朱萍，浦春，胡蝶，張艷珍，張博超，楊藝凡，吳欣怡，陳銀銀，路勇，張秦

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001；2. 皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，男性和女性癌癥相關(guān)死亡率較高[1]。引起CRC的危險(xiǎn)因素有很多，包括病毒和細(xì)菌感染、酒精、煙草、煙霧、衰老、潰瘍性結(jié)腸炎以及基因突變[2]。癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是包括CRC在內(nèi)多數(shù)惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，也是患者治療失敗和致死的主要因素[3]。由于CRC早期癥狀隱匿以及早期發(fā)現(xiàn)和篩查的局限性，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)治療或放化療效果欠佳，預(yù)后不良[4]。因此在外周血中尋找一個(gè)高靈敏度及特異度的新型腫瘤標(biāo)志物對(duì)于CRC的早期篩查診斷具有重要的臨床意義。信號(hào)蛋白是一種可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能，同時(shí)能介導(dǎo)癌癥的許多特征，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成、逃逸等的蛋白家族[5]。腦信號(hào)蛋白4C(semaphorin 4C，Sema4C)是信號(hào)蛋白家庭成員之一，最初是作為參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和軸突導(dǎo)向的分子被發(fā)現(xiàn)。目前越來(lái)越多的研究證明，該分子不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著有重要作用，在腫瘤中同樣起著至關(guān)重要的作用。有研究證明其是治療浸潤(rùn)性乳腺癌[6]、肝細(xì)胞性肝癌[7]和宮頸癌[8]的潛在靶點(diǎn)。然而，有關(guān)血清中Sema4C水平在CRC患者中的研究較少。本研究通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析Sema4C在CRC組織及正常組織中的表達(dá)水平，通過(guò)觀察CRC患者血清Sema4C表達(dá)情況，分析血清Sema4C水平與CRC患者臨床病理特征間的關(guān)系，探討其診斷CRC的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年12月—2021年4月在皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行治療的38例CRC患者血清為CRC組，同時(shí)收集37例健康體檢者的血清作為對(duì)照組，血清立即保存至-80 ℃。CRC組年齡≥60歲患者33例，<60歲5例；男性23例，女性15例；腫瘤最大徑≥3 cm 33例，<3 cm 5例；直腸腺癌21例，結(jié)腸腺癌17例；有神經(jīng)侵襲11例，無(wú)神經(jīng)侵襲27例；有脈管侵襲7例，無(wú)脈管侵襲31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；T1+T2的6例，T3+T4的32例。對(duì)照組年齡≥60歲患者4例，<60歲33例；男性23例，女性14例；CRC組和對(duì)照組性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CRC的診斷以病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫制劑等抗癌治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集CRC患者及健康體檢者空腹靜脈血5 mL(CRC患者于手術(shù)前采集，體檢健康者于體檢時(shí)采集)，置于含促凝膠劑的真空采血管中，室溫下靜置，1000 r/min離心15 min，取上清液置于EP管中，-80°冰箱保存。

1.2.2血清Sema4C水平檢測(cè) 應(yīng)用Sema4C ELISA試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司]。檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，空白孔不加。將100 μL的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)試劑加入標(biāo)準(zhǔn)孔和除空白孔外的樣品孔中，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴箱孵育60 min。將反應(yīng)板每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)清洗4次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μL終止液，15 min內(nèi)，應(yīng)用酶標(biāo)分析儀(美國(guó)Bio-rad公司)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量樣本吸光度。以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣本吸光度值代入方程，計(jì)算出樣本的濃度。

1.2.3臨床資料收集 記錄收集CRC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位、神經(jīng)及脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T分期等臨床病理資料，分析血清Sema4C水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，計(jì)量資料采用M(P25～P75)，兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；繪制ROC曲線，評(píng)估血清Sema4C水平對(duì)CRC的診斷效能；以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Sema4C在CRC患者中高表達(dá) 本研究通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)41例正常者和286例CRC患者進(jìn)行Sema4C表達(dá)水平分析，發(fā)現(xiàn)Sema4C在CRC中的表達(dá)水平顯著升高(P< 0.05)，見圖1。

圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中Sema4C在CRC患者及正常者中的表達(dá)水平

2.2CRC組與健康體檢組血清Sema4c水平比較 應(yīng)用Sema4C ELISA試劑盒檢測(cè)CRC組與健康體檢組血清，結(jié)果顯示CRC組血清Sema4C水平[1.510(0.814～3.452) ng/mL]高于健康體檢組[0.993(0.677～1.995) ng/mL]血清Sema4C水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.194，P<0.05)。提示Sema4C的高水平表達(dá)可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。

2.3CRC患者血清Sema4C與臨床病理特征之間的關(guān)系 將血清Sema4C水平相對(duì)表達(dá)水平與CRC患者性別、年齡、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深部轉(zhuǎn)移狀態(tài)、有無(wú)神經(jīng)侵犯、有無(wú)脈管侵犯等臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清Sema4C相對(duì)表達(dá)水平在腫瘤最大徑、有無(wú)神經(jīng)侵犯、T分期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在不同年齡、性別、腫瘤部位、有無(wú)脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示血清Sema4C水平與CRC的腫瘤大小、T分期及神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)。見表1。

表1 CRC患者血清Sema4C水平與臨床病理特征之間的關(guān)系 單位：ng/mL

2.4血清Sema4C水平對(duì)CRC診斷效能 繪制ROC曲線評(píng)估Sema4C對(duì)CRC的診斷效能，結(jié)果表明Sema4C的ROC曲線下面積(AUC)為0.674(95%CI：0.523～0.771)(P=0.028)，當(dāng)最佳截?cái)嘀禐?.257時(shí)，其診斷CRC的靈敏度為60.50%，特異度為70.30%。見圖2。

圖2 血清Sema4C水平對(duì)CRC診斷價(jià)值的ROC曲線圖

3 討論

Semaphorins家族蛋白(Sema家族)是一大類具有保守Sema結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白，構(gòu)成了膜結(jié)合和分泌蛋白的大家族，最初是作為調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育，影響軸突的分支和突觸形成被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)被證明是許多生物過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括血管發(fā)育和癌癥。該家族共有二十幾個(gè)成員，根據(jù)結(jié)構(gòu)和生物起源不同，這些分子被分為8個(gè)亞家族(Ⅰ～Ⅷ)[9]。Semas通過(guò)與兩個(gè)主要受體家族，神經(jīng)吡啶和神經(jīng)叢素家族的受體結(jié)合來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。這些與原代信號(hào)蛋白形成復(fù)合物的受體也經(jīng)常參與其他信號(hào)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。最近的證據(jù)表明，信號(hào)蛋白在多種癌癥的病因中也起著重要作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些信號(hào)蛋白可以作為真正的腫瘤抑制因子，并通過(guò)各種機(jī)制抑制腫瘤進(jìn)展，而其他信號(hào)蛋白則作為腫瘤進(jìn)展的誘導(dǎo)劑和啟動(dòng)子，具體取決于特定的翻譯后修飾[10]。已有的文獻(xiàn)提出腫瘤相關(guān)炎性細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)在調(diào)節(jié)癌癥血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有關(guān)鍵作用，在這些細(xì)胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)從抗腫瘤M1極化到M2替代激活表型的轉(zhuǎn)變可以誘導(dǎo)腫瘤血管生成并支持腫瘤進(jìn)展，Semas通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并調(diào)節(jié)TAM的功能，有助于調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。例如，Sema3B被認(rèn)為是潛在的腫瘤抑制因子，在許多癌癥中具有下調(diào)作用，但它可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞中IL-8的產(chǎn)生，有助于TAMs的募集，從而維持腫瘤血管生成和進(jìn)展及促進(jìn)轉(zhuǎn)移形成[11-12]。

GU C H[12]提出Sema3A在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并通過(guò)抑制整合素功能以自分泌方式調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管重塑。此外，有研究表明，小鼠Sema3A的遺傳缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的腎臟血管模式缺陷，進(jìn)一步支持Sema3A在血管生成重塑中的作用。而Sema4D其在多種腫瘤中的表達(dá)水平均較高，Sema4D可以通過(guò)結(jié)合PlexinB2刺激腫瘤內(nèi)血管新生。同時(shí)Sema4D與Plexin-B1的結(jié)合也增強(qiáng)了Met磷酸化反過(guò)來(lái)進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，加劇腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，已被描述為血管生成的啟動(dòng)子和腫瘤進(jìn)展的啟動(dòng)子。因此，這種信號(hào)蛋白被認(rèn)為是開發(fā)新型癌癥治療藥物的靶標(biāo)[13]。而Sema4C與Sema4D結(jié)構(gòu)同源性較高，功能相似。人Sema4C已被報(bào)道其在多種腫瘤中異常表達(dá)，并通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和凋亡過(guò)程從而影響腫瘤的發(fā)生進(jìn)展[5]。HUANG S Y等[14]通過(guò)對(duì)收集的74例上皮性卵巢癌、20例卵巢上皮良性腫瘤、20例卵巢邊緣上皮腫瘤和15例正常卵巢組織進(jìn)行檢測(cè)并將Sema4C表達(dá)與患者臨床病理特征做相關(guān)性分析，分析結(jié)果顯示Sema4C mRNA在所有癌癥組織中均有高表達(dá)，其表達(dá)水平與組織學(xué)類型無(wú)關(guān)，但Sema4C蛋白在上皮性卵巢癌中高度表達(dá)。并且Sema4C mRNA在上皮性卵巢癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期及腹水相關(guān)，而Sema4C蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌的分化和臨床分期有關(guān)，但與組織學(xué)類型、腹水和年齡無(wú)關(guān)。Sema4C還被證明在肝癌中上調(diào)，并調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移[15]。此外，有研究報(bào)道Sema4C在CRC組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)情況與CRC患者的病理分期和腫瘤轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性，高Sema4C蛋白表達(dá)的CRC患者也表現(xiàn)出較差的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期，提示高Sema4C表達(dá)可預(yù)測(cè)CRC患者的預(yù)后不良。該報(bào)道還指出Sema4C不僅可以通過(guò)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而降低了細(xì)胞之間的黏附力，抑制細(xì)胞極性并增加腫瘤細(xì)胞的遷移能力，并且Sema4C表達(dá)與Sema4C基因中5’-UTR區(qū)域的甲基化呈負(fù)相關(guān)，而DNA甲基化等表觀遺傳變化在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和CRC發(fā)展中起關(guān)鍵作用，異常的DNA甲基化可以通過(guò)滅活腫瘤抑制基因或激活癌基因來(lái)促進(jìn)CRC進(jìn)展[16]。WANG Y等[17]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清Sema4C水平顯著高于良性乳腺癌患者和正常人員，且術(shù)后血清Sema4C水平顯著低于治療前水平。提示血清Sema4C水平可作為乳腺癌診斷特異性的生物標(biāo)志物。

理想的血清學(xué)蛋白生物標(biāo)志物應(yīng)至少滿足2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。首先，它應(yīng)該是一種分泌的蛋白質(zhì)，可以很容易地在血清中檢測(cè)到。其次，它應(yīng)該在癌癥中特異性過(guò)表達(dá)，而不是在正常組織或良性病變中。最近的研究結(jié)果表明，Sema4C符合以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：它是一種分泌蛋白，在腫瘤中特異性過(guò)表達(dá)，在正常成人組織中幾乎檢測(cè)不到[17]。但關(guān)于血清中Sema4C的表達(dá)卻少有人研究，本研究通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)41例正常者和286例CRC患者進(jìn)行Sema4C表達(dá)水平分析，發(fā)現(xiàn)Sema4C在CRC中的表達(dá)水平顯著升高。為了探究CRC與正常體檢人員血清中Sema4C水平的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)收集了CRC患者及健康體檢者的血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在CRC患者中Sema4C的表達(dá)水平顯著高于健康體檢者。同時(shí)本研究收集了CRC患者的病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，腫瘤最大直徑≥3 cm者血清Sema4C水平高于腫瘤最大直徑<3 cm者，CRCT3+T4者血清Sema4C水平高于T1+T2者，有神經(jīng)侵犯者血清Sema4C水平高于無(wú)神經(jīng)侵犯者，提升Sema4C可能參與CRC的發(fā)展過(guò)程，與CRC的腫瘤大小、T分期及神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)。有可能是由于Sema4C在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和免疫細(xì)胞遷移中起重要作用[17-18]。研究結(jié)果顯示，Sema4C在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)并且Sema4C可以特異性地與Plexin-B2結(jié)合，Plexin-B2受體在神經(jīng)管閉合和小腦顆粒細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵作用，有研究報(bào)道Sema4C可能作為顆粒細(xì)胞到顆粒細(xì)胞的旁分泌因子，其和Plexin-B2結(jié)合后可以促進(jìn)小腦顆粒細(xì)胞前體的遷移，并且當(dāng)敲低Sema4C或抑制其受體Plexin-B2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞G2/M相變損傷、細(xì)胞分裂缺陷、生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞衰老，同時(shí)Plexin-B2也會(huì)損害Sema4C控制的小腦發(fā)育[18，20]。但Sema4C如何調(diào)節(jié)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)仍不清楚。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，血清Sema4C診斷CRC的AUC為0.674，當(dāng)最佳截?cái)嘀等?.2570時(shí)，其診斷CRC的靈敏度為60.50%，特異度為70.30%。

盡管本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CRC患者血清Sema4C蛋白水平高于腸道非腫瘤，血清Sema4C蛋白水平升高提示有發(fā)生深部轉(zhuǎn)移及神經(jīng)浸潤(rùn)的可能，其對(duì)CRC的診斷具有一定的價(jià)值。但將血清Sema4C蛋白水平作為CRC早期診斷的生物標(biāo)志物仍然需要進(jìn)行大樣本深入研究，因?yàn)橹挥写髽颖玖康那罢靶匝芯坎拍苓M(jìn)一步闡明血清Sema4C作為CRC新型診斷生物標(biāo)志物的臨床價(jià)值。其次，血清Sema4C的ROC曲線下面積值較小，造成這一現(xiàn)象的原因可能與CRC的異質(zhì)性、樣本量的差異以及血細(xì)胞溶血等原因有關(guān)。因此，仍需要進(jìn)行大規(guī)模多中心臨床研究進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)證其有效性。