王梅，龔正鵬，于明，梁東

(1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 貴陽 550014)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其中96%～98%為喉鱗狀細胞癌。在全球范圍內，喉癌的發(fā)病率和死亡率分別為2.76/10和1.66/10，嚴重威脅了人類的健康。雖然近年來對喉癌的研究取得了一定的成果，但其發(fā)病機制和病因仍不清楚。目前喉癌的治療主要以手術治療為主，放療、化療、生物治療及免疫治療為輔。盡管采取了多種策略和干預措施，晚期喉癌患者的5年總生存率仍不理想。因此，更好地了解與其進展相關的分子機制對于開發(fā)有效的抗喉癌治療方案至關重要。近年來隨著高通量測序技術的出現，越來越多的研究發(fā)現circRNA在腫瘤中異常表達，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本文復習國內外相關文獻，就circRNA在喉癌中的可能作用機制綜述如下。

1 circRNA的形成

1976年，Sanger等在RNA病毒中首次發(fā)現circRNA。circRNA最初被認為是細胞異常剪接的非功能性副產品。隨后有研究者發(fā)現小鼠睪丸中性別決定區(qū)域

Y

基因的circRNA具有可能的功能。接著有研究者在不同物種的真核生物的細胞質中也證實了circRNA的存在。直到2012年，由于高通量測序的進展，大量的circRNA被不斷的發(fā)現和鑒定。

RNA選擇性剪接是真核細胞中一種基本的基因表達事件。前體mRNA由剪接體去除內含子，然后與編碼蛋白質的外顯子連接，形成成熟的mRNA。與典型的mRNA剪接不同，circRNA是通過反向剪接過程產生的，該過程將下游的5’剪接供體位點與上游的3’剪接受體位點連接起來，形成單鏈共價閉合環(huán)。然后，剪接體移除全部或部分內含子，其余序列連接。按其結構域的不同，circRNA可分為4類：外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA和基因間circRNA。外顯子circRNA是最常見的circRNA類型，占已知circRNA的80%以上。目前有3種假說模型來解釋外顯子circRNA的形成：①套索驅動的環(huán)化：供體位點的下游5’剪接位點與受體位點的上游3’剪接位點連接，形成套索結構，繼而內含子的內部剪接以形成外顯子-內含子circRNA；②內含子配對驅動的環(huán)化：供體位點的外顯子和受體位點兩側的內含子序列具有相當大的互補性，這使得剪接位點接近形成外顯子-內含子circRNA；③RNA結合蛋白介導的環(huán)化：RNA結合蛋白通過與側翼的內含子結合，拉近供體位點和受體位點的距離，從而促進外顯子的環(huán)化。

2 circRNA的主要生物學功能

結合國內外相關文獻，circRNA的主要生物學功能可以概括為以下幾點：①微小RNA海綿：circRNA含有miRNA的結合位點，能夠以堿基對的方式直接與靶mRNA結合，并觸發(fā)mRNA的切割或抑制mRNA的翻譯，間接調節(jié)miRNA下游靶基因的表達。小腦變性相關蛋白1反義RNA(CDR1as)是已經發(fā)現能結合miR-7并抑制其生物活性和功能，發(fā)揮其分子海綿作用的circRNA。此外，最近的研究表明，單個circRNA可以作為各種miRNAs的海綿，在一定條件下既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為癌基因發(fā)揮作用。例如，circHIPK3可以作為miR-558的海綿來抑制膀胱癌中乙酰肝素酶的表達，也可以通過與miR-124-3p相互作用，上調信號傳導及轉錄激活蛋白3(STAT3)的表達而促進肺癌的發(fā)生；②調控親本基因的表達：有研究表明，有些外顯子-內含子circRNA與RNA聚合酶II相互作用，并在轉錄位點聚集，從而促進其親本基因的轉錄。此外，某些circRNA可以與它們的線性對應物競爭，對抗規(guī)范的前體mRNA的剪接，從而抑制它們的親本基因的表達；③蛋白質/肽的翻譯：研究發(fā)現，許多circRNA具有內部核糖體進入位點或開放閱讀框架，參與功能蛋白的轉錄和翻譯。例如，circMb1、circ-SHPRH、circPINT和circ-ZNF609，在內部核糖體進入位點元件的驅動下或被m6A RNA修飾時，都可以作為蛋白質模板。研究報道circ-SHPRH編碼蛋白SHPRH-146aa，它作為誘餌保護SHPRH蛋白不被維甲酸調節(jié)的核基質相關蛋白(DTL)介導的降解泛素化，從而抑制膠質瘤的發(fā)生。此外，由circPINT編碼的多肽PINT87aa，直接與RNA聚合酶II相關因子1復合物相互作用，從而抑制轉錄延長并阻止癌基因

MYC

、

SOX2

、

CPEB1

的表達水平；④蛋白質誘餌：越來越多的證據表明，circRNA充當蛋白質海綿或誘餌來調節(jié)基因表達。含有與一種或多種蛋白質的多個互補結合位點的circRNA可能作為蛋白質海綿發(fā)揮作用。circRNA和RNA結合蛋白之間的相互作用已被證明影響癌癥進展。此外，circRNA還可以作為蛋白質的支架，促進化學反應或阻斷蛋白質的功能。例如在小鼠成纖維細胞中，circ-Foxo3可以與周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑p21(p21)和細胞周期蛋白依賴性激酶2(Cdk2)相互作用，形成三元復合物，從而抑制細胞周期進程。同時，circ-Foxo3還可以作為小鼠雙微體2(MDM2)和p53的蛋白支架，誘導p53降解；⑤ 疾病生物標志物：circRNA穩(wěn)定性高，容易進入體液(全血、血清、血漿、腦脊液、尿液等)，并且其表達模式具有組織、時空和疾病特異性，使得circRNA成為有潛力的疾病生物標志物。

3 circRN的促癌機制

3.1 促進喉癌的增值、轉移、侵襲

3.1.1 CDR1as CDR1as是最常作為miR-7海綿研究的circRNA，因此也稱為ciRS-7。CDR1as含有70多個miR-7結合位點，可與Argonaute(AGO)蛋白廣泛結合。miR-7是一種腫瘤抑制因子，CDR1as通過靶向表皮生長因子受體(EGFR)/RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(RAF1)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號或人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因

PTEN

/胞內磷脂酰肌醇激酶PI3K(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路，在腫瘤發(fā)生過程中降低了miR-7的有效性。Zhang等用qRT-PCR檢測了60例喉鱗狀細胞癌組織和對應癌旁正常組織中CDR1as的表達水平，結果表明CDR1as在喉鱗狀細胞癌組織中顯著高表達。同時，CDR1as的高表達與TNM分期、腫瘤分化及淋巴結轉移密切相關?；颊呱鏁r間與CDR1as表達的相關性分析表明CDR1as的表達與喉癌患者的生存率成負相關。此外，miR-7在喉鱗狀細胞癌腫瘤組織中表達下調，且CDR1as表達水平與miR-7表達水平呈負相關。在細胞水平上，敲除CDR1as導致了喉鱗狀細胞癌細胞系的細胞周期中G1/S期阻滯和凋亡，從而抑制了腫瘤細胞的生長。進一步研究結果顯示CDR1as增加了喉鱗狀細胞癌細胞中CCNE1和磷酸肌醇-3-激酶催化亞基Δ肽(PIK3CD)的mRNA和蛋白水平，有利于腫瘤的增殖和轉移，但腫瘤抑制因子miR-7的表達抑制了CCNE1和PIK3CD在喉鱗狀細胞癌細胞中的表達。此外，體內研究的結果表明，CDR1as的單獨高表達可以通過促進腫瘤生長和上調腫瘤細胞中與侵襲相關的miR-7靶點CCNE1和PIK3CD，這種作用有助于抵消miR-7的抑癌功能，從而加速了喉鱗狀細胞癌腫瘤的生長。簡言之，CDR1as是一種促癌基因，通過調節(jié)miR-7信號通路促進喉癌的發(fā)展。3.1.2 hsa_circ_0023028 hsa_circ_0023028是新發(fā)現的一種circRNA，位于基因

C11orf80

的

chr11

:66515849-66590145，在喉鱗狀細胞癌組織中明顯高表達。此外，喉鱗狀細胞癌組織中hsa_circ_0023028的高表達與喉鱗狀細胞癌患者的腫瘤分級、淋巴結轉移、原發(fā)部位、臨床分期等臨床特征密切相關。miR-194-5p是一種脊椎動物特異性miRNA，在胃癌、喉鱗狀細胞癌等人類腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miR-194-5p在喉鱗狀細胞癌組織中表達過低，且miR-194-5p的低表達與喉鱗狀細胞癌的T分期、臨床分期、復發(fā)和不良預后相關。有研究報道m(xù)iR-194-5p的高表達可以通過靶向Wee1抑制喉鱗狀細胞癌的惡性表型。Chen等對20例喉鱗狀細胞癌實體瘤標本和配對的癌旁非癌組織標本及人喉鱗狀細胞癌細胞系(Hep-2和TU212)和正常鼻咽上皮細胞系(NP69)進行qRT-PCR檢測，結果發(fā)現與癌旁非癌組織相比喉鱗狀細胞癌組織中hsa_circ_0023028表達上調，而miR-194-5p在Hep-2和TU212細胞中的表達水平低于NP69細胞。CCK-8和EdU檢測結果表明hsa_circ_0023028的下調導致了細胞增殖的顯著減少；跨孔遷移和侵襲實驗結果顯示hsa_circ_0023028的下調抑制了Hep-2和TU212細胞的遷移能力及侵襲能力。進一步研究結果顯示miR-194-5p的下調促進了hsa_circ_0023028對喉鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。簡言之，hsa_circ_0023028作為miR-194-5p海綿促進喉鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

3.2 抑制喉癌細胞的凋亡

3.2.1 hsa_circ_0000285 Qin等用RT-qPCR檢測了50例喉癌組織和喉癌細胞株中hsa_circ_0000285的表達，結果發(fā)現喉癌組織中hsa_circ_0000285的表達較癌旁組織高，且喉癌細胞株的hsa_circ_0000285表達也有不同水平的升高。進一步的機制研究發(fā)現，敲除hsa_circ_0000285可抑制喉癌中Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，而

hsa_circ_0000285

基因的過度表達則有相反的作用。hsa_circ_0000285是在鼻咽癌中新發(fā)現的一種表達失調的circRNA，并將其作為放射敏感性的預后生物標志物。Wnt/β-catenin信號通路是腫瘤增殖和轉移、調節(jié)干細胞完整性、干細胞分裂和遷移的重要途徑之一，其在轉移起始細胞中的表達可能是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調控因子。例如，通過下調Wnt/β-catenin信號和miR-516b誘導的FZD4表達，circRNA_100290促進結直腸癌的進展?？偠灾?，

hsa_circ_0000285

作為一種致癌基因，通過誘導Wnt/β-catenin信號通路，通過抑制喉癌細胞凋亡從而促進了喉癌的增殖。3.2.2 circRNA_100290 Wang等發(fā)現在喉鱗狀細胞癌組織和喉鱗狀細胞癌細胞系中circRNA_100290顯著上調，且其在喉鱗狀細胞癌患者中的高表達水平與TNM晚期和淋巴結轉移呈正相關。在細胞培養(yǎng)中，circRNA_100290的上調通過抑制細胞凋亡促進了喉鱗狀細胞癌細胞的增殖和集落形成，增強了喉鱗狀細胞癌細胞的侵襲或遷移。在體內實驗中，circRNA_100290的過表達可以促進喉鱗狀細胞癌腫瘤在小鼠體內的生長。小gtp結合蛋白Rap超家族的第5個成員RAP2C是RAS家族成員之一，是多種癌癥的致癌基因。例如，RAP2C通過降低基質金屬蛋白酶2(MMP2)組織抑制劑的蛋白水平和增加p-Akt的水平，促進人骨肉瘤細胞的侵襲和遷移。進一步的機制研究發(fā)現，circRNA_100290作為miR-136-5p的海綿，通過調控靶基因

RAP2C

促進喉鱗狀細胞癌的進展。

4 circRNA抑制喉癌的機制

Tian等利用circRNA微陣列對3例喉鱗狀細胞癌組織中的circRNA進行測序，發(fā)現hsa_circ_0042666是下調的差異基因中表達差異最大的circRNA之一。Wei等通過qRT-PCR檢測35例喉鱗狀細胞癌組織中hsa_circ_0042666的表達，結果顯示，喉鱗狀細胞癌組織中hsa_circ_0042666表達明顯降低，且hsa_circ_0042666的低表達與晚期喉鱗狀細胞癌患者的腫瘤分期、淋巴結轉移及預后不良有關。體外功能檢測結果顯示，hsa_circ_0042666可降低喉鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲能力。進一步研究表明，hsa_circ_0042666在喉鱗狀細胞癌中充當miR-223的海綿。有研究報道轉化生長因子(TGF)-β-III型受體(TGFBR3)在癌癥進展中起關鍵作用。例如, Li等發(fā)現miR-19a/miR-424通過調控TGFBR3表達促進舌癌的發(fā)生發(fā)展。在這組學者的研究中，TGFBR3作為為喉鱗狀細胞癌中miR-223的靶點，且敲除TGFBR3后增強了喉鱗狀細胞癌細胞的侵襲能力。簡言之，下調的hsa_circ_0042666通過調控miR-223/TGFBR3軸，在喉鱗狀細胞癌中發(fā)揮抑癌作用。

目前circRNA在喉癌中的可能作用機制研究并不是太多，近幾年喉癌中異常表達的circRNA主要研究情況見表1。

表1 喉癌中異常表達的circRNAs

circRNA表達情況作用機制與喉癌的關系hsa_circ:chr20:31876585-31,897,648下調可能主要調控PPAR軸突導向、Wnt和細胞周期信號通路[44]腫瘤抑制劑hsa_circ_0042666下調作為miR-223的海綿,競爭性與miR-223結合,調控TGFBR3基因[42]抑制喉癌的增殖和侵襲hsa_circ_0044520和hsa_circ_00445229上調競爭性抑制hsa-miR-4726-5p和hsa-miR-4640-5p的活性,調控COL1A1基因參與膠原的合成[45]促進喉癌的發(fā)生發(fā)展CDR1as(ciRS-7)上調作為miR-7的海綿,競爭性抑制miR-7的活性,增加CCNE1和PIK3CD的表達[31]促進喉癌的增殖和轉移has_circ_0023028上調作為腫瘤抑制劑miR-194-5p的海綿,競爭性抑制了miR-194-5p的活性,調控Weel基因[35]促進喉癌的增殖、遷移和侵襲circRNA_100290上調作為miR-136-5p的海綿,競爭性抑制miR-136-5p的活性,促進癌基因RAP2C的表達[39]促進喉癌的增殖、遷移和侵襲,抑制細胞凋亡circMYLK上調作為腫瘤抑制因子miR-195的海綿,競爭性抑制miR-195的活性,增加cyclinD1的表達[46]促進喉鱗狀細胞癌的增殖和細胞周期的進展circFLNA上調充當miR-486-3p的海綿,競爭性與miR-486-3p結合,增加移行標志MMP2和FLNA蛋白的表達[47]促進喉鱗狀細胞癌細胞的遷移circRASSF2上調充當miR-302b-3p的海綿,競爭性抑制miR-302b-3p的活性,促進癌基因IGF-1R的表達[41]促進喉癌的增殖、轉移和侵襲,抑制細胞的凋亡circ-CCND1上調與HuR和miR-646相互作用,從轉錄后水平調控CCND1基因,進而增強CCND1的穩(wěn)定性[48]促進喉癌的增殖has_circ_0057481上調充當miR-200c的海綿,競爭性抑制miR-200c的活性,調控ZEB1的表達[49]促進喉癌的增殖和轉移hsa_circ_0000285上調激活Wnt/β-catenin信號通路[36]促進喉癌的增殖和抑制細胞凋亡hsa_circRNA_100855上調未知促進喉癌的增殖和轉移[32]hsa_circRNA_104912下調未知抑制喉癌的增殖和轉移[32]circCORO1C上調競爭性結合let-7c-5p,阻止其降低PBX3水平,促進上皮-間充質轉化[50]促進喉癌的增殖、轉移circPARD3上調海綿細胞化miR-145-59激活PRKCI-Akt-mTOR通路[51]促進喉癌的增殖、轉移及化療耐藥

注：PPAR：過氧化物酶體增殖物激活受體；TGFBR3：轉化生長因子β-III型受體；COL1A1：膠原蛋白I型Alpha1鏈；PIK3CD：磷酸肌醇-3-激酶催化亞基Δ肽；cyclin D1：G1/S-特異性周期蛋白-D1；MMP2：蛋白基質金屬蛋白酶2；FLNA：細絲蛋白A；IGF-1R：胰島素樣生長因子1受體；CCND1：周期蛋白D1；PBX3：同源盒基因3；PRKCI：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白激酶c；Akt：蛋白激酶B；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

5 總結與展望

綜上所述，circRNA在喉癌的相關研究較少，但就目前的研究顯示其在喉癌中的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用，參與了喉癌的侵襲、增值、凋亡、轉移，可作為喉癌的早期診斷及預后的標志物。相信隨著生物信息學的發(fā)展及人們對基因組學研究的進一步深入，circRNA 在基因水平上與喉癌的相關性終將明晰，屆時circRNA將成為喉癌治療的新靶點，為喉癌患者的早期診斷和評估預后提供生物學標志物。