徐婷，華高艷

(1. 安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，安徽 池州 247099；2. 安徽省池州市人民醫(yī)院腫瘤科，安徽 池州 247099)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)HCC發(fā)病率逐年升高[1]。晚期HCC的預(yù)后仍然很差，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者5年生存率低于10%[2]。盡管近年來(lái)在治療HCC患者方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但考慮到晚期患者的高死亡率，仍然迫切需要更好的治療方法。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNAs)假說(shuō)揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制。CeRNAs網(wǎng)絡(luò)將編碼蛋白質(zhì)的mRNAs的功能與非編碼RNA(ncRNAs)的功能聯(lián)系起來(lái)，如微RNA(miRNAs)、長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)、假基因RNA和環(huán)狀RNA(circRNAs)[3]。ncRNA水平的增加可以作為RNA海綿吸附miRNA，并調(diào)控靶基因表達(dá)。假基因RNA被定義為在隨機(jī)復(fù)制進(jìn)化過(guò)程和突變中的蛋白質(zhì)編碼基因[4]，這些基因長(zhǎng)期以來(lái)被稱為“垃圾DNA”。然而越來(lái)越多的證據(jù)表明假基因作為ceRNAs影響著它們的同源基因和無(wú)關(guān)基因，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。例如，假基因PTENP1作為miR-499-5p海綿用于操縱小鼠親代癌基因PTEN的表達(dá)[6]。然而，它們與HCC的相關(guān)性在很大程度上仍然未知。在這項(xiàng)研究中，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)確定了7個(gè)上調(diào)的假基因，其中，MTND4P12的表達(dá)量與HCC患者的總體生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，但MTND4P12在HCC中的作用和機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將探討MTND4P12表達(dá)與HCC臨床病理的相關(guān)性及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 以回顧性研究手段，選取2020年1月—2021年6月在安徽省池州市人民醫(yī)院腫瘤科確診和手術(shù)切除的患者HCC組織50例，并取癌旁組織25例(通過(guò)RT-PCR收集和分析新鮮配對(duì)組織)為對(duì)照。所有病例均經(jīng)本院病理科主任級(jí)兩位專家共同確診。其中，男29例，女21例；Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期10例，Ⅳ期33例；患者年齡40～86歲，平均(59.22±9.11)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：池醫(yī)倫審( 2019)第(048)號(hào)。

1.2細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞SMMC-7721來(lái)源于上海細(xì)胞生物研究所。SMMC-7721細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在含有5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到含有完全培養(yǎng)基的6孔板。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到40%～70%匯合后，使用 Lipofectamine 2000 Kit (Invitrogen) 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。Si-MTND4P12、MTND4P12的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及它們所對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照均由上海吉瑪基因提供。

1.3qRT-PCR 轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞24 h后經(jīng)過(guò)TRIzol消化，收集并至-80 ℃環(huán)境下保存。使用 PrimeScript RT Reagent試劑盒(Bio-Rad，中國(guó)杭州)進(jìn)行互補(bǔ) DNA(cDNA)的合成。接下來(lái)，在LihgtCycler480上使用 SYBR PremixExTaqⅡ試劑盒(Takara，中國(guó)杭州)，進(jìn)行了 qRT-PCR檢測(cè)。采用歸一化對(duì) qRT- PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，18S作為內(nèi)源性對(duì)照。

1.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 為研究細(xì)胞增殖能力，經(jīng)轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板中，分別在24 h、48 h、74 h將10 μL的CCK-8試劑添加到每孔中，并孵育3 h，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。

1.5傷口愈合實(shí)驗(yàn) 對(duì)于傷口愈合試驗(yàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞接種在6孔中板直到80%～90%匯合，使用無(wú)菌微量移液器吸頭均勻刮除，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。圖像是傷口形成后0 h和24 h獲得。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，將細(xì)胞密度調(diào)整至3×105細(xì)胞/毫升。接下來(lái)，將100 μL細(xì)胞懸液加入24孔transwell 室的上室，同時(shí)將600 μL含有10% FBS的1640培養(yǎng)基加入下室。37 ℃、5%CO2孵育24 h后，取出小室，PBS洗2次，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min。在顯微鏡的引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7生物信息學(xué)分析 THE HUMAN PROTEINATLAS在線工具 (https：//www.proteinatlas.org/) 評(píng)估HCC腫瘤中MTND4P12的mRNA 和蛋白水平。此外，通過(guò)GEPIA (Gene Expression Profiling) 提供的在線工具交互分析(http：//gepia.cancerpku.cn/) 和 UACLAN (http：//ualcan.path.uab.edu/) 獲得在線工具用于確定MTND4P12表達(dá)和TCGA 隊(duì)列中患者的臨床病理要素以及MTND4P12表達(dá)的生存曲線使用，|logFC|≥1和P≤0.01作為截止標(biāo)準(zhǔn)。再利用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//starbase.sysu.edu.cn/panGeneCoExp.php)預(yù)測(cè)MTND4P12的調(diào)控靶基因。

1.8免疫組化方法 組織標(biāo)本利用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。切片脫蠟和水化后，通過(guò)3%過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次后，將組織與兔抗人MTND4P12 (1∶100；Santa Cruz，CA)在4 ℃下孵育過(guò)夜，經(jīng)PBS緩沖液沖洗3次，5分鐘/次，再與抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶(1∶100；Dako，Glostrup，Denmark) 在室溫下孵育1 h，使用 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯示。蘇木精復(fù)染后，觀察切片。結(jié)果判斷：MTND4P12定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，采用半定量評(píng)分方法。

1.9Western blot 使用組織勻漿器將腫瘤組織搗碎在一起，再補(bǔ)充含有1 mM的放射免疫沉淀(RIPA)、苯甲基磺酰氟(Beyotime)和磷酸酶抑制劑雞尾酒(羅氏，巴塞爾，瑞士)緩沖液中溶解和超聲。蛋白質(zhì)濃度使用Pierce BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)量套件(瑞士雷納赫賽默飛世爾科技公司)。這些蛋白質(zhì)用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(微孔，美國(guó)馬薩諸塞州伯靈頓)，220 mA電壓下持續(xù)2 h，在5%的脫脂牛奶中封閉2 h。之后用TBST清洗，將膜與抗 MTND4P12 抗體(1∶500稀釋，A-AO1709a，艾美捷，中國(guó)武漢)在4 ℃下孵育12 h。膜在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗Rabbit二級(jí)抗體(β-Actin，1∶50000稀釋)(ZSGB-BIO，TA-09，中國(guó)北京)。中室溫下孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0，計(jì)數(shù)資料以頻率和/或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)和單因素方差分析用于比較計(jì)量資料數(shù)據(jù)。以Kaplan-Meier分析進(jìn)行患者生存時(shí)間。單變量和多變量 Cox應(yīng)用回歸分析來(lái)衡量 MTND4P12表達(dá)和其他臨床參數(shù)，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTND4P12在HCC組織中的表達(dá) TCGA和THE HUMAN PROTEINATLAS數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，MTND4P12在HCC組織和癌旁組織中以及HCC細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，且本院樣本W(wǎng)B結(jié)果表明，MTND4P12在HCC組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為78.00%，較癌旁組織(32.00%)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 HCC組織中MTND4P12的表達(dá)

A：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC癌旁組織(N，160例)與腫瘤組織(T，369例)中MTND4P12表達(dá)情況；B：THE HUMAN

2.2MTND4P12的表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TCGA和THE HUMAN PROTEINATLAS數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，MTND4P12的表達(dá)水平與HCC的分期未見(jiàn)顯著差異；但在本院39例MTND4P12陽(yáng)性組中，31例(79.49%)合并肝轉(zhuǎn)移，且患者的TNM分期多為Ⅳ期患者，占84.62%，與MTND4P12陰性組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但MTND4P12的表達(dá)與HCC組織的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 MTND4P12表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 HCC組織中各期MTND4P12的表達(dá)情況

2.3MTND4P12的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，與MTND4P12低表達(dá)患者相比，高表達(dá)患者生存時(shí)間明顯縮短(P=0.006)，見(jiàn)圖3。

圖3 MTND4P12的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.4MTND4P12調(diào)控的機(jī)制預(yù)測(cè) Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，MTND4P12與PSM-D11表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)(見(jiàn)圖4A)，且PSMD11在HCC癌組織中高表達(dá)(見(jiàn)圖4B)，PSMD11高表達(dá)患者生存時(shí)間明顯縮短(見(jiàn)圖4C)。

A：MTND4P12與PSMD11的關(guān)聯(lián)性；B：PSMD11在HCC癌組織中高表達(dá)；C：PSMD11的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

2.5MTND4P12在HCC細(xì)胞中的表達(dá)及作用 為了研究MTND4P12在HCC中的作用，在HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-MTND4P12或過(guò)表達(dá)MTND4P12，qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染si-MTND4P12后，MTND4P12的表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)MTND4P12后，MTND4P12的表達(dá)顯著升高(見(jiàn)圖5A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，沉默MTND4P12后，SMMC-7721細(xì)胞活力下降(見(jiàn)圖5B)。MTND4P12敲低和過(guò)表達(dá)同時(shí)抑制了肝癌細(xì)胞的傷口愈合能力和遷移能力(見(jiàn)圖5C和5D)。相比之下，本研究在其親本細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了MTND4P12過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞增殖能力上升，遷移能力加強(qiáng)，傷口愈合能力變強(qiáng)。

A：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后效果評(píng)價(jià)；B：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24～72 h增殖能力評(píng)價(jià)；C：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h侵襲能力評(píng)價(jià)；D：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h遷移能力評(píng)價(jià)。Si-NC：干擾陰性對(duì)照組；Si- MTND4P12：MTND4P12干擾組；Vector：過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組；MTND4P12：MTND4P12過(guò)表達(dá)組。

3 討論

近年，隨著對(duì)非編碼RNA研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)支持假基因在腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等方面發(fā)揮作用，且隨著大量與癌癥相關(guān)的新的假基因被發(fā)現(xiàn)，有希望找到更多地治療癌癥的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，假基因 MTND4P12在HCC癌組織中高表達(dá)，且與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。在構(gòu)建假基因miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)后，發(fā)現(xiàn)MTND4P12通過(guò)充當(dāng)ceRNA來(lái)調(diào)控癌基因異質(zhì)核核糖核蛋白X(PSMD11)的表達(dá)，值得注意的是，PSMD11是新的肝癌生物標(biāo)志物[7]。因此，MTND4P12在HCC中的作用值得探究。為此，本研究收集了本院50例肝細(xì)胞癌組織樣本進(jìn)行驗(yàn)證，研究結(jié)果顯示，MTND4P12在HCC組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為78.00%，明顯高于癌旁組織組。本研究進(jìn)一步根據(jù)MTND4P12蛋白的表達(dá)進(jìn)行了二次分組，分為MTND4P12陽(yáng)性組和MTND4P12陰性組，對(duì)比兩組的臨床病理參數(shù)。結(jié)果顯示，在MTND4P12陽(yáng)性組中，31例(79.49%)合并肝轉(zhuǎn)移，且患者的TNM分期多為Ⅳ期患者，占84.62%，與MTND4P12陰性組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，MTND4P12可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展。

為了進(jìn)一步研究MTND4P12在HCC中的作用，在HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-MTND4P12或MTND4P12過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染si-MTND4P12后，MTND4P12的表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)MTND4P12后，MTND4P12的表達(dá)顯著升高。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，沉默MTND4P12后，SMMC-7721細(xì)胞活力下降。MTND4P12敲低和過(guò)表達(dá)抑制或促進(jìn)了HCC細(xì)胞的傷口愈合能力和遷移能力。相比之下，本研究在其親本細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了MTND4P12過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞增殖能力上升，遷移能力增強(qiáng)，傷口愈合能力增強(qiáng)。提示，MTND4P12在調(diào)控HCC細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

近年來(lái)，PSMD11的致癌作用吸引了大量研究。PSMD11屬于PTP蛋白家族[8]，且PSMD11是蛋白酶體復(fù)合物的關(guān)鍵成分，參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解[9]。微粒是細(xì)胞外囊泡的類(lèi)型，它們是從細(xì)胞釋放到細(xì)胞外空間，可以作為載體傳遞供體細(xì)胞信息[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，微粒中PSMD11 的增加會(huì)導(dǎo)致生存結(jié)局變差，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究中觀察到的 PSMD11水平升高。PSMD11 過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致在非整倍體中，可能導(dǎo)致癌癥開(kāi)始或進(jìn)展[12]。PSMD11也是通過(guò)調(diào)節(jié)參與促進(jìn)細(xì)胞周期周期相關(guān)靶點(diǎn)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存[13]。大量研究證實(shí)，PSMD11促增殖作用已經(jīng)在癌癥中證實(shí)，包括膀胱癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌等[14-18]。這些發(fā)現(xiàn)表明 PSMD11抑制劑可能具有抑制癌癥的治療作用。目前，PSMD11抑制劑已經(jīng)開(kāi)始被評(píng)估為在癌癥臨床管理中的潛力藥物，假基因MTND4P12調(diào)控PSMD11的表達(dá)。本研究課題MTND4P12作為ceRNA上調(diào)癌基因PSMD11的表達(dá)。PSMD11抑制劑和MTND4P12抑制劑對(duì)HCC細(xì)胞可能具有協(xié)同治療作用，因此為HCC治療提供新的策略。

總的來(lái)說(shuō)，本研究表明，假基因 MTND4P12可以調(diào)節(jié)HCC中的ceRNA機(jī)制通過(guò)上調(diào)癌基因 PSMD11。MTND4P12可能是一個(gè)HCC患者的新型轉(zhuǎn)移和預(yù)后生物標(biāo)志物。但本研究患者數(shù)量有限，有必要基于大樣本調(diào)查進(jìn)一步確定 MTND4P12 是否可以作HCC患者OS的預(yù)測(cè)因子。同時(shí)在未來(lái)，課題組將在體內(nèi)和體外進(jìn)行MTND4P12和PSMD11的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究其在HCC中的作用，以通過(guò)更積極的治療改善提高患者的生存率。