王 楠，袁寶琪，劉文博，姚興東，于翠梅，謝甫綈

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，沈陽 110161）

大豆[

Glycine max

(L.)Merr.]是我國主要農(nóng)作物之一，為國民提供豐富的蛋白質(zhì)和油脂。但我國大豆種植面積有限，總產(chǎn)量偏低，供給嚴(yán)重不足，85%的大豆需要進(jìn)口，因此提高我國大豆產(chǎn)量的研究勢在必行。1924~2010年，美國大豆產(chǎn)量以每年21kg·hm的線性速度穩(wěn)步增長，大約2/3的增長是遺傳改良的結(jié)果。因此，通過遺傳改良增加大豆生產(chǎn)潛力是改變我國大豆供需矛盾，提高我國大豆產(chǎn)量的有效手段。傳統(tǒng)育種通常通過從高產(chǎn)親本雜交的子代中選擇優(yōu)良品系來提高大豆產(chǎn)量，但這可能導(dǎo)致增產(chǎn)基因的缺失、遺傳基礎(chǔ)和遺傳多樣性的下降，從而影響大豆產(chǎn)量的遺傳改良。伴隨近年來分子標(biāo)記技術(shù)的高速發(fā)展，利用基因定位及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確高效選擇性狀，極大地提高了育種效率。

大豆產(chǎn)量性狀是由多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，包括百粒重、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)等性狀。在SoyBase數(shù)據(jù)庫中，有近150個(gè)大豆產(chǎn)量相關(guān)的QTL從20多個(gè)分離群體被檢測到，分布在18個(gè)連鎖群，大部分集中于C2、M、K、G等連鎖群。其中，部分QTL位點(diǎn)在不同群體中被檢測，且處于相同或相鄰位置，說明這些QTL是穩(wěn)定的QTL，可以被進(jìn)一步利用進(jìn)行分子輔助標(biāo)記育種。但很多產(chǎn)量QTL位點(diǎn)受環(huán)境的影響比較大，只能在部分條件下表達(dá)。因此，大豆產(chǎn)量QTL定位的相關(guān)研究還需要更多的群體進(jìn)行深度的研究和證實(shí)。

大豆連作是我國農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)的一種普遍現(xiàn)象，但連作會(huì)導(dǎo)致大豆植株對(duì)資源利用的下降和產(chǎn)量的降低。不同基因型的大豆品種對(duì)連作的耐受性不同。因此，在連作條件下進(jìn)行大豆產(chǎn)量及產(chǎn)量相關(guān)性狀研究和產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL研究，對(duì)我國大豆產(chǎn)量的遺傳改良有重要意義。本研究以耐連作遼豆14和不耐連作鐵豆46為親本，采用單粒傳構(gòu)建F代重組自交系。在輪作和連作條件下進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL定位，研究結(jié)果將為大豆產(chǎn)量相關(guān)性狀的定位、大豆耐連作基因的檢測與發(fā)掘及分子標(biāo)記輔助育種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以耐連作遼豆14為母本,不耐連作鐵豆46為父本，采用單粒傳構(gòu)建F代重組自交系，至2017年得到F世代，2018年得到F世代（共138個(gè)株系）。耐連作遼豆14和不耐連作鐵豆46的產(chǎn)量相關(guān)性狀存在明顯的差異（表1）。本試驗(yàn)于2017~2018年在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行，設(shè)置輪作和連作兩種方式。土壤類型為棕壤土，連作土壤指標(biāo)為：有機(jī)質(zhì)含量11.16g·kg，全氮含量1252.43g·kg，有效磷含量36.3g·kg，速效鉀含量150.62g·kg；輪作土壤指標(biāo)為：有機(jī)質(zhì)含量11.6g·kg，全氮含量1300.27g·kg，有效磷含量39.56g·kg，速效鉀含量160.32g·kg。

表1 大豆重組自交系群體親本的性狀
Table 1 Traits of parents of soybean recombinant inbred lines

?

1.2 方法

試驗(yàn)設(shè)置輪作和連作兩種方式，將試驗(yàn)材料分別種植于相應(yīng)的連作試驗(yàn)田和輪作試驗(yàn)田，每小區(qū)4行，行長2m，行距60cm，種植密度為1.5×10株·hm，每處理設(shè)3次重復(fù)，進(jìn)行常規(guī)播種與常規(guī)田間管理。在大豆苗期將植株的新鮮葉片取樣作為試驗(yàn)材料，采用CTAB提取方法提DNA。根據(jù)大豆數(shù)據(jù)庫SoyBase（http：//www.soybase.org/）及大豆公共圖譜進(jìn)行SSR引物的選擇，挑選出在大豆20條染色體上分布較為均勻的SSR引物序列420對(duì)，由華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，按照引物特異性進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測，并對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于共顯性的SSR標(biāo)記，根據(jù)其特點(diǎn)及擴(kuò)增的電泳結(jié)果，將與母本SSR標(biāo)記帶型相同的記錄為“A”，與父本SSR標(biāo)記帶型相同的記錄為“B”，雜合的帶型記為“H”，缺失或模糊不清的帶型記為“-”，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

2017年10月和2018年10月收獲，選取小區(qū)中心2行密度一致、長勢均勻的連續(xù)5株大豆植株進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定（結(jié)莢高度、主莖節(jié)數(shù)、株高、主莖莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、百粒重和單株粒重）。通過對(duì)遼豆14和鐵豆46兩親本的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)其在株高、主莖節(jié)數(shù)、結(jié)莢高度、主莖莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、百粒重和單株粒重等9個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀間呈顯著或極顯著分布。因此對(duì)RIL群體的主莖莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、百粒重和單株粒重等性狀進(jìn)行了基因定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作和連作下大豆群體產(chǎn)量性狀表型數(shù)據(jù)分析

由表2可知，親本中的主莖莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、百粒重和單株粒重都顯示出顯著差異。群體中的主莖莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、百粒重和單株粒重在連作條件和輪作條件下都能比較出明顯的數(shù)量遺傳特征，符合正態(tài)分布，根據(jù)結(jié)果顯示可以進(jìn)行QTL定位分析。

表2 遼豆14×鐵豆46雜交組合RIL群體2年表型變異特征值
Table 2 Phenotypic traits for RIL population between Liaodou14 and Tiedou 46

?

2.2 輪作和連作下大豆產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL分析

由表3可知，在不同栽培模式下，2年期間共檢測到34個(gè)不同性狀的QTL。其中，在輪作和連作栽培方式下，共檢查到4個(gè)主莖莢數(shù)QTL（連作栽培方式下檢測到1個(gè)QTL性狀，輪作栽培方式下檢測到3個(gè)QTL性狀）。在輪作栽培方式下，檢測到19個(gè)不同性狀的QTL；在連作栽培方式下檢測到23個(gè)不同性狀的QTL。

表3 輪作和連作下大豆產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL
Table 3 QTL associated with soybean yield-related traits in rotation and continuous cropping systems

?

2.2.1 大豆主莖莢數(shù)的QTL分析 鑒定得到大豆主莖莢數(shù)QTL性狀4個(gè)。在2017年連作種植群體中，檢測到1個(gè)QTL，命名為

qPms-O-1

。在2017年輪作種植群體中檢測到3個(gè)主莖莢數(shù)QTL，分別是

qPms-D1b-1

、

qPms-J-1

和

qPms-J-2

，分別位于D1b染色體和J染色體。其中LOD值分別為2.61，2.50，3.55。貢獻(xiàn)率分別為16.54%、13.28%和14.40%。加性效應(yīng)分別為14.26，4.61，5.39。2.2.2 大豆1粒莢數(shù)的QTL分析 鑒定得到大豆1粒莢數(shù)QTL性狀7個(gè)。2017年在連作種植群體中，檢測到1個(gè)QTL，命名為

qOspn-N-1

，LOD值為5.42。2017年在輪作種植群體中，檢測到2個(gè)QTL，分別命名為

qOspn-D1b-2

和

qOspn-D1b-3

，均位于D1b染色體上，LOD值分別為6.74和4.13，貢獻(xiàn)率分別為7.77%和34.54%。2018年在連作種植群體中共檢測到6個(gè)1粒莢數(shù)QTL，分別位于D1b、I和N染色體上，其中N染色體上的

qOspn-N-1

貢獻(xiàn)率最低（6.2%），LOD值為7.66，加性效應(yīng)為9.54。

qOspn-N-1

和

qOspn-D1b-3

在2017年連作種植群體中已經(jīng)被檢測到1次。2018年在輪作種植群體中，檢測到唯一的1個(gè)1粒莢數(shù)QTL，命名為

qOspn-D1b-

3

，與2018年連作種植群體中檢測到的其中1個(gè)重復(fù)，位于D1b染色體的Satt135~Satt141標(biāo)記之間。2.2.3 大豆2粒莢數(shù)的QTL分析 鑒定得到大豆2粒莢數(shù)QTL性狀7個(gè)。2017年在連作種植群體中，檢測到3個(gè)QTL，分別位于3個(gè)不同的染色體上，LOD值最大達(dá)5.70，貢獻(xiàn)率最大達(dá)9.58%，加性效應(yīng)最大達(dá)12.05。2017年在輪作種植群體中，檢測到4個(gè)QTL，其中有3個(gè)位于D1b染色體上，LOD值最大達(dá)10.04，貢獻(xiàn)率最大達(dá)15.01%。2018年在連作種植群體中，共檢測到2個(gè)2粒莢數(shù)QTL，分別位于D1b和I染色體上，命名為

qTspn-D1b-3

和

qTspn-I-1

。2018年在輪作種植群體中，檢測到1個(gè)2粒莢數(shù)QTL，是位于D1b染色體上的

qTspn-D1b-3

，該QTL位點(diǎn)2017年在輪作種植群體和2018年在連作種植群體中均被檢測到。2.2.4 大豆4粒莢數(shù)的QTL分析 鑒定得到大豆4粒莢數(shù)QTL 6個(gè)，分別位于4個(gè)不同的染色體上。在I染色體上檢測到2個(gè)QTL，命名為

qFspn-I-1

和

qFspn-I-2

。在D1a染色體上檢測到2個(gè)QTL，命名為

qFspn-D1a-1

和

qFspn-D1a-2

。2018年在連作種植群體中檢測到3個(gè)QTL，LOD值最大達(dá)4.41，貢獻(xiàn)率最大達(dá)35.03%，加性效應(yīng)最大為10.47。2018年在輪作種植群體中檢測到2個(gè)QTL，其中

qFspn-D1b-1

的LOD值（3.87）、貢獻(xiàn)率（30.05%）和加性效應(yīng)（5.77）均較高。2.2.5 大豆百粒重的QTL分析 鑒定得到大豆百粒重QTL 2個(gè)。分別是2017年在連作種植群體中檢測到的

qSW-D2-1

,位于D2染色體上；2018年在連作種植群體中檢測到

qSW-D1a-1

,位于D1a染色體上。2.2.6 大豆單株粒重的QTL分析 鑒定得到大豆單株粒重QTL 5個(gè)。2017年在連作種植群體中發(fā)現(xiàn)1個(gè)單株粒重QTL。2017年在輪作種植群體中檢測到2個(gè)單株粒重QTL（

qSwpp-D1b-1

和

qSwpp-J-1

），分別在D1b和J染色體上，LOD值分別為2.71和2.64，貢獻(xiàn)率分別為24.86%和13.60%，加性效應(yīng)分別為11.95和3.61。2018年在連作種植群體中檢測到

qSwpp-N-2

。2018年在輪作種植群體中檢測到

qSwpp-I-1

。2.2.7 大豆耐連作基因的QTL分析 在2017年連作種植群體中，檢測到大豆減產(chǎn)率QTL

qYr-H-1

，位于H染色體的Satt293~Satt181標(biāo)記之間，物理距離為90.35，LOD值為2.71，貢獻(xiàn)率為8.96%。2018年在輪作種植群體中，再次檢測到

qYr-H-1

，但LOD值和貢獻(xiàn)率與2017年在連作種植群體中均不同。另外，還檢測到1個(gè)位于I染色體的QTL，命名為

qYr-I-1

。

3 討論與結(jié)論

通過QTL定位結(jié)果證明，親本各性狀差異顯著，子代各性狀變異幅度大，為QTL定位奠定基礎(chǔ)。部分性狀顯著相關(guān)，可能存在一因多效QTL。研究結(jié)果共確定4個(gè)主莖莢數(shù)QTL，其中3個(gè)主莖莢數(shù)QTL分別位于不同的染色體上，7個(gè)控制1粒莢數(shù)的QTL，在I染色體和N染色體上分別檢測到2個(gè)1粒莢數(shù)QTL。7個(gè)控制2粒莢數(shù)的QTL，在F、G、N、D1b和I共5個(gè)不同的染色體上均同時(shí)檢測到了2粒莢數(shù)QTL。D1a染色體上定位到2個(gè)4粒莢數(shù)QTL(

qFspn-D1a-1

和

qFspn-D1a-2

),QTL區(qū)間與其定位的區(qū)間并不完全重合。1粒莢數(shù)QTL有3個(gè)被重復(fù)檢測到，分別為

qOspn-D1b-1

、

qOspn-N-1

和

qOspn-D1b-3

，其中

qOspn-D1b-3

分別在2017年輪作種植群體中和2018年連作群體中被檢測到。2粒莢數(shù)QTL有2個(gè)被重復(fù)檢測到，分別為

qTspn-D1b-2

和

qTspn-D1b-3

。其中

qTspn-D1b-3

分別在2017年輪作種植群體中，2018年連作群體中和2018年輪作群體中被檢測到，一共被檢測到3次。在不同的種植條件下，一些產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL在2017年和2018年均被檢測到，可以證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可信度較高，可以在不同的種植條件下進(jìn)行持續(xù)且穩(wěn)定的表達(dá)。在輪作和連作條件下，有6個(gè)QTL均被反復(fù)檢測到，說明這些產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL在輪作和連作的條件下均能持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。一些QTL耐環(huán)境變化，但是不耐栽培方式變化，是單一栽培條件下可穩(wěn)定表達(dá)的QTL，可在理想的栽培方式中加以利用。一些QTL耐栽培方式變化，但是不耐環(huán)境變化，是耐連作但是不穩(wěn)定表達(dá)的QTL，具體影響穩(wěn)定表達(dá)的因素有待進(jìn)一步研究。既耐連作又耐環(huán)境的QTL最重要，可能存在穩(wěn)定表達(dá)的耐連作基因，具有重要的利用價(jià)值，可以進(jìn)一步精細(xì)定位以期發(fā)掘重點(diǎn)基因。連作是大豆種植不可避免的現(xiàn)象，因此研究產(chǎn)量性狀QTL在連作條件下的表現(xiàn)，對(duì)于育種具有重要意義。本研究中的

qOspn-D1b-3

、

qOspn-D1b-1

、

qTspn-D1b-2

、

qTspn-D1b-3

、

qFspn-I-1

和

qYr-H-1

的QTL在輪作和連作栽培方式下均可以被重復(fù)檢測到，說明這些QTL在輪作和連作栽培方式下均能持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，不受連作影響。但有些QTL在輪作下可以檢查到，但在連作下檢測不到，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)，以連作減產(chǎn)率為指標(biāo)，進(jìn)行了耐連作基因定位，鑒定到2個(gè)QTL，其中，

qYr-H-1

可以被重復(fù)檢測到，說明其是穩(wěn)定的QTL。應(yīng)用耐連作遼豆14和不耐連作鐵豆46雜交，采用單粒傳構(gòu)建F代重組自交系后的F和F世代材料，在輪作和連作栽培方式下進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL定位，一共鑒定到34個(gè)QTL，其中輪作栽培條件下鑒定得出19個(gè)QTL，連作栽培條件下下鑒定得出23個(gè)QTL。有6個(gè)QTL在輪作和連作情況下被重復(fù)檢測到，并發(fā)現(xiàn)2個(gè)耐連作QTL，分別是

qYr-H-1

和

qYr-I-1

，其中

qYr-H-1

被重復(fù)檢測到。本研究結(jié)果將為耐連作大豆育種提供理論依據(jù)。