岑麗君，左遠(yuǎn)娟，唐乾利

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院，桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001)

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜有序的多步驟過(guò)程，多由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)參與。在臨床上，常將其分為4個(gè)階段，主要是快速止血階段、炎癥階段、增殖階段以及重塑階段，其中任一階段受到干擾均可影響創(chuàng)面的正常愈合。當(dāng)創(chuàng)面愈合過(guò)程受到外界干擾，且超過(guò)1個(gè)月以上的護(hù)理仍未痊愈，這就表明慢性難愈合創(chuàng)面的發(fā)生[1]，其多由糖尿病、壓力性損傷、靜脈栓塞、感染等不良因素造成，其中以糖尿病最為多見[2]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，全球有近10億人患有急性和慢性傷口[3]。在美國(guó)，每年用于治療慢性傷口及其相關(guān)并發(fā)癥的總成本約為500億美元[4]。而在我國(guó)，慢性創(chuàng)面病人占臨床外科長(zhǎng)期住院病人總數(shù)的1.5%～3%，并呈逐年上升趨勢(shì)，其中僅糖尿病性潰瘍的發(fā)病率就由10年前的低于5%上升至36%左右[5]。

目前針對(duì)該病的治療方法有：外科清創(chuàng)、敷料、負(fù)壓吸引、冷大氣血漿、生物活性玻璃等治療方法，這些傳統(tǒng)的治療方法需要嚴(yán)格的患者依從性，同時(shí)慢性的繼發(fā)性高發(fā)，因此臨床上需要徹底解決這一難題，需要開辟出一種在財(cái)務(wù)上、生理上和實(shí)踐上對(duì)傷口護(hù)理環(huán)境可行的新療法。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)的發(fā)展，又相繼出現(xiàn)其他細(xì)胞靶向治療方案，如干細(xì)胞的使用、生長(zhǎng)因子和基因療法等。這些新興的治療手段，靶向性強(qiáng)，安全有效，為進(jìn)一步探索傷口修復(fù)的分子和細(xì)胞特征提供了前所未有的機(jī)會(huì)。由此可見，通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)研究，將為后期臨床解決慢性難愈合創(chuàng)面提供新的可能與方向。核因子紅系-2相關(guān)因子-2(nuclear factor E2-related factor 2，NRF2)作為經(jīng)典的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，大量研究證實(shí)其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，與各種慢性疾病密切相關(guān)[4-5]。遂筆者對(duì)NRF2信號(hào)通路在慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的影響進(jìn)行綜述，以期為創(chuàng)面修復(fù)的臨床和基礎(chǔ)研究帶來(lái)新的突破口，為早日攻克慢性難愈合創(chuàng)面的治療提供可靠的依據(jù)。

1 NRF2信號(hào)通路激活對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程的影響

NRF2是Cap-n-Collar堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的成員，最初被ITOH K等發(fā)現(xiàn)認(rèn)為是β珠蛋白基因表達(dá)的激活劑，最后被認(rèn)定是細(xì)胞中氧化應(yīng)激的主要傳感器[6-7]。其具有7個(gè)功能域(Neh1-7)，參與調(diào)節(jié)NRF2的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性(反式激活)。N端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)介于NRF2和Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)之間低納摩爾濃度下的相互作用，介導(dǎo)NRF2的穩(wěn)定性和泛素化，而Neh5結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)NRF2的細(xì)胞定位[8-9]。Neh6結(jié)構(gòu)域作為含β轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)蛋白的結(jié)合區(qū)域則控制NRF2的Keap1非依賴性降解。Neh1結(jié)構(gòu)域則與NRF2與抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element，ARE)序列結(jié)，此外，其還與UbcM2(E2泛素偶聯(lián)酶)相互作用，調(diào)節(jié)NRF2蛋白穩(wěn)定性[10]。Neh3結(jié)構(gòu)域的C端與轉(zhuǎn)錄共激活劑CHD6(解旋酶DNA結(jié)合蛋白)相互作用，負(fù)責(zé)染色質(zhì)重塑后ARE依賴性基因的跨式活化[11]。Neh4和Neh5是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，與共激活劑環(huán)狀磷酸腺苷單磷酸反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白結(jié)合促進(jìn)NRF2轉(zhuǎn)錄，同時(shí)還與核輔因子RAC3/AIB1/SRC-3相互作用增強(qiáng)NRF2靶向調(diào)控ARE基因表達(dá)。Neh7結(jié)構(gòu)域與視黃酸X受體α相互作用，從而抑制NRF2[12]。

1.1NRF2通過(guò)氧化應(yīng)激影響慢性難愈合創(chuàng)面愈合

1.1.1氧化應(yīng)激對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的影響 氧化應(yīng)激阻礙了慢性難愈合創(chuàng)面(如糖尿病傷口)愈合的進(jìn)展[13-14]。慢性難愈合創(chuàng)面的氧化應(yīng)激的特征是創(chuàng)面活性氧(ROS)產(chǎn)生與消除不平衡而引起ROS水平持續(xù)升高[15]。適當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激有利于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生，而高水平ROS阻礙ECM的正常合成，同時(shí)嚴(yán)重?fù)p害現(xiàn)有的ECM[16-18]。例如，H2O2可以破壞組織生長(zhǎng)，特別是膠原蛋白的產(chǎn)生，從而防止傷口閉合[19]。此外，高水平的ROS可干擾TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響ECM的產(chǎn)生；更甚者，高水平ROS促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生，這反過(guò)來(lái)又會(huì)影響ECM重塑。因此，靶向氧化應(yīng)激可能是慢性難愈合傷口愈合的潛在有效療法。

1.1.2NRF2信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激的作用 NRF2是抗氧化基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要作用是檢測(cè)受傷和發(fā)炎組織中的ROS積累，并激活抗氧化防御系統(tǒng)。在傷口愈合過(guò)程中，ROS作為氧化損傷的主要驅(qū)動(dòng)力，它使Keap1泛素化降解，并與NRF2解偶聯(lián)，解偶聯(lián)后的NRF2進(jìn)入胞核與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[20]。此外，Keap1還能夠降解NRF2的E3泛素連接酶，維持NRF2的表達(dá)量[21]。在正常生理?xiàng)l件下，Keap1也是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合細(xì)胞質(zhì)蛋白，與NRF2和細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，將NRF2隔離在細(xì)胞質(zhì)中，并促進(jìn)其泛素化隨后被蛋白酶體降解[22-23]。這種“系留”效應(yīng)維持了氧化還原穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞保護(hù)酶和蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)基因表達(dá)[24]。越來(lái)越多的研究表明，NRF2/Keap1是糖尿病創(chuàng)面治療的重要靶點(diǎn)。NRF2過(guò)表達(dá)和NRF2活化劑富馬酸二甲酯(DMF)通過(guò)介導(dǎo)的糖尿病創(chuàng)面的氧化應(yīng)激和炎癥促進(jìn)創(chuàng)面愈合[25]。SOARES M A等[26]研究發(fā)現(xiàn)，使用siRNA靶向沉默Keap1的表達(dá)可上調(diào)Nrf2表達(dá)，改善氧化還原穩(wěn)態(tài)，加速糖尿病組織再生至接近正常水平。

1.2NRF2通過(guò)炎癥反應(yīng)影響慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)

1.2.1炎癥對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的影響 創(chuàng)面炎癥是一種非特異性免疫炎癥反應(yīng)，它涉及一系列復(fù)雜的事件：①由病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)介導(dǎo)特異性識(shí)別感染信號(hào)[27]或受損組織[28]；②損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)作為內(nèi)源性分子，可識(shí)別死亡的細(xì)胞，并與模式識(shí)別受體(PRRs)的相互作用激活免疫系統(tǒng)。當(dāng)以上信號(hào)被成功識(shí)別后，跨膜Toll樣受體(TLR)或炎癥小體激活特定的免疫信號(hào)通路[核因子kappa-輕鏈增強(qiáng)子激活B(NF-κB)]。最終NF-κB與IκB解離并易位到核，上調(diào)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些事件進(jìn)一步導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下一階段，例如白細(xì)胞介素-1-β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子的分泌[29]。隨后，這些細(xì)胞因子在損傷部位招募免疫細(xì)胞(例如單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)，導(dǎo)致ROS和氮物種(RNS)的產(chǎn)生，從而破壞蛋白質(zhì)和DNA等大分子。在正常傷口愈合情況下，為了重新建立組織穩(wěn)態(tài)，修復(fù)體會(huì)阻斷進(jìn)一步的中性粒細(xì)胞募集以進(jìn)行傷口愈合。然而在慢性創(chuàng)面處均可觀察到一種或多種長(zhǎng)期存在的炎性因子[30]，使創(chuàng)面處于持續(xù)性炎癥反應(yīng)中，細(xì)胞組織損傷進(jìn)一步加重，最終延遲創(chuàng)面的愈合。細(xì)胞因子與慢性難愈合創(chuàng)面密切相關(guān)，唐乾利團(tuán)隊(duì)前期大量研究已證實(shí)這觀點(diǎn)[31-34]。由此可見炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面修復(fù)的必要過(guò)程，然而過(guò)度炎癥則反之。在炎癥級(jí)聯(lián)中實(shí)現(xiàn)平衡是開發(fā)傷口愈合藥物的具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。

1.2.2NRF2信號(hào)通路對(duì)NF-κB信號(hào)通路作用 B細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路作為炎癥反應(yīng)的“經(jīng)典通路”，它能誘導(dǎo)上述炎癥因子的表達(dá)轉(zhuǎn)錄[35]。NF-κB信號(hào)通路被氧化應(yīng)激刺激時(shí)會(huì)促進(jìn)NF-κB抑制蛋白(IκB)的磷酸化和降解[36]，同時(shí)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)NRF2/ARE系統(tǒng)的激活。在糖尿病創(chuàng)面中，NRF2通過(guò)多種機(jī)制負(fù)向控制NF-κB信號(hào)通路。首先，NRF2通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平來(lái)抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的NF-κB激活。此外，NRF2可防止IκBα蛋白酶降解并抑制 NF-κB的核易位。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，NRF2的激活可以防止LPS引起的親炎細(xì)胞因子如IL-6和IL-1+的轉(zhuǎn)錄性調(diào)高[37]，同時(shí)NRF2還抑制下游IL-17和其他炎癥因子Th1和Th17的產(chǎn)生[38]。在糖尿病慢性難愈合創(chuàng)面中維格列汀通過(guò)抑制炎癥標(biāo)志物TNF-α、IL-6 、激活NRF2發(fā)揮其潛能，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[39]。在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[40]，NRF2可通過(guò)上調(diào)HO-1表達(dá)，抑制TNF-α刺激NF-κB和MCP-1的分泌[41]。這些結(jié)果揭示，當(dāng)有炎癥的刺激時(shí)，NRF2信號(hào)被激活，抑制了親炎細(xì)胞因子和化療因子的過(guò)度生產(chǎn)，同時(shí)限制了NF-κB的激活。

2 NRF2缺乏癥對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的影響

前面已經(jīng)講述了NRF2激活對(duì)傷口愈合的影響，當(dāng)前對(duì)于傷口愈合中NRF2的缺乏也得到了深入的研究。研究表明，NRF2敲除(KO)小鼠對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的癌癥變化敏感，這表明NRF2可以在一定程度上限制癌癥的發(fā)展[42-43]。另一方面，NRF2在許多不同類型的腫瘤中過(guò)度表達(dá)，并且與癌癥預(yù)后不良有關(guān)(包括促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗力)[44-45]。因此，本課題組認(rèn)為NRF2抑制劑可能使抗癌療法更有效和敏感。然而，由于NRF2的抑制機(jī)制未知和較弱的特異性，要使它從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向臨床使用還需要很長(zhǎng)時(shí)間。

關(guān)于NRF2抑制劑在傷口愈合過(guò)程中的應(yīng)用，BRAUN S等[46]觀察到，NRF2 KO小鼠傷口處的膠原蛋白產(chǎn)生以及巨噬細(xì)胞過(guò)度表達(dá)促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致傷口愈合延遲。一般來(lái)說(shuō)，dNRF2突變體可以在細(xì)胞核中聚集并與ARES(抗氧化反應(yīng)元件)結(jié)合，而不會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，該特征可以防止其他轉(zhuǎn)錄因子與AREs結(jié)合，從而有效避免了NRF2缺失引起的補(bǔ)償。然而，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞特異性dnNRF2突變小鼠在正常皮膚和傷口愈合過(guò)程中沒有顯著差異[47]。NRF2在不同的細(xì)胞和不同的環(huán)境中可能具有不同的功能，面臨不同程度的環(huán)境影響，具有不同的靶基因[48-49]。HIEBERT P等[50]發(fā)現(xiàn)，在體外顯示缺乏NRF2的皮膚成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出ROS水平略有增加，而與對(duì)照組相比，其增殖和傷口愈合動(dòng)力學(xué)沒有觀察到差異。因此得出結(jié)論，NRF2在傷口愈合中起著特定的作用。NRF2缺乏小鼠傷口炎癥時(shí)間延長(zhǎng)，表明NRF2缺乏可能對(duì)免疫細(xì)胞的募集有一定的影響[46]。髓系免疫細(xì)胞在傷口愈合中具有關(guān)鍵的作用，因?yàn)槠淇梢缘挚谷肭值募?xì)菌并且通過(guò)產(chǎn)生ROS來(lái)產(chǎn)生促進(jìn)愈合的因子[51]。雖然在野生型小鼠的傷口中僅檢測(cè)到少量NRF2，但其細(xì)胞保護(hù)靶基因NQO-1在巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。將骨髓特異性NRF2 KO小鼠切片，并對(duì)傷口進(jìn)行組織學(xué)免疫，細(xì)胞定量分析顯示傷口愈合無(wú)明顯差異[50]。雖然NRF2在傷口愈合中可能起著重要作用，但其對(duì)于正常愈合健康小鼠的傷口愈合可能不是必需的，只有在慢性難愈合傷口或瘢痕形成等病理性傷口愈合后期有影響。

3 總結(jié)與展望

慢性難愈合創(chuàng)面病因復(fù)雜多變，患病率逐年上漲，盡管近年來(lái)對(duì)它的研究取得了重大的進(jìn)展，但是目前仍無(wú)實(shí)際的治療方針。NRF2信號(hào)通路作為氧化應(yīng)激途徑突出的分子，其可抑制創(chuàng)面處ROS的產(chǎn)生從而起到細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)還可調(diào)控多個(gè)炎癥因子及炎癥通路的基因表達(dá)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)最終影響創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程。正常傷口愈合過(guò)程中NRF2不是必須的，但是在促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面愈合是不可或缺的，在糖尿病引起的難愈合創(chuàng)面研究中就證實(shí)了這一論點(diǎn)[52]。這些發(fā)現(xiàn)證明了NRF2在組織修復(fù)過(guò)程中的多方面作用，同時(shí)可能揭示慢性難愈合創(chuàng)面某些重要的機(jī)制。然而，多項(xiàng)研究中也表明NRF2信號(hào)通路激活在癌癥中作用是雙重的，其在抗癌中的作用仍然存在巨大爭(zhēng)議，因此，臨床上使用NRF2活化化合物對(duì)傷口進(jìn)行生殖作用前，應(yīng)該全面考慮其他潛在的有害活性。這些活化化合物的應(yīng)用應(yīng)限于較短的治期，并排除傷口部位惡性腫瘤的患者。由于不同環(huán)境下NRF2的激活可導(dǎo)致不同的結(jié)果，因此未來(lái)在揭示NRF2的有益與有害作用以及相關(guān)靶基因及其調(diào)控的鑒定的工作將特別重要。只有多緯度了解這些不同點(diǎn)，安全有效的NRF2激活劑才能被開發(fā)出來(lái)。NRF2信號(hào)通路的激活和抑制對(duì)慢性傷口愈合具有多方面的影響，對(duì)其深入研究，可為傷口愈合的臨床研究提供可靠的理論支持。