解期NB患者進行前瞻性研究，選用細胞表面波形蛋白（cell surface vimentin，CSV）作為PB CTC的篩選標記，在基線（即開始治療前）和開始治療后3～4個月的PB樣本中均無CSV+CTC的20例患者中，只有1例復發(fā)，其余19例無復發(fā)，證明了CSV+CTC可以作為判斷早期復發(fā)（2個月至2年）的重要指標，并且PB無基線CSV+CTC聯(lián)合BM無MYCN擴增對無復發(fā)生存期進行預測的敏感性達到100%。

也有一項隨機Ⅲ期試驗中，對CTCs進行免疫清除后，高危NB患兒的存活率并未提高［7］。目前NB患者CTC檢測所用的標記物及檢測技術(shù)尚未統(tǒng)一，正在積極探索更為靈敏及準確的檢測方法。

2 NB相關(guān)mRNA

2.1 檢測方法

早期在液體活檢中對NB進行基因組鑒定主要依賴于RT-PCR，該方法識別可能由CTC脫落的mRNA。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的應用，使NB相關(guān)mRNA得以量化，可確定NB細胞與正常細胞之間的臨界值。早期研究大多通過單一標志物對NB相關(guān)mRNA進行識別，如酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和paired-like homeobox 2B（PHOX2B）。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)同時對多個NB相關(guān)mRNA進行RT-qPCR克服了NB的異質(zhì)性，從而實現(xiàn)更敏感的MRD檢測。除此之外，與RT-qPCR相比，微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是測定特異性核酸豐度更為靈敏的方法，可以提供更準確、更具有可重復性的低水平mRNA檢測。

2.2 臨床應用

在診斷方面，高危和晚期轉(zhuǎn)移的患者通常PB中具有更高的TH mRNA水平［8］。除了可以作為一種診斷性生物標志物，還有大量研究提出了NB特異性mRNA的預后價值。Viprey等［8］應用RT-qPCR對290例4期NB患兒在診斷時或誘導治療后BM和PB樣本中雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）、PHOX2B或TH mRNA進行檢測，證實了診斷時PB高水平DCX、PHOX2B或TH mRNA與4期NB患兒的不良預后相關(guān)。Marachelian等［9］應用RT-qPCR對101例NB患者的BM和PB樣本中ACHGA、DCX、DDC、PHOX2B和TH的mRNA進行定量檢測，證明了此組標志物在BM和PB中的表達與復發(fā)/難治性NB的無進展生存期相關(guān)。最新的一項研究結(jié)果表明，通過ddPCR測定7種NB相關(guān)mRNA（CRMP1、DBH、DDC、GAP43、ISL1、PHOX2B和TH）與高危NB患者腫瘤復發(fā)/再生長顯著相關(guān)，并且證實了在低水平NB相關(guān)mRNA的檢測方面，ddPCR優(yōu)于RT-qPCR［10］。

3 ctDNA和cfDNA

血漿中的cfDNA是高度碎片化的DNA，主要來自凋亡細胞，以游離雙鏈DNA片段或核小體的形式存在。腫瘤細胞（包括CTC、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性病變的腫瘤細胞）凋亡或壞死時釋放到血流中的cfDNA被稱為ctDNA。ctDNA可以替代腫瘤活檢標本的原因在于具有高特異性和敏感性的準確檢測方法，用極少量cfDNA分析單核苷酸變異（singlenucleotide variants，SNVs）和拷貝數(shù)改變成為可能。目前主要有兩種方法來檢測癌癥患者血漿樣本中的ctDNA［11］。第一種方法主要應用靶向DNA測序技術(shù)，如數(shù)字PCR、磁珠乳液擴增技術(shù)、安全測序系統(tǒng)、深度測序腫瘤個體化建檔法和標記擴增子深度測序。其優(yōu)勢在于成本低、耗時短和敏感性高，并且可以評估多重突變，但需要已知突變信息。第二種方法是應用非靶向二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，如全基因組測序或全外顯子測序。

3.1 協(xié)助NB的臨床診斷

PB中cfDNA水平與腫瘤負荷具有相關(guān)性，與健康個體相比，NB患者血漿中cfDNA明顯增加［12］。Wang等［13］應用RT-qPCR的方法對79例初診及79例穩(wěn)定期的NB患者血漿cfDNA水平分別進行檢測，初診患者血漿總cfDNA濃度中位數(shù)是穩(wěn)定期NB患者的18.6倍，4期患者cfDNA是早期患者的6倍，證實了cfDNA的絕對濃度可以作為NB診斷的生物標志物，并且有助于臨床分期。血漿cfDNA總量提供的診斷信息有限，應用NGS技術(shù)，配對的腫瘤/正常DNA測序信息可以通過Sequenza軟件進行分析，Sequenza軟件是一種用于評估cfDNA或原發(fā)腫瘤中腫瘤細胞數(shù)量的軟件包［14］。將ctDNA片段中的腫瘤特異性生物標志物的評估與cfDNA或ctDNA的絕對水平相結(jié)合，可以為臨床診斷提供更多幫助。

3.2 協(xié)助危險分層與指導治療

Van Roy等［12］應用低深度全基因組測序?qū)?7例NB患者PB的ctDNA進行染色體拷貝數(shù)分析，其結(jié)果與來自原發(fā)腫瘤組織活檢的微陣列比較基因組雜交結(jié)果高度一致。并且該研究還證實了在3、4期轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中可以檢測到更高數(shù)量cfDNA，更易獲得cfDNA的拷貝數(shù)譜，這在Chicard等［15］的研究中也得到證實。Cimmino等［16］應用識別靶向基因組合的NGS方法，對11例原發(fā)性NB患者（其中9例為4期，2例為2期）PB中ctDNA的特異性突變進行識別，其中有9例（81.8%）攜帶至少1種致病性突變，同時識別出在診斷時未在組織活檢中發(fā)現(xiàn)的ALK F1174L熱點突變，證實了該方法在識別特異性突變方面的潛力，可以為靶向治療提供依據(jù)，從而促進個性化治療，同時為診斷提供重要依據(jù)。

Iehara等［17］應用ddPCR，以NAGK作為參考基因，MYCN和NAGK比值（M/N）作為評價指標，評估43例初次診斷的NB患者血清及腫瘤ctDNA的MYCN基因擴增狀態(tài)，其靈敏度及特異度均為100%。因此，對于難以獲得腫瘤組織標本的患者，可以通過ctDNA檢測評估MYCN基因擴增狀態(tài)，對其危險分層的預測具有重要臨床價值。最新的研究應用四重ddPCR方法對ctDNA中的拷貝數(shù)變化和熱點突變進行評估，該方法具有更高的靈敏度并且成本更低［18］。除了MYCN，其他染色體改變也被認為具有預測不良預后的價值，包括1p缺失（30%）、11q缺失（45%）和17q不平衡增益（60%）［19］，這些染色體畸變也可應用ctDNA進行識別。

3.3 評估治療反應

ctDNA半衰期短，并且可以檢測到比原發(fā)腫瘤更多的SNVs，因此克服了NB顯著的時間及空間異質(zhì)性，作為疾病監(jiān)測的動態(tài)生物標志物實時評估治療反應，以及進行前瞻性的克隆評估。Chicard等［14］用全外顯子測序及靶向測序技術(shù)對19例NB患者在診斷、治療前或復發(fā)時進行PB的cfDNA檢測，發(fā)現(xiàn)在CR或部分緩解患者中cfDNA/ctDNA比值明顯低于進展期患者，比值分別為33%和67%。說明cfDNA/ctDNA可用于評估治療反應。同時該研究報道，在復發(fā)時發(fā)現(xiàn)cfDNA中的17個SNVs在初診時并未發(fā)現(xiàn)，而利用覆蓋率更高的靶向測序技術(shù)對原發(fā)腫瘤進行檢測后可以發(fā)現(xiàn)這些基因，因此認為這17個突變與不良預后相關(guān)［14］。因此通過對PB的cfDNA進行靶向測序可以早期識別具有復發(fā)特異性的基因，將有助于監(jiān)測疾病進展和發(fā)展靶向治療策略。

Kahana-Edwin等［20］應用ddPCR對3名僅應用ALK抑制劑治療的患者在治療前及治療6～8周后檢測PB的cfDNA，疾病進展的患者ALK突變增加5倍，對治療有反應的患者ALK突變均減少，結(jié)果表明PB cfDNA中ALK突變可以反映患者對治療的反應，為實時監(jiān)測靶向治療的療效提供了生物標志物。

3.4 表觀遺傳學分析

有研究認為，NB的發(fā)生發(fā)展在很大程度上由表觀遺傳修飾驅(qū)動，因此，有研究通過應用深度測序技術(shù)對NB的甲基化狀態(tài)進行分析來評估治療反應。Applebaum等［21］應用Nano-hmC-Seal測序技術(shù)對34名健康兒童和32名NB患者（27名高風險、2名中風險、3名低風險）在其疾病過程中的不同時間點（診斷、治療期間和隨訪）的5-羥甲基胞嘧啶譜進行分析，結(jié)果表明NB患兒的cfDNA中5-羥甲基胞嘧啶增加與轉(zhuǎn)移相關(guān)，可以作為治療反應和預后的預測指標，由21例患者組成的驗證隊列也證實此結(jié)論。van Zogchel等［22］應用ddPCR對47例高危NB患者在治療和隨訪期間血漿樣本的cfDNA中高度甲基化RASSF1A基因進行檢測，復發(fā)患者在診斷時的高度甲基化RASSF1A絕對水平和相對水平均顯著升高，在兩個化療周期后PB高度甲基化RASSF1A與BM mRNA均陽性與不良結(jié)局相關(guān)，結(jié)果表明高度甲基化RASSF1A可以作為檢測NB的ctDNA標記物，并且與BM mRNA聯(lián)合分析可用于監(jiān)測治療反應和早期復發(fā)，該結(jié)論也通過RT-qPCR檢測方法得到證實［23］。

在不同腫瘤的不同階段，ctDNA的侵襲性和代謝程度不同，目前沒有固定的標準來評估ctDNA水平，無法保證可靠性及可重復性，因此NB血漿ctDNA的水平和動態(tài)變化的檢測方法仍需要進一步提高。

4 外泌體

循環(huán)外泌體，即參與細胞通信的小泡，直徑約40～160 nm，起源于細胞多泡體內(nèi)的腔內(nèi)囊泡［24］。在循環(huán)中穩(wěn)定且其內(nèi)容物不被降解，是細胞通信的動態(tài)中介。外泌體的成分包括蛋白質(zhì)、DNA、信使RNA、microRNA（miRNA）、其他非編碼RNA和反映細胞或組織起源的脂質(zhì)等。外泌體在維持細胞正確的生理狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用，并且在病理條件下促進腫瘤的發(fā)病、進展和轉(zhuǎn)移［25］。許多類型細胞都可以釋放外泌體，包括腫瘤細胞。在病理條件下會有更多的外泌體分泌。外泌體及其成分可以反映親代腫瘤細胞的特征，并且參與腫瘤的生長與侵襲，是一種有價值的循環(huán)生物標記物來源［26］。

4.1 外泌體來源的miRNA——預測化療反應

miRNA已被廣泛描述為不同病理狀態(tài)的生物標志物。有研究表明，高危NB患者血清樣本中特異性miRNA水平與疾病負荷和治療反應相關(guān)［27］。一項研究顯示在誘導化療前后收集52例高危NB患者的血液樣本，以CD9作為血漿中總外泌體的標記，以GD2作為NB來源外泌體的標記，結(jié)果顯示PB中GD2+的外泌體占總外泌體的比例由治療前的50%下降到27%，這說明高危NB患者的NB細胞來源外泌體在誘導化療后減少［28］。通過RT-qPCR測量每個PB樣本中381個基因的表達，對比發(fā)現(xiàn)在治療前外泌體來源的miRNA（exosomal mircoRNA，exo-miRNA）的數(shù)量高于治療結(jié)束后，其中62個exo-miRNAs在治療后顯著下調(diào)，表明誘導化療對exo-miRNAs的表達有顯著的抑制作用。同時該研究比較了微小反應（minor response，MR）患者（n=6）和較好部分反應（very good partial response，VGPR）患者（n=8）的exo-miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)3種exo-miRNAs（miR-29c、miR-342-3p和let-7b）在MR患者治療后顯著下調(diào)，而在VGPR患者中幾乎保持不變，說明這3種exo-miRNAs可以有效區(qū)分MR和VGPR患者。除此之外，該研究還提出了化療耐藥指數(shù)（即患者體內(nèi)參與調(diào)節(jié)的exo-miRNAs的數(shù)量除以與特定化療藥物應答相關(guān)的exo-miRNAs的總數(shù)）與無事件生存具有顯著的相關(guān)性，因此exo-miRNAs可以作為預測NB化療反應的循環(huán)生物標志物［28］。

4.2 外泌體的蛋白質(zhì)組學分析——預測PB轉(zhuǎn)移

Colletti等［29］對來自原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的NB細胞系的外泌體進行了蛋白質(zhì)組學比較分析，鑒定出15種蛋白只存在于原發(fā)性腫瘤的外泌體中，這些蛋白均參與神經(jīng)元發(fā)育。相反，僅存在于BM轉(zhuǎn)移細胞系的外泌體中的蛋白參與了細胞存活、增殖和癌癥進展。這提示外泌體可能是檢測NB的PB轉(zhuǎn)移疾病有前景的生物標志物。

4.3 外泌體來源的雙鏈DNA——分析腫瘤體細胞突變

DegliEsposti等［30］通過全外顯子測序證明了從NB患者血漿樣本中提取的外泌體來源的DNA（exosomal DNA，exo-DNA）代表了原發(fā)腫瘤DNA。exo-DNA中檢測到的NB癌基因和抑癌基因突變，在原發(fā)腫瘤中也檢測到；在發(fā)病時腫瘤DNA中不存在的體細胞突變被發(fā)現(xiàn)存在于exo-DNA中，特別是ALK、ATRX、NF1和TERT基因的變異，這表明exo-DNA可用于分析NB的空間異質(zhì)性。exo-DNA也可以用于早期識別獲得性耐藥，如復發(fā)患者中的ALK、TP53和RAS/MAPK基因突變。exo-DNA是NB分子診斷和預后評估的1個有潛力的循環(huán)生物標志物。為制訂個性化化療方案提供依據(jù)，并可用于開發(fā)靶向治療方法。

目前大多數(shù)NB外泌體相關(guān)研究在細胞系中進行，在患者中進行的研究相對較少。除此之外，在分離富集技術(shù)方面，超速離心法仍然是提取exo-DNA的最佳方法，這種方法是非常復雜的，無法實現(xiàn)高通量，目前難以轉(zhuǎn)化為常規(guī)臨床診斷［31］。

5 結(jié)語

液體活檢已成為NB診斷研究的新熱點。CTC反映腫瘤負荷，可以作為CTC診斷及預后評估的重要工具。ctDNA可追溯NB細胞的異質(zhì)性，更全面地評估NB的遺傳信息以進行更精準的危險分層與預后的評估。外泌體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用并與化療耐藥的發(fā)生有關(guān)，可以更直觀地評估NB患者對化療的反應，exo-miRNA的檢測結(jié)果也為優(yōu)化靶向治療方案提供參考。因此，這些新型液體活檢生物標志物在NB診斷、治療及預后評估等方面均有臨床應用潛力。但目前各種液體活檢技術(shù)尚不完善，在臨床應用液體活檢前必須建立標準操作規(guī)程并進行大規(guī)模前瞻性臨床試驗進行驗證［32］。