周文婷，李琛妍，黃凱黎，董蕙華，黃雯，黃衍強，黃干榮

(右江民族醫(yī)學院，廣西高校耐藥微生物感染防治研究重點實驗室，廣西 百色 533000)

白色念珠菌通常以酵母形態(tài)作為良性共生菌生活在哺乳動物宿主中，幾乎一半的人群攜帶有該菌，在免疫缺陷的人群中發(fā)病率最高，可由條件致病菌轉為致病菌，在血流中傳播，引起廣泛的黏膜和全身感染性疾病[1]，死亡率高達30%～50%[2-3]。黏附、侵襲和組織損傷是白色念珠菌的主要致病過程。在該過程中，關鍵的毒力因素之一是菌絲形態(tài)的可塑性，即當宿主微生態(tài)平衡失調或者免疫功能受抑制時，白色念珠菌芽孢和絲狀(假菌絲和真菌絲)之間可進行形態(tài)轉變[4]，菌絲生長后可增強菌株的毒力。同時，菌絲形態(tài)的發(fā)生時，白色念珠菌為了抵抗巨噬細胞的吞噬作用，而利用氨基酸中和吞噬體中的酸性環(huán)境，進行了轉錄重編程，并通過破壞免疫細胞而逃逸[5-6]，從而使黏附、侵襲過程更容易完成。白色念珠菌菌絲形態(tài)的轉變是一個高度極性化的過程。在體外菌絲誘導條件下，多種信號通路對菌絲的發(fā)育有重要的調控作用[4]，關鍵的調節(jié)基因包括Efg1、Cph1、Rim101和羊毛甾醇14α-去甲基化醇(lanosterol 14α-demethylase，CYP51)等[7]。它們是編碼絲狀形成所需的重要轉錄調節(jié)因子，與這些基因相反的負調控基因包括Tup1、轉錄調節(jié)因子(transcriptional regulator，Nrg1)和絲狀生長抑制因子(repressor of filamentous growth 1，Rfg1)等，它們高表達時可明顯阻止絲狀生長。這種菌絲形態(tài)轉變的能力受各種宿主環(huán)境條件變化的影響[8]，如溫度、pH值、營養(yǎng)、血清及CO2等。菌絲是白色念珠菌特有的成分，菌絲壁蛋白等表面黏附素可與上皮細胞受體結合，黏附于黏膜上皮細胞，進而侵襲黏附下層，導致黏膜疾病的發(fā)生[9]，甚至擴散到其它臟器引起全身性感染。目前雖然已知菌絲的形成與菌株的致病性密切相關，但其具體的致病機制尚未完全清楚。因此，本文從菌絲形成的層面綜述白色念珠菌菌絲形成與黏附、侵襲的致病調控機制，為研發(fā)新藥提供靶點，增強防治白色念珠菌感染的效果。

1 白色念珠菌菌絲形成的調控機制

1.1Tup1介導的負調控通路 在Tup1介導負調控通路中通常由Tup1(轉錄抑制因子)、Nrg1(DNA結合蛋白)和Rfg1共同發(fā)揮作用。Tup1通過Nrg1和Rfg1靶向菌絲特異性基因。在非誘導條件下，Nrgl仍然表現(xiàn)為絲狀生長，其缺失突變體形態(tài)類似于Tup1缺失突變體，Nrg1可以抑制由Tup1控制的菌絲調節(jié)蛋白(hyphally-regulated protein，Hyr1)、凝集素樣細胞表面蛋白(agglutinin-like cell surface protein 8，Als8)、細胞伸長蛋白(extent of cell elongation protein 1，Ece1)和菌絲細胞壁蛋白(hyphal wall protein 1，Hwp1)等菌絲特異性基因的轉錄[10]，從而抑制絲狀生長。另有實驗表明，在37℃的血清中，培養(yǎng)誘導白色念珠菌菌絲形成時，可見Nrg1 mRNA表達減少，在誘導菌絲生長后，Nrg1通過迅速從啟動子上解離，快速降低其蛋白水平，并在菌絲伸長過程中保持低水平的方式，維持菌絲的持續(xù)發(fā)育[11]。實驗證明[12]，Tup1、Nrg1單缺失或雙缺失的白色念珠菌菌絲形成能力大大提高，甚至不能形成酵母型細胞。此外還發(fā)現(xiàn)，Tup1和Nrg1可以通過對轉錄調節(jié)蛋白(transcriptional regulatory protein，UME6)的負調控，控制白色念珠菌的毒力和菌絲延伸[13-14]。因此，Tup1介導的負調控通路是多種轉錄抑制因子和DNA結合蛋白共同協(xié)同作用，其中Tup1、Nrg1和Rfg1是該通路的關鍵調控因子。

1.2Cph1介導的MAPK信號通路 Cph1、鋅簇轉錄因子(zinc cluster transcription factor，Czf1)和生物膜調節(jié)劑(biofilm regulator，Brg1)等均為參與正向調控的關鍵因子。這些正向調控因子能夠對不同絲狀化途徑傳輸?shù)男盘栕鞒龇磻?，或能進一步從多個途徑傳遞信號。Cph1介導的MAPK通路是目前研究比較清楚的信號通路，在低氮環(huán)境培養(yǎng)白色念珠菌時，可激活MAPK信號通路從Cst20→Ste11→Hst7→Cek1傳遞信號，并由Cph1誘導菌絲形成。若該通路中的調控因子缺失，則抑制菌絲形成，從而降低毒力。但所有這些基因缺失的突變體在血清誘導下仍能正常形成菌絲，說明血清對菌絲形成的誘導并非完全通過MAPK信號通路完成[15]，尚有旁路進行彌補。因此，該通路的Cph1等基因并不是設計藥物的理想靶基因。

1.3Efg1介導的cAMP/PKA信號通路 Efg1(絲狀生長蛋白)主要通過調節(jié)菌絲形態(tài)生成和促使白色念珠菌侵入內皮細胞來促進毒力。它介導的cAMP-PKA通路，是由腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，Cyr1)以Ras依賴性和Ras非依賴性方式來整合多種線索。收到環(huán)境誘導信號后，活化的AC(腺苷酸環(huán)化酶)增加cAMP的合成，從而激活cAMP依賴性蛋白激酶調節(jié)亞基(cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit，Bcy1)，進而激活PKA的兩個催化亞基cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit，Tpk1)和cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit，Tpk2)，二者在菌絲生長和脅迫耐受中發(fā)揮不同的作用[15]。Tpk1有助于固體培養(yǎng)基上的成絲，是細胞壁完整性和藥物耐受性所必需的；而Tpk2則參與液體培養(yǎng)基中的菌絲生長，是二態(tài)性和黏附的關鍵調節(jié)因子[7，16-17]。它們通過磷酸化激活Efg1形成啟動子，上調基因的表達誘導菌絲形成[18]。有研究表明，Efg1的表達受到5’UTR介導的翻譯機制的控制。與UME6 5’UTR相反的是，Efg1 5’UTR的缺失抑制白色念珠菌的絲狀形成[19]。此外，Efg1作為低氧阻遏物，其功能明顯依賴于溫度，其突變體在不超過35℃的溫度下呈超絲狀，而在37 ℃時，無論是缺氧還是常氧條件下，都無法形成菌絲[20]?？梢?，可以通過熱效應等方法抑制Efg1介導的cAMP/PKA信號通路，從而抑制菌絲的生長。

1.4Rim101介導的pH信號通路 白色念珠菌要在體內不同部位定植、存活，就必須感知和適應細胞外pH值的變化，這種能力受pH信號轉導途徑的控制[21]。pH信號通路主要由Rim101介導[22]。在口咽道和血液的中性及堿性條件下，Rim101通過蛋白水解被加工成74-kDa的活性形態(tài)，有利于白色念珠菌的絲狀化；在胃腸道和陰道腔的酸性環(huán)境中，則被加工成65-kDa的蛋白質[23]。此外，RIM8、RIM13和RIM20的輔助是Rim101激活過程中必不可缺的，任一的缺失都將抑制菌絲形成，從而降低白色念珠菌對上皮細胞的黏附能力[24]。但是適合白色念珠菌生長的pH值范圍比較大，偏酸有利于菌絲形成，偏堿有利于孢子形成，不能從根本上抑制白色念珠菌。因此，抑制該通路只能延緩感染或降低致病毒力。

2 白色念珠菌菌絲與黏附、侵襲的致病調控機制

2.1CYP家族基因對白色念珠菌菌絲伸長和侵襲的調控 麥角甾醇是脂膜的重要組成部分，它不單能調節(jié)真菌膜的流動性、滲透性和完整性，還是細胞內多種生物學過程的重要調控因子[25]。從乙酰CoA到麥角甾醇，其生物合成過程非常復雜且高耗能，在酵母菌中，其生物合成的3個階段分別發(fā)生在細胞內不同的位置[26-27]，如圖1所示[27]。

圖1 釀酒酵母中的麥角甾醇生物合成途徑

CYP51是真核細胞中功能最保守的細胞色素p450單加氧酶，其介導了麥角甾醇合成的關鍵步驟[28]。治療白色念珠菌病時，若CYP51(Erg11)缺失或者抑制其表達，則會抑制麥角甾醇的代謝，影響白色念珠菌菌絲伸長和侵襲性生長的能力，ROS清除缺陷，從而導致體內毒力降低。唑類藥物是主要的抗真菌藥物，其活性基團里含氮雜環(huán)中的氮原子通過配位鍵與Erg11編碼的血紅素鐵活性中心結合來阻礙氧原子與活性中心的結合，從而抑制羊毛甾醇C-14α位的甲基羥基化反應，影響甾醇的生物合成[29-30]。甾醇的缺失又會進一步影響細胞膜功能的發(fā)揮，進而導致白色念珠菌生長受抑。此外，Erg11缺陷體能夠被巨噬細胞更有效地殺死并在體內失去毒力，當Erg11p被抑制時，途徑中的Erg6p、Erg25p、Erg26p、Erg27p和Erg3p等其他酶可以合成一種抑制真菌的有毒甾醇[14α-甲基麥角8-24 (28)二烯醇]，也會導致白色念珠菌的生長受抑[31-32]。因此CYP51(Erg11)對膜的穩(wěn)定性和功能是必需的，是唑類殺菌劑抗真菌的主要靶點，也是設計藥物抑制菌絲的關鍵靶點。

2.2水解酶對白色念珠菌菌絲侵襲過程的調控 主動侵襲是白色念珠菌侵襲黏膜屏障的主要機制之一，通過分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted asparty proteinase，SAP)、磷脂酶B(phosphohpase，PLB)和脂肪酶等各種水解酶破壞上皮細胞的結構形成通道，進而延長菌絲促使菌株侵襲黏膜屏障[33]。Sap的高蛋白水解酶活性能夠降解多種宿主細胞黏膜表面的保護分子，為白色念珠菌生長提供營養(yǎng)[13]，同時通過增強其黏附和入侵的能力，促進白色念珠菌對宿主組織的侵襲和免疫逃逸[19]。Sap由10個Sap基因編碼，機體免疫功能越低時，白色念珠菌分泌Sap的能力則越強[34]。Sap在酵母相和菌絲相間存在差異性表達，如Sap1-3主要表達于酵母相與白-灰表型轉換期，而酵母型與菌絲狀的轉變則主要通過Efg1調節(jié)Sap4-6的表達[35]。ABIRAMI G等[36]證實了，Sap1、Sap2與生物膜的形成、磷脂酶和胞外多聚物的產生有關。Sap9與Sap10介導生物膜的形成，并在白色念珠菌細胞壁完整性以及與人類上皮細胞和中性粒細胞的相互作用中發(fā)揮作用[37]。此外，Sap9還參與白色念珠菌芽管的生成，促使中性粒細胞趨化到菌絲，通過EFG1介導的cAMP-PKA途徑對血清菌絲誘導刺激作出反應[38]。PLB的水解酶和溶血磷脂酶一轉?；富钚钥梢苑纸馑拗骷毎ち字?，引起膜通透性的增高和完整性的損傷，促使白色念珠菌侵入，但是電鏡下觀察到磷脂酶B缺陷型菌株和野生菌株對上皮細胞的黏附性無明顯差異[39]，因此，磷脂酶B僅與宿主細胞膜的損傷有關，與黏附力無直接作用關系[40-41]?？梢?，在水解酶中，能作為藥物靶點的可能主要是Sap。

2.3細胞壁蛋白對白色念珠菌菌絲黏附過程的調控 白色念珠菌侵襲黏膜屏障的另一主要機制是誘導內吞[33]。在黏附過程中，白色念珠菌表達了大量的細胞壁蛋白，包括黏附素和菌絲壁蛋白。目前研究比較深入的黏附素是凝集素樣序列(agglutinin-like sequence，Als)基因家族。該家族蛋白中心結構中的重復序列富含暴露于細胞表面的絲氨酸和蘇氨酸，這使得該家族的蛋白大多具有黏附功能[42-43]。編碼的細胞表面糖蛋白在黏附方面具有重要作用。其中，Als3編碼參與白色念珠菌黏附、生物膜形成、侵襲和鐵獲取的多功能細胞壁表面蛋白，是唯一具有顯著侵襲功能的成員[44]。PHAN Q T等[45]發(fā)現(xiàn)，Als3是白色念珠菌附著并損傷內皮細胞、上皮細胞和細胞外基質的關鍵，它以哺乳動物鈣黏蛋白的分子模擬物的形式，與宿主細胞中的E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白結合，刺激肌動蛋白介導的生物體內吞作用，促進白色念珠菌入侵內皮細胞和口腔上皮細胞。此外，它還作為鐵蛋白受體促進鐵的獲取，利于白色念珠菌在宿主中的生存[44]。Als3作為菌絲特異性基因，由Tup1、Nrg1和Rfg1(菌絲特異性抑制因子)下調其轉錄，誘導菌絲形成的兩個轉錄因子Efg1和Cph1則與其上調有關，如圖2所示。Als1和Als5也可誘導內皮細胞的內吞作用，但與鈣粘蛋白的結合較為弱[46]。

圖2 Als3表達的轉錄調控圖

具有顯著抗原和菌絲特異性的Hwp1(菌絲細胞壁蛋白1)是發(fā)育調節(jié)的重要黏附素，也是菌絲發(fā)育、交配、維持生物膜完整性、附著宿主等所必需的。Hwpl通過共價連接白色念珠菌菌絲與宿主細胞，促進念珠菌的黏附，從而引起念珠菌感染[47]。另外，有研究表明，在生物膜形成過程中，Hwp1、Als1、Als3和ECE1以互補結合的方式發(fā)揮它們的作用[48-49]。可見，Als應該是匯集了其它通路的作用，是目前藥物設計最為關鍵的靶基因。

3 總結

近年來，白色念珠菌的感染和耐藥率逐步攀升，尋找和開發(fā)高效低毒的系統(tǒng)性治療藥物是緊急的任務。菌絲作為白色念珠菌的毒力因子逐漸成為研究的熱點，其發(fā)病機制和毒力因子的關系以及毒力因子的組成非常復雜，涉及很多的理化因素和調控機制，與此相關的研究雖然越來越多，但是沒有形成非常清晰的關系網絡和明確的藥物作用靶點。目前發(fā)現(xiàn)菌絲形成與翻譯相關的CYP51、Sap和Als等基因可能是比較理想的藥物靶基因，Tup1和Efg1等通路基因也可以作為藥物靶點，但是Cph1和Rim101等基因可能不是主要的藥物靶基因，是否還有更理想的藥物靶基因，需要進一步探索白色念珠菌的致病機制及生長規(guī)律。