陰若誠，李高陽，陳睿喆，方婉晴，苗萌萌，吳艷紅

(1. 皖南醫(yī)學院醫(yī)學影像學院，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，安徽 蕪湖 241002；3. 皖南醫(yī)學院醫(yī)學微生物學與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002)

克羅恩病(crohn’s disease， CD)是一種慢性肉芽腫性腸道炎癥性疾病(inflammatory bowel disease， IBD)，多見于回腸末端和鄰近結腸，口腔至肛門各段消化道均可受累，呈節(jié)段性分布；以腹痛、腹瀉、體重下降為主要臨床表現(xiàn)。CD患者病情常反復發(fā)作，遷延不愈，嚴重影響生活質量。患者多為青壯年，發(fā)病高峰年齡為18～35歲，男女患病率相近[1]。CD的發(fā)病機制目前尚不明確，可能是遺傳易感性、環(huán)境因素、腸道菌群共同作用結果，最終導致異常的黏膜免疫反應[2]。如有研究報道[3]，細胞因子IL-12/23誘導的免疫細胞異常發(fā)育與CD的發(fā)病密切相關。現(xiàn)常用于治療CD的藥物有水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑及生物制劑等，主要的作用是抑制炎癥、調節(jié)免疫。但這些藥物副作用較大且療效不明顯，生物制劑等昂貴的醫(yī)藥費用給患者帶來很大的經濟負擔[4]。CD在中醫(yī)學中尚無某一病名與其完全相應，但古代醫(yī)籍中的“腹痛”、“泄瀉”、“積聚”、“便血”、“腸癰”等病與其癥狀類似，近現(xiàn)代中醫(yī)大家亦將其歸屬于這幾種病證。中醫(yī)學認為本病發(fā)病與感受外邪、飲食勞倦、情志內傷、脾胃虛弱等因素密切相關，且應用辨證論治在治療方面的確取得很大成效[5-6]。炎癥因子水平的降低是臨床上腸道炎癥緩解的重要參考指標之一[7]，利用中藥治療CD的研究也發(fā)現(xiàn)治療后有多種炎癥因子水平的降低，如胡志鵬[8]利用透膿散復方水煎液通過抑制NF-κB通路使TNBS誘導的CD小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-β和IL-17水平明顯降低，炎癥反應得以緩解；張海洋等[9]利用傳統(tǒng)重要四君子湯對CD患者進行治療，觀察發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α和MCP-1均顯著降低，疾病癥狀得到緩解；張萌等[10]利用參苓白術散合附子理中丸聯(lián)合西藥治療CD患者，也發(fā)現(xiàn)炎癥反應減輕。以上研究均表明傳統(tǒng)中藥在CD治療中具有顯著作用，繼續(xù)找尋新的中藥治療CD，將為其臨床應用奠定基礎。

白花蛇舌草是茜草科草本植物，全草入藥，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛、抗菌消炎和抗腫瘤等功效，可用于治療惡性腫瘤、胃腸炎、闌尾炎、泌尿系統(tǒng)感染等[11]。已有研究報道其應用于治療IBD中的潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，如張振芳等[12]利用白花蛇舌草提取物治療葡聚糖硫酸鈉誘導的慢性UC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)治療組IL-6 和TNF-α 水平顯著降低，腸炎癥狀減輕。 TNBS灌腸是誘導大小鼠CD的常用模型，因此本課題組用其研究白花蛇舌草治療CD模型小鼠的療效，并從炎癥因子角度探究白花蛇舌草用于治療CD的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物和試劑 6～7周齡ICR雌性小鼠購買自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，飼養(yǎng)于22～25 ℃溫度、50%～70%濕度的清潔動物房。5%的TNBS水溶液購自上海吉至生化科技有限公司，白花蛇舌草配方顆粒購買自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，糞便潛血檢測試劑盒和髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Trizol試劑購自美國Life Technologies公司，流式抗體購自美國BioLegend公司，固定破膜試劑盒購自美國BD公司，逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑均購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1造模 將小鼠禁食過夜，稱重后，按70 μL/10 g體重，腹腔注射5%水合氯醛麻醉。按文獻報道，待小鼠麻醉后將一連有注射器的直徑1.5 mm的導管從小鼠肛門插入約4 cm[13]，緩緩注入5%TNBS水溶液和無水乙醇1∶1的混合液[14]，并保持小鼠倒垂姿勢1 min[15]。每周進行1次TNBS乙醇溶液灌腸，連續(xù)灌腸4周。對照組小鼠同樣麻醉后灌腸注入等體積生理鹽水。

1.2.2白花蛇舌草治療方案 白花蛇舌草配方顆粒用滅菌蒸餾水溶解，第1次TNBS乙醇溶液灌腸后第2天開始每天灌胃200 μL白花蛇舌草水溶液(生藥量10 g/kg體重)[12]，直至試驗結束，TNBS組和對照組灌胃等體積滅菌蒸餾水。

1.2.3小鼠體重、糞便狀況及便血情況 記錄小鼠體重、糞便狀況、便血情況，并進行DAI評分參考文獻計算腸炎疾病活動指數(shù)(DAI)[16]，小鼠體重根據(jù)變化賦分：沒有減輕為0分；體重減輕1%～5%為1分；體重減輕5%～10%為2分；體重減輕10%～20%為3分；體重減輕超過20%為4分。糞便根據(jù)性狀賦分：正常糞便為0分；糞便較軟為1分；糞便濕軟為2分；半稀便為3分；稀便為4分。便血情況賦分：無便血為0分；呈陽性為2分；純便血為4分。DAI=(體重分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3，DAI從0(健康)到4(最嚴重的結腸炎癥狀)分布。

1.2.4結腸長度的測量 治療結束后頸椎脫臼法處死小鼠，分離小鼠盲腸末端到肛門段腸組織，量取肛門直腸端至結腸盲腸交匯處的長度，并拍照記錄。

1.2.5結腸組織HE和AB-PAS染色 將結腸組織用4%甲醛固定過夜，常規(guī)進行組織脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)和阿利新蘭-過碘酸雪夫氏(AB-PAS)糖原染色，光學顯微鏡下觀察切片，并拍照記錄。

1.2.6結腸組織髓過氧化物酶活性檢測 稱量組織后制備成5%組織勻漿液，按照MPO檢測試劑盒說明書依次加入反應試劑，顯色后在OD 460 nm下檢測吸光度，并計算每克組織的MPO酶活力單位。

1.2.7流式細胞術檢測IL-17+細胞和IFN-γ+比例 無菌分離對照組、TNBS組和白花蛇舌草組的小鼠腸系膜淋巴結，200目濾網(wǎng)上研磨獲得單細胞懸液，500 g離心獲得細胞沉淀，1640完全培養(yǎng)基調整細胞濃度為2×106/mL。每1 mL細胞懸液中加入佛波酯(終濃度80 nM)和離子霉素(終濃度1 μg/mL)(Biolegend)及細胞因子阻斷劑布雷非德菌素A(1μg/mL)(BD)，細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h。500 g離心收集細胞沉淀，100 μL細胞染色液重懸細胞，加入熒光素FITC標記的CD4單抗(Biolegend)，4 ℃孵育20 min后離心洗滌，按照固定破膜試劑盒(BD)說明書步驟進行固定破膜，然后加入熒光素PE標記的IL-17單抗和熒光素APC標記的IFN-γ單抗(Biolegend)，4 ℃孵育40 min后離心洗滌，上機檢測IL-17+細胞和IFN-γ+細胞比例。

1.2.8定量PCR 稱取約100 mg小鼠結腸組織加入1 mL TRIzol進行勻漿研磨，按照試劑盒步驟說明提取組織RNA。將提取的RNA進行逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行定量PCR：每個PCR反應體系內容如下：2×Taq Master Mix 10 μL，上下游引物(引物序列見表1)各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL，一共為20 μL體系，每個樣本均設復孔。PCR反應條件為：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，45個循環(huán)。反應結束后用LightCycler○R96 SW 1.1進行擴增曲線和溶解曲線的分析，2-△△Ct法計算基因的相對表達水平。

表1 定量PCR引物列表

2 結果

2.1白花蛇舌草灌胃恢復TNBS誘導的CD小鼠的結腸長度和改善病理損傷情況 經過4周每周1次的TNBS乙醇溶液灌腸，TNBS組和白花蛇舌草組的小鼠體重、糞便狀況、便血情況均受到影響，比較各組DAI指數(shù)有顯著差異(F=4.563，P=0.043)，其中TNBS組與對照組相比，DAI評分顯著升高(P<0.05)，白花蛇舌草灌胃后有所降低，但并不顯著(圖1A)。進一步檢測結腸長度，各組結腸長度顯著不同(F=11.860，P=0.001)，TNBS組小鼠的結腸長度明顯縮短(P<0.01)，白花蛇舌草灌胃后，結腸長度相比TNBS組有所恢復(P<0.01)(見圖1B、見圖1C)。進一步對小鼠結腸組織進行病理檢測，HE染色結果顯示對照組小鼠結腸的腸壁結構完整，腺體排列整齊規(guī)律，未見明顯炎性細胞浸潤(見圖1D左邊)，AB-PAS染色結果顯示腺體分泌大量黏蛋白，分泌功能良好(見圖1E左邊)；TNBS組的小鼠結腸組織的腸壁和腺體結構不規(guī)則，有炎性細胞浸潤(見圖1D中間)，腺體分泌的黏蛋白減少(見圖1E中間)；白花蛇舌草組的小鼠結腸組織病變情況相比TNBS組有所減輕，腸壁和腺體結構基本完整規(guī)則，但與對照組相比有一定萎縮，有少量炎性細胞浸潤(見圖1D右邊)，腺體分泌的黏蛋白分泌也增多(見圖1E右邊)。這些結果說明白花蛇舌草可以部分緩解TNBS對結腸組織結構和功能的損害，抑制炎性細胞浸潤。

A：DAI評分的統(tǒng)計分析；B：分離出的結直腸照片；C：結直腸長度的統(tǒng)計分析；D：結直腸組織HE染色(200×)；E：結直腸組織AB-PAS糖原染色(200×)。*P<0.05，**P<0.01。

2.2白花蛇舌草灌胃促進TNBS誘導的CD小鼠結腸組織IL-10表達 檢測結腸組織細胞因子mRNA表達水平，各組IL-17的表達水平未見明顯差異(見圖2A)，IL-12 p40亞基(F=3.932，P=0.037)、IL-12 p35亞基(F=19.800，P<0.001)和IL-10(F=3.535，P=0.049)的表達有顯著差異。其中IL-12的表達在白花蛇舌草組是升高的(P<0.05)，白花蛇舌草灌胃不能降低IL-12表達(見圖2B、圖2C)。另一方面免疫抑制因子IL-10的表達水平在白花蛇舌草組也顯著升高，高于對照組(P<0.05)，但與TNBS組相比，升高不顯著(見圖2D)。

A：IL-17 mRNA相對表達水平；B：IL-12 p40 mRNA相對表達水平；C：IL-12 p35 mRNA相對表達水平；D：IL-10 mRNA相對表達水平。*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

2.3白花蛇舌草灌胃后單核細胞群IL-17表達減少 本課題組檢測了結腸組織MPO活性，但未發(fā)現(xiàn)各組間差異有統(tǒng)計學意義，見圖3A。本研究同時檢測了淋巴結中表達IFN-γ和IL-17的細胞比例(即IFN-γ+和IL-17+細胞比例)，發(fā)現(xiàn)各組淋巴結中IFN-γ+細胞比例約為5%(見圖3B)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；對細胞分群分析，也未發(fā)現(xiàn)各組淋巴細胞群或單核細胞群中IFN-γ+細胞比例有明顯差異(結果未顯示)。IL-17+細胞的比例在各組間也未發(fā)現(xiàn)顯著差異(見圖3C)，但進一步對細胞分群分析，發(fā)現(xiàn)在淋巴細胞群IL-17+細胞比例低且各組間沒有差異(結果未顯示)，而在單核細胞群，IL-17+細胞比例高，各組差異有統(tǒng)計學意義(F=16.260，P=0.002)，且白花蛇舌草組IL-17+細胞比例相比TNBS組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖3D、圖3E)。

A：結腸組織MPO活性檢測的統(tǒng)計圖；B：流式細胞術檢測淋巴結中IFN-γ+細胞比例的數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖；C：流式檢測淋巴結中IL-17+細胞比例的數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖；流式檢測單核細胞群IL-17+細胞比例的代表流式圖D和數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖E。

3 討論

本研究對TNBS誘導的CD模型小鼠進行白花蛇舌草水煎液灌胃治療，通過檢測小鼠結腸長度、DAI評分情況、組織病理以及結腸相關組織炎癥因子表達等情況來探究白花蛇舌草對TNBS誘導的CD模型小鼠的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草治療未能顯著降低腸炎疾病的DAI評分，但能部分恢復TNBS誘導的CD模型小鼠的結腸長度和改善其結腸組織病理損傷情況。TNBS這種半抗原通過結合結腸組織相關蛋白誘導IL-12介導的Th1型透壁性結腸炎，類似人的CD[15]；另外已有文獻報道IL-17在TNBS誘導的腸炎模型中表達升高而IL-10表達降低[17]。本研究檢測腸道組織中這幾種細胞因子的表達，發(fā)現(xiàn)結腸組織IL-12的兩個亞基p40和p35在TNBS組和白花蛇舌草組表達升高；白花蛇舌草治療未能降低炎癥因子IL-12的表達，但有促進抑炎因子IL-10表達的趨勢，而IL-10信號通路受損是腸道炎癥發(fā)生的關鍵[18]。雖然結腸組織IL-17的mRNA水平在三組間未見顯著差異，但腸系膜淋巴結中表達IL-17的單核細胞是顯著降低的，作為抗原提呈細胞所在群，其IL-17表達的降低，有利于減少炎癥性Th細胞的產生。所以白花蛇舌草可能通過降低單核細胞IL-17的表達來緩解腸道炎癥損傷。

白花蛇舌草治療腸炎的療效已有研究報道，如張振芳等[12]在葡聚糖硫酸鈉誘導的UC小鼠模型中的研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草乙醇提取物可能是通過降低了促炎因子IL-6和TNF-α的表達，進而治療炎癥性腸病、抑制腸組織異常增生。本研究則是在TNBS誘導的CD模型小鼠中進行白花蛇舌草療效的研究，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草通過可能通過抑制單核細胞炎癥因子IL-17的表達，起到緩解結腸炎癥的作用。

目前對白花蛇舌草的抗炎機制還缺少研究，例如白花蛇舌草是否通過調控NF-κB這一經典炎癥因子信號通路來調節(jié)炎癥因子的表達，還是通過其它信號通路起作用，尚需進一步研究揭示。綜上所述， 白花蛇舌草對小鼠CD型的慢性腸道炎癥有緩解作用， 可能通過抑制單核細胞促炎因子IL-17的表達來發(fā)揮抗炎效應， 改善結腸組織病理損傷， 促進腸黏膜修復。