莊珍珍，陶一勤，胡海峰，肖大樹

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院，安徽 合肥 238000)

心房顫動(atrial fibrillation，AF)在臨床工作中較為常見，多好發(fā)于中老年人群，是危害較為嚴(yán)重且極具復(fù)雜性的一種心律失常，它不僅可引起栓塞、中風(fēng)、心力衰竭，甚至還可能導(dǎo)致死亡，有報道稱近些年我國房顫患者發(fā)病率與致死率均呈升高趨勢[1-2]。反復(fù)多次發(fā)作的心房顫動會過度激活心房組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)，這會引起心肌組織重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心房電活動異常。按病因可將心房顫動分為瓣膜性心房顫動及非瓣膜性心房顫動兩類，血栓發(fā)生率前者明顯高于后者，即瓣膜性心房顫動患者危險級別較高[3]。瓣膜性心房顫動是最常見的基礎(chǔ)性心臟病變，其中典型的病理學(xué)改變是心肌重構(gòu)，但引起瓣膜性心房顫動的分子機(jī)制尚不完全清楚[4-5]。組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一類通過從組蛋白的ε-N-乙酰賴氨酸氨基酸中脫乙?；鶑亩笵NA緊密包裹的酶，HDACs在維持生物體內(nèi)組蛋白乙?；Ｈ旧|(zhì)和異染色質(zhì)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用[6]。組蛋白去乙?；?(HDAC4)是一種Ⅱa類組蛋白去乙?；?，與心肌組織重構(gòu)及心肌纖維化等密切相關(guān)[7]。但是，關(guān)于HDAC4對瓣膜性心房顫動有何影響鮮見報道，其相關(guān)調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步探究。本研究以瓣膜性心房顫動患者作為研究對象，探究HDAC4與Ⅰ型膠原(Col1A1)在瓣膜性心房顫動患者中的表達(dá)水平變化及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 自2020年10月—2022年4月采集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院心胸外科行瓣膜置換術(shù)(心臟瓣膜病)和開胸修補(bǔ)術(shù)(先天性心臟病)患者的臨床信息和右心房組織標(biāo)本，依據(jù)患者病史、心臟彩超、常規(guī)心電圖及24 h動態(tài)心電圖分為瓣膜性心房顫動組(AF組)，先心病開胸修補(bǔ)術(shù)并呈竇性心律組(SR組)，收集AF組30例，SR組30例，觀察對比HDAC4與Col1A1在兩組患者中的表達(dá)水平。 病例采集納入標(biāo)準(zhǔn)：接受相關(guān)檢查已經(jīng)確診的心臟瓣膜病且具有明確手術(shù)指征的患者。病例采集排除標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動脈血管狹窄程度70%以上者；擴(kuò)張型心肌病者；甲狀腺功能亢進(jìn)或降低者；年齡超過65歲；高血壓級別3級以上者；有明顯的呼吸道感染癥狀；全身結(jié)締組織疾病患者；慢性肺源性心臟病者。該研究通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.1.2主要試劑 英國Abcam公司的HDAC4 和Collagen Ⅰ抗體；武漢Boster公司的β-actin抗體；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔 IgG；美國 Invitrogen公司的TRIzol試劑；上海生工生物工程股份有限公司的HDAC4、Col1A1、β-actin引物；日本TaKaRa公司的One Step TB Green○RPrime ScriptTMPLUS RT-PCR Kit 。

1.1.3主要儀器 美國ABI公司的Applied Biosystems Gene Amp Step OneTM Real-Time qPCR System ；中國海爾公司的超凈工作臺；德國Eppndorf公司的PCR擴(kuò)增儀；美國Biorad公司的Western blotting相關(guān)儀器設(shè)備；美國Sigma公司的高速低溫離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本取材及處理 在外科手術(shù)中取符合入組要求患者的右心房組織標(biāo)本(0.3～0.5 cm3)，將標(biāo)本去除雜質(zhì)并分成3份，將第1份置入4%甲醛溶液進(jìn)行固定，以備石蠟切片及免疫組織化學(xué)染色；將第2份送EP管以備膠原蛋白含量檢測和mRNA分離；將第3份送液氮瓶中-80 ℃保存以備蛋白提取、Western blot法等檢測。

1.2.2HE染色 石蠟切片脫蠟至水、細(xì)胞核采取蘇木素染色、細(xì)胞質(zhì)采取伊紅染色、脫水封片，在顯微鏡下鏡檢，圖像采集與分析。

1.2.3Masson染色 石蠟切片脫水；蘇木紫染液與三氯化鐵溶液混合液染色10 min后自來水沖洗；鹽酸乙醇溶液分化1 min后自來水沖洗；氨水1 min后自來水清洗；麗春紅染色10 min，乙酸溶液1 min；乙酸溶液1 min；苯胺藍(lán)染色2 min，乙酸溶液1 min；95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯處理，最后樹膠封片。

1.2.4目標(biāo)cDNA獲取、qRT-PCR檢測心肌HDAC4和Col1A1 mRNA表達(dá) 按照TRIzol說明書，TRIzol試劑裂解組織分離總RNA，總RNA的濃度以及純度采用分光光度計測定分析，將A260/A280在1.6～2.0 的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得目標(biāo)cDNA，以目標(biāo)cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測：找相應(yīng)引物序列，交由生工生物工程股份有限公司合成目標(biāo)引物。HDAC4引物序列如下：上游引物：5′-ACATCAGAGACCCAATGCCA-3′，下游引物：5′-CTTCTCACACT TTGCGCCT-3′；ColA1引物序列如下：上游引物：5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′，下游引物：5′-CCACGTCTCACCATTGGGG-3′；β-actin 引物序列如下：上游引物：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物：5′-ACGCAGCTCAGTA ACAGTCCG-3′。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40循環(huán)；條件 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s為溶解曲線階段，以β-actin作為內(nèi)參照物，相對表達(dá)水平應(yīng)用 2-ΔΔCt法計算。

1.2.5Western blot檢測HDAC4、Col1A1蛋白表達(dá) 提取組織蛋白，吸出裂解液放入1.5 mL EP管中，4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，吸取上層蛋白清液，進(jìn)行定量、變性。蛋白電泳，配置8%的分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行蛋白分離。轉(zhuǎn)膜，按照蛋白marker指示切出所需膠帶，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，恒流200 mA，轉(zhuǎn)膜時間按照1 kd/min；TBST洗膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜3次，4 ℃孵育一抗，過夜，洗膜，孵育二抗1 h，洗膜，ECL法顯影，測定灰度值，分析蛋白表達(dá)量。

1.2.6免疫組織化學(xué)法檢測HDAC4、Col1A1蛋白表達(dá) 將組織進(jìn)行石蠟切片脫蠟至水，按說明書步驟進(jìn)行操作：置入煮沸的修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水阻斷非特異性達(dá)到內(nèi)源性酶的消除，二抗血清封閉，一抗4 ℃孵育過夜，孵育二抗實現(xiàn)血清封閉與抗體孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片、鏡檢，觀察并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較 AF組年齡均值偏大、病程偏長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；超聲心動圖顯示：AF組較SR組LVEDD水平偏大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；兩組均值在LAD、RVD、LVEF上無明顯差異；AF組較SR組RAD水平偏小，差異具有統(tǒng)計學(xué)(P<0.05)。見表1。

表1 各組患者心功能指標(biāo)比較

2.2HE染色檢測心肌組織的病理改變 HE染色對比提示，SR組正常；AF組排列紊亂，心肌組織間質(zhì)增多，炎性細(xì)胞浸潤其中，見圖1。

圖1 HE染色—兩組心肌組織病理改變(×200)

2.3Masson染色檢測心肌膠原纖維物質(zhì)沉積 從Masson染色最終結(jié)果提示，SR組心肌被染成紅色、細(xì)胞核被染成藍(lán)色、膠原纖維物質(zhì)沉積明顯較少，而AF組膠原纖維物質(zhì)沉積明顯增多，心肌Masson染色如下，見圖2。CVF分析結(jié)果顯示：AF組CVF(18.03±2.62)與SR組(12.67±3.14)相比較，示前者心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.183，P<0.001)。

圖2 Masson染色檢測心肌膠原纖維物質(zhì)沉積(×200)

2.4qRT-PCR檢測心肌組織中HDAC4和Col1A1 mRNA表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果提示，SR組心肌組織中HDAC4和Col1A1 mRNA較少，而AF組心肌組織中HDAC4和Col1A1 mRNA明顯增高。AF組心肌組織HDAC4和Col1A1 mRNA明顯高于SR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

注：與SR相比，*P<0.05。

2.5Western blot檢測心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果提示，SR組心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白較少，AF組心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白增高。AF組較SR組心肌組織HDAC4和Col1A1蛋白明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：與SR相比，*P<0.05。

2.6免疫組化法檢測心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白的表達(dá) 免疫組化法檢測結(jié)果提示，SR組心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白陽性染色較少，AF組心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白染色陽性明顯增高，見圖5。

圖5 免疫組化法檢測心肌組織中HDAC4和Col1A1蛋白的表達(dá)(×200)

3 討論

AF常好發(fā)生于具有器質(zhì)性心臟病的患者，尤以瓣膜性心房顫動最為多見。瓣膜性心房顫動發(fā)生率及死亡率較高[8]。心肌重構(gòu)是導(dǎo)致瓣膜性心房顫動的重要因素，是一種常見的、致命的病理狀態(tài)，它包括心肌細(xì)胞的肥大生長、纖維化和炎癥發(fā)生發(fā)展[9]。研究提示，心肌纖維化是導(dǎo)致心肌重構(gòu)的關(guān)鍵因素，心肌纖維化不僅是因為心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原等沉積，它本身更會促進(jìn)纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[10-11]。因此，探究對心肌重構(gòu)纖維化的分子機(jī)制，有助于改善瓣膜性心房顫動的發(fā)生發(fā)展，為瓣膜性心房顫動的預(yù)防和治療提供一定參考價值。本實驗通過檢測HDAC4和Col1A1在瓣膜性心房顫動患者中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)瓣膜性心房顫動患者心肌組織間質(zhì)、炎癥細(xì)胞浸潤、心肌膠原纖維物質(zhì)沉積、HDAC4和Col1A1 mRNA以及蛋白含量均偏高。實驗檢測結(jié)果表明：HDAC4在心肌重構(gòu)組織中表達(dá)明顯升高，同時Col1A1 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平明顯增高。

HDACs是一類功能強(qiáng)大的蛋白分子，是調(diào)控基因的重要組成部分，具有清除染色體組蛋白核內(nèi)賴氨酸殘基乙?；墓δ埽鶕?jù)其序列與酵母中產(chǎn)生的同源物的相似性，被分為4類，HDAC4為Ⅱ類HDACs[12]。HDACs在心血管疾病發(fā)病中起著重要作用。研究顯示[13]，在小鼠肺纖維化模型中，組蛋白乙?；赡軐w維連接蛋白基因的表達(dá)起到調(diào)控的作用，HDAC4在肺纖維化的早期應(yīng)激反應(yīng)中表達(dá)增高。在肝纖維化的發(fā)展過程中，HDAC4通過調(diào)節(jié)mir-206和促進(jìn)肝纖維化直接參與肝星狀細(xì)胞的活化和增殖[14]。本研究顯示HDAC4在瓣膜性心房顫動心肌組織中表達(dá)升高，與其他疾病研究結(jié)果類似，然而，具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待深入研究。

HDACs有望成為纖維化程度的提示指標(biāo)并且可為纖維化的防治提供思路。有研究顯示，HDAC6在纖維化的肺組織中高表達(dá)，應(yīng)用HDAC6抑制劑可明顯降低肺組織的纖維化程度[15]。結(jié)合以往研究結(jié)果提示HDAC4含量可以作為瓣膜性心房顫動患者心肌纖維化程度的反映指標(biāo)，未來可通過研究并應(yīng)用HDAC4抑制劑預(yù)防心肌組織纖維化或減輕心肌組織纖維化程度。而且，有關(guān)學(xué)者研究已經(jīng)證實HDAC5 參與介導(dǎo)組蛋白 H3K27乙?；Ш鈱?dǎo)致心肌重構(gòu)，但HDAC4是否也是通過介導(dǎo)組蛋白H3K27乙?；Ш庖鹦募≈貥?gòu)尚且不甚明了，這也有待通過下一步深入研究來探索證實[16]。大量成纖維細(xì)胞及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集的一個過程即叫做纖維化，它同時伴有細(xì)胞周圍炎癥的浸潤及組織結(jié)構(gòu)的損傷。研究顯示，一直存在的成纖維細(xì)胞會分泌包括Col1A1蛋白在內(nèi)的各種細(xì)胞支架蛋白，蛋白的過度沉積促成纖維化的發(fā)生發(fā)展[17]。而且，有研究提示Ⅰ型膠原mRNA及其產(chǎn)生的蛋白量可提示纖維化的程度[18]。本次研究中發(fā)現(xiàn)瓣膜性心房顫動患者心肌組織中Col1A1表達(dá)較為旺盛，這也反映出在瓣膜性心房顫動患者心肌重構(gòu)中Col1A1發(fā)揮著重要作用。

本研究屬于單中心研究，病例數(shù)相對較少，可能存在選擇性偏倚而導(dǎo)致結(jié)果具有一定誤差，因此本研究具有一定局限性，后續(xù)可通過多中心大樣本研究來獲得更為有意義的結(jié)果。

綜上所述，從HDAC4和Col1A1 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平能夠看出，HDAC4參與瓣膜性心房顫動的發(fā)生發(fā)展，表明HDAC4可以作為潛在抑制瓣膜性心房顫動的調(diào)控因子。因此，通過干擾HDAC4的表達(dá)水平，可能對心臟重構(gòu)發(fā)揮干預(yù)的效果。