李正寬，孫 湛，包雅麗，麥麗克扎提·阿不都熱西提

1981年，de Bold 等首次發(fā)現(xiàn)心鈉素(atrial natriuretic peptide,ANP)。此后，隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)ANP在體內(nèi)表達(dá)增高時，可發(fā)揮拮抗病理性心肌肥厚和心室重構(gòu)的作用，從而起到保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用。研究表明，病理性心肌肥厚是心血管疾病的獨(dú)立危險因素。在長久、持續(xù)的病理性刺激下，心肌肥厚常常伴有心肌纖維化、收縮功能失調(diào)和能量代謝異常等，最終導(dǎo)致失代償性的心力衰竭。而生理性心肌肥厚通常出現(xiàn)在長期的運(yùn)動刺激中，是一種可逆的、健康的心肌肥厚。適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動訓(xùn)練可使心肌細(xì)胞增大、增殖，抵抗凋亡作用，從而保護(hù)心臟功能。本研究通過建立生理性和病理性心肌肥厚的大鼠模型，分析ANP在兩種心肌肥厚組織中表達(dá)的差異，為病理性心肌肥厚的診斷、預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

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實(shí)驗(yàn)動物與分組 無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)級8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠15只，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，平均體重180.00 g。將其隨機(jī)分為對照組(CON組)、異丙腎上腺素組(ISO組)和運(yùn)動組(EXE組)，每組5只。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：IACUC-20210702-06)。

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主要試劑與儀器 兔抗大鼠ANP抗體(中國ABclonal公司)，山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記(中杉金橋公司)，石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Fisher Scientificals公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司)，一步法10% SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(中國Biotides公司)，冷凍組織樣品研磨機(jī)(上海凈信公司)，增強(qiáng)型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒(中國Proteintech公司)。

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模型建立 (1)病理性心肌肥厚：頸部多點(diǎn)皮下注射異丙腎上腺素，第1～3次注射1.25 mg/(kg·d)，間隔48 h；第4～21次注射2.5 mg/(kg·d)，間隔24 h。(2)生理性心肌肥厚：采用有氧運(yùn)動(游泳)誘導(dǎo)。第1周，每天無負(fù)重游泳1次，每次間隔24 h，連續(xù)6 d，第1天游泳20 min，此后每天遞增20 min至每天游泳訓(xùn)練60 min。第2～6周，每次無負(fù)重游泳60 min，2次/d，每次間隔6 h，每周連續(xù)6 d。第7～8周，2次/d，第1次無負(fù)重游泳60 min，第2次負(fù)重游泳60 min，每次間隔6 h，每周連續(xù)6 d。(3)對照組不予特殊干預(yù)。在第8周末采用過量麻醉法處死大鼠，肌肉注射舒泰+鹽酸賽拉嗪(1∶1)0.2～0.4 ml/kg，取出心臟，分裝入4%多聚甲醛和液氮中保存。

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HE染色 在4%多聚甲醛溶液中取出心肌組織，進(jìn)行心肌脫水、透明、浸蠟和包埋后，橫切成4～5 μm的切片，常規(guī)HE染色。在顯微鏡下觀察、拍照。

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免疫組化染色 制備石蠟切片，將切片置入60 ℃烤箱中烤片60 min，脫蠟、水化后浸入EDTA抗原修復(fù)液，微波加熱修復(fù)抗原，冷卻后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗5 min×3次，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉30 min。傾倒去封閉液，滴加ANP一抗，濕盒孵育過夜。次日復(fù)溫后用PBS沖洗5 min×3次，擦干滴加辣根酶標(biāo)記的二抗，濕盒室溫孵育30 min。PBS沖洗5 min×3次，滴加DAB顯色液。鏡下觀察孵育，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染40 s，自來水沖洗，鹽酸酒精分化3 s，蒸餾水沖洗，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。使用Image J軟件進(jìn)行積分光密度計算。

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Western-blot法檢測心肌組織中ANP的表達(dá) 將心肌組織中加入裂解液，進(jìn)行低溫研磨，冰上裂解30 min，4 ℃離心后吸取上清液，蛋白定量，100 ℃水浴變性10 min。樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃慢搖床孵育ANP一抗過夜。次日以TBST洗膜10 min×3次，避光慢搖床孵育二抗90 min，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯影系統(tǒng)成像。

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統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0和GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行三組間的計量資料比較，以LSD-

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檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。

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<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

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HE染色結(jié)果 與CON組相比，EXE組和ISO組的心肌纖維明顯增粗，且ISO組還出現(xiàn)了心肌纖維間隙增寬、排列紊亂等結(jié)構(gòu)受損的特征，而EXE組的心肌纖維則排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。見圖1。

圖1 三組心肌組織鏡下觀察所見(HE染色，×400)

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免疫組化染色結(jié)果 ANP主要表達(dá)于心肌細(xì)胞的胞漿中，表達(dá)為棕褐色。ISO組的ANP積分光密度高于CON組和EXE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。EXE組的ANP積分光密度略高于CON組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見圖2。

=19.070，=0.000；*表示<0.05，ns表示>0.05

圖2 三組免疫組化染色結(jié)果(×400)及ANP積分光密度比較圖

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Western-blot檢測結(jié)果 ISO組ANP蛋白表達(dá)水平高于EXE組和CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。EXE組ANP蛋白表達(dá)水平高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖3。

=386.400，=0.000；*表示<0.05

圖3 三組Western-blot檢測結(jié)果及ANP蛋白表達(dá)水平比較圖

3 討論

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心肌肥厚是心臟對于長期血流負(fù)荷增加時的適應(yīng)性改變。其中，病理性心肌肥厚是冠狀動脈疾病和心力衰竭發(fā)展的重要預(yù)測指標(biāo)，在長期的慢性病理性刺激下，心臟從適應(yīng)性肥大轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡孓D(zhuǎn)的病理性心肌肥大，進(jìn)而導(dǎo)致心功能下降、心室重塑甚至心力衰竭。本研究發(fā)現(xiàn)，對于運(yùn)動誘導(dǎo)的生理性的心肌肥厚，其心臟結(jié)構(gòu)異于病理性心肌肥厚，功能未發(fā)生病理性改變。有研究表明，運(yùn)動可使心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險降低50%，并顯著降低心力衰竭患者的病死率和反復(fù)住院率，且運(yùn)動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚具有可復(fù)性。因此，盡快檢測并區(qū)分生理性心肌肥大和病理性心肌肥大，對于預(yù)防病理性心肌肥厚的發(fā)生具有重要的臨床意義。

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ANP通常由心房肌細(xì)胞合成和分泌，在胚胎心臟中ANP含量較高，出生后下降，在成年人正常心臟中幾乎不表達(dá)。然而，當(dāng)病理性心肌肥厚、心力衰竭或心肌梗死發(fā)生時，心室可大量生成和分泌ANP。研究表明，對于運(yùn)動年限較長的人群，其安靜狀態(tài)下的血漿ANP水平更低。在本研究中，筆者分別通過皮下注射異丙腎上腺素增加心臟負(fù)荷和游泳運(yùn)動來構(gòu)造了大鼠的病理性和生理性心肌肥厚模型。HE染色結(jié)果顯示，相較于CON組，ISO組心肌纖維明顯增粗，且出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂；EXE組也同樣出現(xiàn)了心肌纖維增粗的情況，但結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)破壞且排列整齊。結(jié)果提示SD大鼠的生理性和病理性心肌肥厚模型構(gòu)建成功。Western-blot檢測和免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANP主要表達(dá)于心肌細(xì)胞的胞漿中，在病理性心肌肥厚中，ANP的表達(dá)量顯著提升；而在生理性心肌肥厚組織中，ANP表達(dá)水平略高于CON組，但明顯低于病理性心肌肥厚組織。筆者認(rèn)為長期的有氧運(yùn)動也使ANP在生理性心肌肥厚組織中有著較高表達(dá)。也有研究表明，對于施行適量有氧運(yùn)動的干預(yù)組，其ANP的表達(dá)量高于對照組，而力竭運(yùn)動卻會導(dǎo)致ANP表達(dá)量低于對照組。

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在臨床診療中通常認(rèn)為ANP和腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的水平增高程度與心衰嚴(yán)重程度呈正比，可作為評價心力衰竭及判斷其預(yù)后的指標(biāo)。然而本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)予以長期的有氧運(yùn)動時，ANP也會表達(dá)于生理性心肌肥厚組織。筆者還發(fā)現(xiàn)，生理性心肌肥厚組織ANP的表達(dá)量低于病理性心肌肥厚組織。目前，臨床醫(yī)師對于心臟運(yùn)動的認(rèn)識雖有提升，但仍然主要局限于使用心電圖進(jìn)行鑒別，而由于機(jī)體的差異性以及生理性心肌肥厚的可復(fù)性，故仍存在大量的漏診和誤診情況。因此，在未來的臨床診療中，可以考慮通過結(jié)合ANP來更詳細(xì)地區(qū)分不同類型的心肌肥厚，提高診斷的正確率。

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有研究表明，ANP對于血流動力學(xué)和心臟結(jié)構(gòu)都有著重要的作用，ANP的適當(dāng)升高可以使心排血量降低，從而改善左心舒張功能。也有學(xué)者研究表明，ANP在誘導(dǎo)脂肪分解、脂質(zhì)的氧化和動員及改善胰島功能敏感性上也有著明顯的作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動可以通過提升ANP水平從而改善心功能，降低罹患心血管疾病的風(fēng)險。一些研究者已經(jīng)通過體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定劑量水平的ANP具有治療心血管疾病和代謝疾病的作用。馬赟聰和王玉哲的研究表明，使用中藥材橙皮素可以使經(jīng)胸主動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚小鼠模型的ANP表達(dá)水平降低，從而緩解病理性心肌肥厚，改善心室重塑和心功能。因此，適量ANP輔助治療在預(yù)防和治療心血管疾病中可能具有一定的應(yīng)用前景。然而，ANP水平升高和降低的分子機(jī)制，及其改善已經(jīng)發(fā)生心功能降低患者的心功能狀態(tài)以及預(yù)防病理性心肌肥厚的機(jī)制尚不明確，尚需要更為深入的研究。

綜上所述，ANP在生理性心肌肥厚組織中略有提升，在病理性心肌肥厚組織中升高顯著，可作為診斷病理性心肌肥厚的輔助診斷指標(biāo)。